CN108300763A

CN108300763A - 一种筛选miR-101-3P靶基因的方法

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Publication number: CN108300763A
Application number: CN201810193267.5A
Authority: CN
Inventors: 安小鹏; 曹斌云; 宋宇轩; 李广; 马海东
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2018-03-09
Filing date: 2018-03-09
Publication date: 2018-07-20

Abstract

本发明公开了一种筛选miR‑101‑3p靶基因的方法，该方法以山羊基因组DNA序列为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用PTGS2引物在PCR条件下进行扩增PTGS2基因3'UTR区；构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，结果显示，miR‑101‑3P降低了荧光素酶的活性，初步确定PTGS2为miR‑101‑3P的靶基因；采用RT‑qPCR和Western blot方法验证miR‑101‑3P对PTGS2基因在mRNA和蛋白水平表达的影响。结果显示：miR‑101‑3P可以抑制PTGS2基因在mRNA和蛋白水平上的表达，进一步确定miR‑101‑3P可与PTGS23'UTR结合，PTGS2是miR‑101‑3P的目标靶基因。

Description

一种筛选miR-101-3P靶基因的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及分子克隆、RT-qPCR和Western blot检测技术，具体涉一种筛选miR-101-3P靶基因的方法，该方法主要通过构建双荧光素酶报告载体，运用现代分子生物技术探寻并验证miR-101-3P的靶基因。

背景技术

miRNA是一种较短的(21-23个核苷酸)、进化保守的、非编码的RNA分子，具有转录后调控基因表达的功能，首次在秀丽隐杆线虫中被发现，其可通过与靶基因的3'非编码(UTR)结合，抑制mRNA翻译成蛋白。miRNA的调控相当复杂，每种miRNA能通过不同的信号通路调控多个靶基因，而每个靶基因可能同时受到几种miRNA的调节。miRNA作为一种重要的调控因子，广泛存在于动物体内，调控着动物体内大约1/3基因的表达，在哺乳动物生长发育、细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、细胞内环境稳态等生命活动中起到重要的调节作用，研究表明miRNA通过调控靶基因的表达对卵泡颗粒细胞细胞的生长发育和激素分泌功能的调节具有重要作用。

成熟的miRNA结合到RISC之后，通过两种方式发挥其在生物体内的功能：(1)miRNA与靶基因mRNA完全匹配互补配对，降解靶基因，从而抑制基因的表达。在植物体内，几乎全部miRNA都是通过这种方式来抑制基因的表达，这也是动物和植物的miRNA之间重要的区别，并且在植物体内miRNA与靶基因的结合位点不仅仅局限于3'UTR内，靶基因的转录区域也可以进行结合。(2)miRNA通过与靶基因不完全互补配对结合，抑制mRNA在翻译过程中基因的表达，从而使基因不能正常翻译表达形成功能蛋白，以此来达到基因表达调控的目的。这是在动物体内主要的调节方式，当然也存在mRNA与靶基因完全互补配对从而降解靶基因的调节方式。

研究发现，大多数miRNA通过使其靶mRNA的翻译抑制或降解来抑制基因表达。miRNA与靶基因相结合，在细胞凋亡、增殖、代谢、分化、肿瘤转移、发育等多种生物过程中发挥重要的作用。快速准确的鉴定miRNA的靶基因，对于研究miRNA与靶基因之间的相互作用关系和参与的生物过程以及在信号通路中发挥的作用具有很大的研究价值。目前研究miRNA的方法主要有生物信息学方法和生物学试验方法。

动物源miRNA主要通过与靶基因mRNA的3'UTR碱基互补结合，从而调控靶基因的表达，因此动物源miRNA的靶位点主要位于靶基因mRNA的3'UTR，同时这些区域往往包含多个miRNA的多个靶位点，这些靶位点往往具有物种间保守性，且无明显二级结构。目前寻找miRNA靶基因的方法主要有生物信息学以及生物实验方法。生物信息学方法主要是利用已经确定的miRNA序列和它们的靶基因序列相互匹配的规律，根据生物学的几个原则设计具有针对性的软件来进行，如TargetScan、miRanda、RNAhybrid、TargetScanS、PicTar、DIANA-microT、FindTar和RNA22等软件。生物信息学的方法只是通过算法为研究人员提供可能性最大的参考信息，还需要通过实验进行验证。miRNA与靶基因间的相互作用具有一定的规律性。目前常规的算法主要遵循以下几个常用原则：

