具体实施方式
以下通过结合附图、序列表及实施例对本发明作进一步说明。
实施例1建立稳定的大鼠海洛因自身给药模型
经典的大鼠海洛因自身给药模型可以很好地模拟临床上吸毒患者的海洛因吸食行为,大鼠经过训练可以产生对海洛因的自我给药,同时训练过程中不断上升的对海洛因的行为反应率和给药量可以反映吸毒患者从初始目标导向性用药到强迫性习惯化用药的行为发展过程。
我们采用如下方法来建立大鼠的自身给药模型:首先,SD大鼠进行颈静脉插管手术,在右颈静脉插入一段PE管,并经背部穿出体外,手术后抗菌和恢复一周以上。随后,大鼠分别在32个自身给药操作笼内进行训练,每次训练前连通大鼠背部的PE管与操作笼内的海洛因注射系统;操作笼内设左右两个鼻触器,其中一个为有效鼻触器,大鼠触鼻一下有效鼻触器将获得一针海洛因注射,同时操作笼内的笼灯亮起(作为一种伴药的线索),计算机记录;另外一个为无效鼻触器,大鼠触鼻一下无效鼻触器没有任何海洛因注射和灯光,仅计算机记录。两次海洛因注射之间有20秒的不应期,期间触鼻有效鼻触器将不会有海洛因注射和灯光,但记录触碰次数,每天的海洛因注射针数限制为50针(防止过量注射死亡)。操作笼采用大型服务器的计算机同时控制,自身给药训练软件为自主编写的OBSM v5.0,训练程序为固定比率的FR1,即大鼠触鼻一次有效鼻触器获得一针海洛因注射。大鼠经过14天,每天4小时的训练后,有效触鼻反应率和注射量均明显上升,大鼠有效鼻触数稳定在40次以上,且最后3天有效鼻触数上下浮动不超过10%,则表明成功建立稳定的海洛因自身给药模型,已符合后续实验的要求。
实施例2过表达载体的构建
本发明通过目的基因过表达和基因敲除两个技术手段,来研究GABRD基因在对海洛因成瘾大鼠复吸行为的影响。目的基因过表达是研究基因功能常用的手段之一,将目的基因通过转染(包括电转染、脂质体转染等)、显微注射或病毒感染等方法将外源基因导入细胞内,从而建立目的基因过表达的稳定细胞系,可广泛应用于生物学研究,而RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。构建GABRD基因过表达病毒质粒,转染293T细胞,建立稳定转染细胞系。首先采用PCR技术扩增目的基因,并将扩增产物插入载体GV467质粒上,并对阳性克隆进行基因测序鉴定。重组质粒包装293T细胞,转染24小时后,用荧光显微镜观察标签GFP绿色荧光蛋白的表达,并用West blotting法测定目的蛋白的表达.结果。成功构建了过表达质粒,获得稳定转染的293T细胞株。
其中过表达载体构建过程如下:
利用限制性内切酶消化获得线性化载体。PCR扩增制备目的基因片段。所用扩增引物在设计时需在其5’端添加同源重组序列,使用该引物扩增目的基因片段,扩增产物5’和3’最末端的序列分别不线性化克隆载体两末端序列完全一致。以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系,进行重组反应,实现线性化载体和目的基因片段的体外环化。重组产物直接进行转化,挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定,对阳性克隆进行测序及结果分析。将正确克隆菌液扩大培养、抽提,获得高纯度质粒,用于后续实验。
1.目的基因及工具载体信息
1.1目的基因:
Symbol:GABRD
Accession:NM-017289
Organism:RAT
CDS Length:1638bp
1.2工具载体:
载体名称:GV467
元件顺序:CMV-betaGlobin-MCS-EGFP-3Flag-SV40 PolyA
克隆位点:BamHI/BamHI
对照编号:CON299
载体图谱如图7所示。
2.载体酶切
根据如下列表,配制50μl酶切体系。按列表顺序依次加入各种试剂,用移液器轻轻吹打混匀,短暂离心,置于37℃1反应3h或过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳,回收目的条带。
GV467载体电泳结果图:(BamHI/BamHI酶切示意,购自上海吉凯基因化学技术有限公司),电泳结构图如图8所示;
1#(泳道1):10kb Marker(条带自上而下依次为:10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)
2#(泳道2):载体酶切产物
3#(泳道3):未酶切载体。
3.GABRD目的基因片段的获取
3.1扩增引物(PCR产物大小:1393bp)
3.2 PCR扩增目的基因片段
配制如下反应体系,轻轻吹打混匀,短暂离心,置于PCR仪中进行反应。
反应体系:
反应条件:
3.3 GABRD目的基因的PCR扩增结果(PCR产物的纯化),如图9所示;
从图9的电泳图说明如下:Marker自上而下依次为:5kb,3kb,2kb,1.5kb,1Kb,750bp,500bp,250bp,100bp;泳道1的条带只有一条,说明提取的效果很好,没有开环和线性DNA的结果。
4.PCR产物与载体进行交换
于冰水浴中配制如下反应体系。用移液器轻轻吹打混匀,短暂离心,避免产生气泡。于37℃反应30min,随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。
反应体系:
#说明:a)阳性对照加入的纯化的PCR产物为GAPDH基因(带有同样的交换臂)
5.转化
将10μL交换反应产物加入到100μL感受态细胞中,轻弹管壁数下混匀,在冰上放置30min;42℃热激90s,冰水浴孵育2min;加入500μL LB培养基,置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上,在恒温培养箱中倒置培养12-16 h。
6.菌落PCR鉴定
6.1鉴定引物
6.2 PCR鉴定
配制如下反应体系,震荡混匀,短暂离心。在超净工作台中,用无菌的枪头挑取单个菌落至20μL鉴定体系中,吹打混匀,置于PCR仪中进行反应。
鉴定反应体系:
PCR反应条件:
6.3鉴定结果
阳性转化子PCR产物大小:886bp,电泳结果图见图10,提取质粒只有一条带,说明提取的效果很好,没有开环和线性DNA的结果。
7.测序
将鉴定出的阳性克隆转化子接种于适量含相应抗生素的LB液体培养基中,37℃培养 12-16h,取适量菌液进行测序。对测序结果的目的基因序列进行比对分析,比对结果如下:
CGTGCTGGTCTGTGTGCTGGCCCATCACTTTGGCAAAGAATTGGGATTCGAACAT CGATTGAATTCGGTACCGGAATTCGGAACTGGAGGTGGAGGTAGTGGAATGGATCCC GCCACCATGGACGTTCTGGGCTGGCTGCTGCTGCCGCTCCTTCTGCTGTGCACGCAGCCGCACCATGGCGCCAGAGCAATGAATGACATTGGGGACTACGTGGGCTCCAACCTG GAGATATCCTGGCTCCCCAACCTGGATGGACTAATGGAGGGCTACGCCCGAAACTTC CGACCAGGCATTGGAGGTCCTCCAGTGAATGTGGCGCTTGCCCTAGAGGTGGCCAGCATTGACCACATCTCAGAAGCAAATATGGAATACACCATGACAGTGTTCCTGCACCAGA GCTGGCGAGACAGCAGGCTGTCCTACAACCATACCAACGAGACCCTGGGCCTGGATAGCCGCTTCGTGGACAAGCTGTGGCTCCCTGACACCTTCATTGTGAATGCCAAGTCTG CCTGGTTCCATGATGTGACCGTGGAAAACAAGCTTATCCGCCTACAGCCCGACGGTGTGATTTTATACAGCATCCGCATCACCTCCACAGTGGCCTGTGACATGGACCTTGCCAA GTACCCCATGGACGAGCAGGAGTGCATGCTGGACCTGGAGAGCTATGGCTACTCTTCTGAGGACATTGTCTATTATTGGTCAGAAAACCAGGAGCAGATCCACGGGCTGGACAG GCTGCAACTGGCCCAGTTCACTATCACCAGTTACCGCTTCACCACGGAGCTGATGAA CTTCAAATCAGCTGGCCAGTTCCCTCGACTCAGCTTACACTTCCAGCTTCGGAGGAACCGGGGTGTCTACATCATCCAGTCTTACATGCCCTCTGTCCTCCTGGTTGCCATGTCCT GGGTCTCCTTCTGGATTAGCCAAGCAGCAGTGCCTGCCAGAGTATCTCTAGGCATCACCACTGTGCTGACAATGACCACACTCATGGTTAGTGCCCGCTCCTCCCTCCCGCGGGCT TCTGCTATCAAGGCTCTGGATGTGTATTTCTGGATCTGCTATGTCTTCGTGTTTGCTGCCCTGGTGGAGTATGCATTTGCCCACTTCAATGCTGACTACAGGAAGAAACGGAAAGC