(1)miRNA与靶基因的互补性；

(2)miRNA靶位点在不同物种之间的保守性；

(3)miRNA-mRNA双链之间的热稳定性；

(4)miRNA靶位点不会有复杂的二级结构；

(5)miRNA的5'端与靶基因的结合能力强于3'端。

除了这些基本原则以外，不同的预测方法还会根据各自总结的规律对算法进行限制和优化。

由于计算预测miRNA靶基因时存在很高的假阳性，因此必须利用生物学实验的方法对预测的靶基因进行验证。最常用的实验方法是采用双荧光素酶系统检测荧光素酶的活性，并利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测靶基因mRNA水平及蛋白水平的变化，从而确定miRNA与靶基因的对应关系，或者利用免疫共沉淀技术筛选miRNA的靶基因。

前列腺素内过氧化物合酶(prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS)，又叫环氧合酶(cyclooxygenase，COX)。PTGS存在于两种异构体，通常被称为PTGS1和PTGS2。两者在结构上60％的同源性，而两者在分布和生理功能上存在很大区别：PTGS1在人体大多数组织中变动范围不大，呈持续性表达，其结构酶活性与胃粘膜的保养，血小板聚集及血管收缩相关。而PTGS2在正常情况下大多数组织中无法检测到，在各种生长因子、细胞因子及癌基因的刺激下，PTGS2的含量明显增加，而PTGS1的含量并无明显的变化。当前研究表明，PTGS2亚家族具有重要而广泛的生理作用，涉及到生殖，细胞周期，癌症，细胞增殖，凋亡等。

发明内容

本发明的目的在于提供利用生物学技术寻找并验证miRNA靶基因的方法，该方法主要采用分子克隆、RT-qPCR和Western blot检测技术验证miR-101-3P与靶基因PTGS2之间的调控关系。结果表明：miR-101-3P可以抑制PTGS2基因在mRNA和蛋白水平上的表达，PTGS2是miR-101-3P的靶基因。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种筛选chi-miR-101-3P靶基因的方法，其特征在于，包括下列步骤：

1)以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用引物PTGS2在PCR条件下进行扩增，确定得到的PCR产物为PTGS2基因3'UTR区的序列；

2)构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，初步鉴定miR-101-3P的靶基因；

3)采用RT-qPCR法检测miR-101-3P对PTGS2基因在mRNA水平的影响；

4)采用Western blot法检测miR-101-3P对PTGS2基因在蛋白水平的影响。

根据本发明，所述的引物PTGS2如下(其中，下划线为XhoI和NotI内切酶的酶切位点)：

上游引物F：5'-CCGCTCGAGTAGTTCCCAGGGAGACAG-3'；

下游引物R：5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGCACATCCAGGGTAATG-3'。

所述的PCR扩增的条件是：

15μL反应体系，包括DNA模板0.5μl，7.5μl MasterMix，引物PTGS2的上游引物F和下游引物R各0.5μl，加灭菌水至15μl；

所述的PCR扩增反应程序如下：

利用引物PTGS2的PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，退火温度为55℃，退火时间30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

进一步地，所述步骤2)构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，初步鉴定miR-101-3P的靶基因的方法是：

分别构建野生型(PTGS2-Wt)及突变型(PTGS2-Mut)报告基因质粒。收集对数生长期的293T细胞，按照脂质体Lipofectamine2000转染说明书分别将miR-101-3P模拟物、miR-101-3P抑制剂、双链阴性对照、单链阴性对照和PTGS2荧光素酶报告载体共转入293T细胞，分为8组：P野生型+miR-101-3P模拟物、野生型+双链阴性对照、野生型+miR-101-3P抑制剂、野生型+单链阴性对照、突变型+miR-101-3P抑制剂、突变型+双链阴性对照、突变型+miR-101-3P抑制剂和突变型+单链阴性对照；

培养36h后，检测不同组别萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的强度，用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶强度的比值计算相对荧光素酶的活性。

步骤3)所述的采用RT-qPCR法检测miR-101-3P对PTGS2基因在mRNA水平的影响的具体方法是：

根据GenBank山羊PTGS2基因(XM_018060731.1)和内参基因β-actin(NM_001314342.1)的mRNA序列，设计PTGS2基因和参基因β-actin的实时定量引物，将双链阴性对照和miR-101-3P模拟物转入卵泡颗粒细胞，培养48h后提取RNA，然后进行反转录得到cDNA，通过实时定量PCR检测PTGS2基因的mRNA相对表达量；