CAAGGTCAAGGTCACGAAGCCAAGGGCAGAGATGGACGTGAGGAACGCCATTGTCCTCTTCTCCCTCTCTGCTGCTGGGGTCAGCCAGGAGTTGGCTATCTCCCGCCGTCAAGG CCGGGTCCCTGGGAACCTCATGGGTTCCTATAGGTCTGTAGAAGTGGAGGCAAAGAAGGAGGGGGGGTCCCGCCCAGGAGGCCCAGGAGGCATCCGTTCCAGACTCAAACCCA TCGATGCAGACACCATCGACATCTATGCCCGCGCTGTGTTCCCGGCAGCCTTTGCAGCAGTCAACATCATCTACTGGGCGGCGTATACCATGGATCCCGCCACCATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGT AAACGGCCACAAG
比对结果说明:测序结果与目标序列完全一致。
8.测序正确的摇菌提质粒(即质粒抽提)
将步骤7中测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中,37℃培养过夜,用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提,抽提合格的质粒进入下游流程。详细操作步骤如下:
①.收集过夜培养的菌液于标记好的5ml离心管,12000rpm,离心2min收菌;
②弃上清,加入250μl细胞重悬液,充分振荡,使菌块悬浮均匀;
③加入250μl细胞裂解液,再加入10μl蛋白酶K,上下颠倒5-6次,轻轻混匀;静置1-2min,致使菌体裂解澄清;
④加入350μl中和液,上下颠倒混匀,使蛋白完全析出,冰浴静置5min;
⑤10000rpm离心10min,弃蛋白,收集上清于另一干净无菌的1.5ml EP管;
⑥12000rpm离心5min,同时准备标记好的回收柱,将上清转移至回收柱中,12000rpm离心1min,弃下层废液;
⑦加入600μl预先配置好的漂洗液,12000rpm离心1min,弃下层废液,重复一次,12000rpm空离2min,进一步除去残留的漂洗液;
⑧在超净台中将回收柱转移至新的1.5ml EP管中,静置10-20min,自然晾干;
⑨往回收柱中加入95μl Nuclease-Free Water,静置2min,12000rpm离心2min,收集样品做好编号,电泳、测定浓度,进行质检。
实施例3质粒转染细胞实验
一、实验概述
培养生长状态良好的目的细胞即293T细胞,质粒转染前一天将293T细胞分入24-well 培养板培养,转染当天按实验设计组别加入质粒进行目的细胞的转染实验。转染24h后荧光显微镜下观察GFP表达情况,荧光率达80%以上,转染48h后待细胞长满培养板收集细胞检测。
二、实验步骤:
①.准备目的细胞
(1)从液氮罐中取出细胞冻存管,迅速放入37℃水浴中,并不时摇动使其尽快解冻;
(2)完全解冻后,1300rpm,离心3min,75%酒精擦拭冻存管消毒后,移至生物安全柜;
(3)吸去冻存液上清,加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞,将细胞悬液接种至含有 3mL完全培养基的6-cm dish中,轻轻晃匀后置于37℃、5%CO2培养箱;
(4)更换一次培养液后再继续培养;
(5)生长90%汇合的细胞进行传代培养。胰酶消化后完全培养基制成细胞悬液分至两个新的6-cm dish中,补足完全培养基至4mL,继续培养。
②目的细胞质粒转染
(1)对数生长期的细胞制成细胞悬液,计数,接种接种于24-well培养板中(细胞数约为2×104,具体根据细胞形态大小而定),37℃、5%CO2培养箱培养至细胞融合度达到约80%;
(2)根据细胞转染预实验和invitrogen lipofectamine 2000转染试剂使用说明书设计,加入适宜量的质粒和转染试剂;
(3)4-6h后观察细胞状态,更换为新鲜的完全培养基,转染24-48h后观察质粒上荧光标记基因的表达情况,荧光率大于80%,拍完荧光后补加500μL正常培养基,待长满后收集细胞用于RNA提取或蛋白质检测;
用荧光显微镜观察标签GFP绿色荧光蛋白的表达:见下图所示成功构建了过表达质粒,获得稳定转染的293T细胞株;如果目的基因携带GFP荧光标签,可以在感染病毒后96h开始在显微镜下观察荧光表达(具体见图11A、11B、11C、11D),图11A为目的基因腺病毒感染293T细胞的荧光照片;图11B为目的基因腺病毒感染293T细胞于普通光源下的细胞图片;图11C为获得稳定转染的293T细胞株的荧光照片;图11D为获得稳定转染的293T细胞株于普通光源下的细胞图片,从图中11C和11D可以看出能获得稳定转染的293T细胞株。
实施例4 GABRD过表达病毒滴度检测
本申请实验中,用质粒作为标准品设立标准曲线,待测样品与标准曲线比较后,得到待测样品的滴度。
4.1扩增曲线,参考图14;
4.11实验步骤
1)每一个样品准备4份90μl水,装在Ep管中。取10uL样品加入到第一份水中,混匀并命名为-1,然后从中取出10μl加入到第二份水中,命名为-2,依次类推。最后得到8 个稀释度的样品,取后5份作为模板进入定量PCR;
2)每个样品取10uL加入到40μl水中,混匀并命名为-2,准备4份90μl水,装在Ep 管中,然后从中取出10μl加入到90μl水中,命名为-3,依次类推。不同在于4个稀释度,取后3个进入定量PCR;
3)测算所需要的反应孔数,每个反应中2X SYBR Green Mix为10μl,上下游引物各0.5μl,Rox参比染料0.2μl,加水补充到15μl。每20个反应多准备一个反应体系,以避免试剂不足。
4)将配好的反应体系加入到96孔反应板中,每孔15μl。每个样品加入5μl,设置复孔。
5)PCR反应按照SYBR Green试剂盒说明进行;
6)得到Ct值数据后,按照标准品浓度的对数值和Ct平均值得到标准曲线。其他样品的浓度可以根据标准曲线算出;
7)待测样品浓度最终值由测定值除以稀释度并乘2得到,此处乘2是因为标准品是双链的,而AAV病毒颗粒是单链的。
8)将不同稀释度病毒测定得到的滴度加以平均,即为病毒的最终浓度。
4.12 Q-PCR原始数据
4.13标准曲线拷贝数
|
Standard-2 |
Standard-3 |
Standard-4 |
Standard-5 |
Standard-6 |
Copies/ml |
2.58E+11 |
2.58E+10 |
2.58E+09 |
2.58E+08 |
2.58E+07 |
|
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|
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|
4.14标准曲线,参考图15;
4.15标准曲线
将目的样品的Ct值代入公式,得到待测样品滴度,并乘以稀释倍数得到原始样品滴度,将四个组的滴度数值加以平均,得到滴度均值,即为样品的最终滴度数据。
实施例5 RNA干扰腺相关病毒载体的构建
5.1材料准备
所需材料为:
2X SYBR Green Master Mixture;
Q-Zfcas9定量PCR引物;
Zfcas9质粒标准品;
DNase/RNase-Free Water;
96孔定量PCR板;
塑料封口贴膜;
DNase/RNase-Free枪头;
Ep管;
通过合成含干扰序列的双链DNA oligo,通过其两端含酶切位点直接连入酶切后RNA 干扰腺相关病毒载体上;将连接好的产物转入制备好的细菌感受态细胞,对长出的单克隆菌落先进行PCR鉴定,PCR鉴定阳性菌落再进行测序鉴定,所鉴定阳性的克隆即为构建成功的目的基因RNA干扰腺相关病毒载体(流程见图12)。
5.2 shRNA腺相关病毒克隆构建部分
siRNA设计:
Target Seq |
GC% |
GGACGTGAGGAACGCCATTGT |
57.14% |
目的载体
载体名称:CV272
元件顺序:hSyn-EGFP-mir30
对照编号:CON400
对照插入序列:无
载体图谱(见图13)
5.3合成oligo信息
表格序列转为文本对应序列如下:
Gabrd-RNAi(74940-2)
CTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGACGTGAGGAACGCCATTGT CTAGTGAAGCCACAGATGTAGACAATGGCGTTCCTCACGTCCTGCCTACTGCCTCGCA ATTG
将上述序列拆分为两条链,酶切位点上游加上保护碱基,引物自身互补扩增后酶切连接,分成两条链分别为:
Gabrd-RNAi(74940)-a:
ACCGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGACGTGAGGAACGCCATTGTCTAGTGAAGCCACAG
Gabrd-RNAi(74940)-b:
ACCGCAATTGCGAGGCAGTAGGCAGGACGTGAGGAACGCCATTGTCTACATCTGTGGCTTCACTAGACAAT
测序结果文件:
Gabrd-RNAi(74940-2):
>PSC74940-2-EGFP-C-F_D05.ab1NNNNNGNNAGNGGNACTCTCGGCATGGACGAG CTGTACAAGTAGCGGCCGCAAGCCTTGTTAAGTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTATGTTGAATGAGGCTTCAGTACTTTACAGAATCGTTGCCTGCACATCTTGGAAACACTT GCTGGGATTACTTCTTCAGGTTAACCCAACAGAAGGCTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGACGTGAGGAACGCCATTGTCTAGTGAAGCCACAGATGTAGACA ATGGCGTTCCTCACGTCCTGCCTACTGCCTCGCAATTCAAGGGGCTACTTTAGGAGCA ATTATCTTGTTTACTAAAACTGAATACCTTGCTATCTCTTTGATACATTTTTACAAAGCTGAATTAAAATGGTATAAATTAAATCACTTTTTTCAATTGGAAGACTAATGCGTTTAAAC ACGCGGCGACGCGAAGCTTTAAACCGGTTATCGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACG CTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGT GGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGAACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAA CTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTATGTTGC CACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCGCGTCTTCGCTTCGC CCTCAGACGAGTCGGATCTCCNTTGGGCCGCCTCCCCCGCGAGCTTTAAATTAGCTGA AGG
Gabrd-RNAi质粒(74940-2):
CTCGAGAAGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCGAGACGTGAGGAACGCCATTGT CTAGTGAAGCCACAGATGTAGACAATGGCGTTCCTCACGTCCTGCCTACTGCCTCGCA ATTG
比对结果说明:测序结果与目标序列完全一致
5.4病毒包装
5.5过表达病毒滴度检测方法:Real-Time PCR(定量PCR法)
具体方法参考实施例4中的GABRD过表达病毒滴度检测
本申请中,用质粒作为标准品设立标准曲线,待测样品与标准曲线比较后,得到待测样品的滴度。
5.51扩增曲线参考图16;
5.52 Q-PCR原始数据
5.53标准曲线拷贝数
|
Standard-3 |
Standard-4 |
Standard-5 |
Standard-6 |
Copies/ml |
2.58E+10 |
2.58E+09 |
2.58E+08 |
2.58E+07 |
5.54标准曲线参考图16;
5.55滴度计算
将目的样品的Ct值代入公式Y=3.289*LOG(X)+38.71,得到待测样品滴度,并乘以稀释倍数得到原始样品滴度,将四个组的滴度数值加以平均,得到滴度均值,即为样品的最终滴度数据。
(注:红色斜线部分为实验误差较大的数据,不参与平均滴度的计算。)
5.56材料准备
2X SYBR Green Master Mixture;
Q-Zfcas9定量PCR引物;
Zfcas9质粒标准品;
DNase/RNase-Free Water;
96孔定量PCR板;
塑料封口贴膜;
DNase/RNase-Free枪头;
Ep管
5.57仪器准备
定量PCR仪
5.58实验步骤
1)每一个样品准备4份90μl水,装在Ep管中。取10uL样品加入到第一份水中,混匀并命名为-1,然后从中取出10μl加入到第二份水中,命名为-2,依次类推。最后得到8 个稀释度的样品,取后5份作为模板进入定量PCR;
2)每个样品取10uL加入到40μl水中,混匀并命名为-2,准备4份90μl水,装在Ep 管中,然后从中取出10μl加入到90μl水中,命名为-3,依次类推。不同在于4个稀释度,取后3个进入定量PCR;
3)测算所需要的反应孔数,每个反应中2X SYBR Green Mix为10μl,上下游引物各0.5μl,Rox参比染料0.2μl,加水补充到15μl。每20个反应多准备一个反应体系,以避免试剂不足。
4)将配好的反应体系加入到96孔反应板中,每孔15μl。每个样品加入5μl,设置复孔。
5)PCR反应按照SYBR Green试剂盒说明进行;
6)得到Ct值数据后,按照标准品浓度的对数值和Ct平均值得到标准曲线。其他样品的浓度可以根据标准曲线算出;
7)待测样品浓度最终值由测定值除以稀释度并乘2得到,此处乘2是因为标准品是双链的,而AAV病毒颗粒是单链的。
8)将不同稀释度病毒测定得到的滴度加以平均,即为病毒的最终浓度。
实施例6海洛因自身给药及消退后复吸大鼠的NAc脑区中GABRD基因mRNA和蛋白水平的变化
首先建立稳定的大鼠海洛因自身给药模型,分别设立海洛因成瘾组(Heroin)和海洛因自身给药后消退14天条件性线索诱导复吸组(Reinstatement),同时设立生理盐水自身给药对照组(Control)。消退训练时,将大鼠放到训练笼中2小时,无线索及灯光等的提示,鼻触均无程序性后果即无海洛因注射。消退成功的标准是达到训练(药物维持)有效鼻触的10%以内。消退完成后进行复吸行为测试:复吸行为测试时,大鼠独立放置于自身给药训练笼中,所处的环境与海洛因训练过程一样,但触碰有效鼻触时记录次数,笼灯亮,注射泵空打,不进行海洛因注射,每次复吸行为测试时间为2h。复吸测试完成后,大鼠立即处死取 NAc脑组织,用RT-PCR和WB方法分别检测各组间NAc脑区GABRD的mRNA和蛋白表达水平,采用方差分析,随后多重比较采用SNK检验分析,结果显示组间mRNA表达存在显著差异(F(2,11)=4.307,p=0.042,见图1),其中成瘾组分别与对照组和复吸组相比, NAc脑区GABRD的mRNA表达均显著升高(p=0.016,p=0.047)。见而海洛因复吸模型大鼠中GABRD的mRNA表达水平较对照正常组大鼠仍有升高趋势,但无显著性差异。 WB检测表明三组间GABRD的蛋白表达存在显著性差异(F(2,3)=12.508,p=0.035),多重比较显示成瘾组分别与对照组及海洛因复吸组相比之间均显著升高(p=0.028,p= 0.019,见图2A和2B)。
实施例7 NAc脑区过表达GABRD基因对海洛因自身给药大鼠消退后复吸行为恢复的影响。
首先,大鼠进行自身给药训练14天成功建立稳定的海洛因自身给药模型,然后,模型大鼠进行消退训练,按照实验要求进行随机分组,分设两个组:GABRD过表达组、阴性病毒对照组。于消退第二天在大鼠NAc脑区分别微注射GABRD过表达和阴性病毒对照的AVV病毒载体。具体微注射过程如下:大鼠经戊巴比妥钠腹腔麻醉后,头顶部备皮,将大鼠固定于脑立体定位仪上,75%酒精消毒,用手术刀做一约3cm的纵向切口,用镊子充分暴露颅骨,棉球止血后确定前囟位置,根据《大鼠脑立体定位图谱》确定注射坐标位置,前囟:+1.6mm,旁开:±1.5mm,深度:-(7.0mm~7.5mm),用签字笔标记,在标记处垂直打孔,用微量进样器抽取已备好的慢病毒溶液,微量进样器连接与微量注射泵,安装于大脑脑立体定位仪上,按照已经确定的坐标进行注射,其中每边在深度7.5mm和 7.0mm各注射一针,两边共4个注射点,每点注射量为1ul,注射速度为:0.5ul/min,每针注射完毕后留针3min,以保证病毒充分注射到该位点。全部注射完毕后缝合皮肤,大腿肌肉注射青霉素(15000U)抗感染至少3天。消退14天后分别进行线索诱导的复吸行为测试以及海洛因引燃的复吸行为测试。统计学分析结果显示,在NAc脑区过表达GABRD能显著减少海洛因引燃的复吸行为的恢复(F(1,14)=8.83,P=0.01,图3B),但NAc脑区过表达 GABRD对线索诱导的海洛因复吸没有影响(F(1,14)=0.083,P=0.77,图3A)。最后,大鼠行为测试后立即处死取NAc脑区组织,组织用于后续WB测试,统计分析结果显示,NAc脑区注射过表达GABRD病毒载体后NAc脑区的GABRD蛋白表达水平较阴性对照组显著升高(p=0.038),见图4A和4B。
实施例8 NAc脑区敲减GABRD基因对海洛因自身给药大鼠消退后复吸行为恢复的影响。
首先,大鼠进行自身给药训练14天成功建立稳定的海洛因自身给药模型,然后,模型大鼠进行消退训练,按照实验要求进行随机分组,分设两个组:GABRD敲减组、阴性病毒对照组。于消退第二天在大鼠NAc脑区分别微注射GABRD敲减和阴性病毒对照的 AVV病毒载体。具体微注射过程如下:大鼠经戊巴比妥钠腹腔麻醉后,头顶部备皮,将大鼠固定于脑立体定位仪上,75%酒精消毒,用手术刀做一约3cm的纵向切口,用镊子充分暴露颅骨,棉球止血后确定前囟位置,根据《大鼠脑立体定位图谱》确定注射坐标位置,前囟:+1.6mm,旁开:±1.5mm,深度:-(7.0mm~7.5mm),用签字笔标记,在标记处垂直打孔,用微量进样器抽取已备好的慢病毒溶液,微量进样器连接与微量注射泵,安装于大脑脑立体定位仪上,按照已经确定的坐标进行注射,其中每边在深度7.5mm和7.0mm 各注射一针,两边共4个注射点,每点注射量为1ul,注射速度为:0.5ul/min,每针注射完毕后留针3min,以保证病毒充分注射到该位点。全部注射完毕后缝合皮肤,大腿肌肉注射青霉素(15000U)抗感染至少3天。消退14天后分别进行线索诱导的复吸行图为测试以及海洛因引燃的复吸行为测试。统计学分析结果显示,在NAc脑区敲减GABRD能显著增强线索诱导的或海洛因引燃的复吸行为的恢复(F(1,16)=4.86,P=0.04;F(1,16)=14.33,P=0.002,图5A和5B)。最后,大鼠行为测试后立即处死取NAc脑区组织,组织用于后续WB测试,统计分析结果显示,NAc脑区注射敲减GABRD病毒载体后NAc脑区的GABRD蛋白表达水平较阴性对照组显著降低(p=0.031),见图6A和6B。
序列表
<110> 宁波市微循环与莨菪类药研究所
<120> GABRD基因在筛选抗海洛因复吸药物中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1558
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgtgctggtc tgtgtgctgg cccatcactt tggcaaagaa ttgggattcg aacatcgatt 60
gaattcggta ccggaattcg gaactggagg tggaggtagt ggaatggatc ccgccaccat 120
ggacgttctg ggctggctgc tgctgccgct ccttctgctg tgcacgcagc cgcaccatgg 180
cgccagagca atgaatgaca ttggggacta cgtgggctcc aacctggaga tatcctggct 240
ccccaacctg gatggactaa tggagggcta cgcccgaaac ttccgaccag gcattggagg 300
tcctccagtg aatgtggcgc ttgccctaga ggtggccagc attgaccaca tctcagaagc 360
aaatatggaa tacaccatga cagtgttcct gcaccagagc tggcgagaca gcaggctgtc 420
ctacaaccat accaacgaga ccctgggcct ggatagccgc ttcgtggaca agctgtggct 480
ccctgacacc ttcattgtga atgccaagtc tgcctggttc catgatgtga ccgtggaaaa 540
caagcttatc cgcctacagc ccgacggtgt gattttatac agcatccgca tcacctccac 600
agtggcctgt gacatggacc ttgccaagta ccccatggac gagcaggagt gcatgctgga 660
cctggagagc tatggctact cttctgagga cattgtctat tattggtcag aaaaccagga 720
gcagatccac gggctggaca ggctgcaact ggcccagttc actatcacca gttaccgctt 780
caccacggag ctgatgaact tcaaatcagc tggccagttc cctcgactca gcttacactt 840
ccagcttcgg aggaaccggg gtgtctacat catccagtct tacatgccct ctgtcctcct 900
ggttgccatg tcctgggtct ccttctggat tagccaagca gcagtgcctg ccagagtatc 960
tctaggcatc accactgtgc tgacaatgac cacactcatg gttagtgccc gctcctccct 1020
cccgcgggct tctgctatca aggctctgga tgtgtatttc tggatctgct atgtcttcgt 1080
gtttgctgcc ctggtggagt atgcatttgc ccacttcaat gctgactaca ggaagaaacg 1140
gaaagccaag gtcaaggtca cgaagccaag ggcagagatg gacgtgagga acgccattgt 1200
cctcttctcc ctctctgctg ctggggtcag ccaggagttg gctatctccc gccgtcaagg 1260
ccgggtccct gggaacctca tgggttccta taggtctgta gaagtggagg caaagaagga 1320
gggggggtcc cgcccaggag gcccaggagg catccgttcc agactcaaac ccatcgatgc 1380
agacaccatc gacatctatg cccgcgctgt gttcccggca gcctttgcag cagtcaacat 1440
catctactgg gcggcgtata ccatggatcc cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct 1500
gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaag 1558
<210> 2
<211> 1085
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
abnnnnngnn agnggnactc tcggcatgga cgagctgtac aagtagcggc cgcaagcctt 60
gttaagtgct cgcttcggca gcacatatac tatgttgaat gaggcttcag tactttacag 120
aatcgttgcc tgcacatctt ggaaacactt gctgggatta cttcttcagg ttaacccaac 180
agaaggctcg agaaggtata ttgctgttga cagtgagcga gacgtgagga acgccattgt 240
ctagtgaagc cacagatgta gacaatggcg ttcctcacgt cctgcctact gcctcgcaat 300
tcaaggggct actttaggag caattatctt gtttactaaa actgaatacc ttgctatctc 360
tttgatacat ttttacaaag ctgaattaaa atggtataaa ttaaatcact tttttcaatt 420
ggaagactaa tgcgtttaaa cacgcggcga cgcgaagctt taaaccggtt atcgataatc 480
aacctctgga ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt 540
ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg 600
ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct ggttgctgtc tctttatgag gagttgtggc 660
ccgttgtcag gcaacgtggc gtggtgtgca ctgtgtttgc tgacgcaacc cccactggtt 720
gggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccggaactt tcgctttccc cctccctatt 780
gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg 840
ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc 900
tatgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat 960
ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcg cgtcttcgct 1020
tcgccctcag acgagtcgga tctccnttgg gccgcctccc ccgcgagctt taaattagct 1080
gaagg 1085
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggacgtgagg aacgccattg t 21