所述的PTGS2实时定量引物如下：

上游引物F：5'-TTGATTGAGAGTCCGCCAAC-3'；

下游引物R：5'-GCAGTCATCAGGCACAGGAG-3'；

所述的内参基因β-actin实时定量引物如下：

上游引物F：5'-GCAAGTTCCACGGCACAG-3'；

下游引物R：5'-GGTTCACGCCCATCACAA-3'；

所述的反转录的条件是：

20μl反应体系：包括10μl的Reaction solution，4μl的5×Prime Script Buffer，Prime Script RT Enzyme Mix I和RT Prime Mix各1μl，加灭菌水至20μl；

所述的反转录程序如下：

37℃孵育15min，85℃孵育5s，4℃保存；

所述的RT-qPCR的条件是：

20μl反应体系：包括12.5μl的Platinum RTS SYBR Super Mix，PTGS2基因和参基因β-actin的上游引物F、下游引物R各1μl，1μl的cDNA模板，加灭菌水至20μl；

所述的利用定量引物PTGS2的RT-qPCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性15s，退火温度为60℃，退火时间20s，72℃延伸20s，共进行35个循环，4℃保存；

步骤4)所述的采用Western blot法检测miR-101-3P对PTGS2基因在蛋白水平的影响的方法为：

将双链阴性对照和miR-101-3P模拟物转入卵泡颗粒细胞细胞，培养48h后收集细胞，利用细胞蛋白裂解液提取总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度。将双链阴性对照和miR-101-3P转染组细胞蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶电泳上的蛋白转到聚偏氟乙烯膜并用对应兔抗PTGS2、鼠抗β-ACTIN及HRP标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗进行孵育，加入ECL发光液反应后进行曝光，拍照，采用Image J图像分析软件对灰度进行量化分析，以β-actin为内参。

本发明的筛选miR-101-3P靶基因的方法，与现有技术相比，具有以下技术效果：

明确了PTGS2 3'UTR区存在与miR-101-3P的结合位点，PTGS2是miR-101-3P的目标靶基因，利用现代分子生物技术验证了miR-101-3P与靶基因PTGS2的靶向调控关系，miR-101-3P可以抑制PTGS2基因在mRNA和蛋白水平上的表达。为进一步研究miR-101-3P对奶山羊卵泡发育和激素分泌功能的影响奠定了基础。为miRNA靶基因的筛选以及确定其与靶基因的调控关系奠定了基础，以便用于研究miRNA对奶山羊卵泡发育和激素分泌功能的调控作用。

附图说明

图1是引物PTGS2扩增PTGS2基因3'UTR区的2％琼脂糖凝胶电泳图，图中M表示：Marker；

图2是双荧光素酶报告载体构建结果，其中：

A：PTGS2-3ˊUTR双酶切凝胶电泳图(目的片段为377bp)；

B：PTGS2-3ˊUTR在psiCHECK-2载体中的插入位置图；

C：miR-101-3P靶位点突变

图3是miR-101-3P对野生型(PTGS2-Wt)及突变型(PTGS2-Mut)载体的荧光素酶活性的影响；

图4是PTGS2基因mRNA表达量；

图5是PTGS2基因蛋白相对表达量，其中，

A：Western Blotting检测结果；

B：PTGS2蛋白相对表达量；

以下通过对山羊样品采集及双荧光素酶报告载体的构建和荧光素酶活性检测，RT-qPCR和Western blotting分析实施来进一步对本发明作详细说明。

具体实施方式

本实施例给出一种筛选miR-101-3P靶基因的方法，具体包括下列步骤：

所述的引物PTGS2如下，其中下划线为XhoI和NotI内切酶的酶切位点；

上游引物F：5'-CCGCTCGAGTAGTTCCCAGGGAGACAG-3'；

下游引物R：5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGCACATCCAGGGTAATG-3'。

所述的PCR扩增的条件是：

15μL反应体系，包括DNA模板0.5μl，7.5μl的MasterMix，引物PTGS2的上游引物F和下游引物R各0.5μl，加灭菌水至15μl；

所述的利用引物PTGS2的PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，退火温度为55℃，退火时间30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。

2)构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，初步鉴定miR-101-3P的靶基因

分别构建野生型(PTGS2-Wt)及突变型(PTGS2-Mut)报告基因质粒；

收集对数生长期的293T细胞，按照脂质体Lipofectamine2000转染说明书分别将miR-101-3P模拟物(mimic)、miR-101-3P抑制剂(inhibitors)、双链阴性对照(Negativecontrol，NC)、单链阴性对照(NCH)和PTGS2荧光素酶报告载体共转入293T细胞，分为8组：野生型(PTGS2-Wt)+miR-101-3P模拟物(mimic)、野生型(PTGS2-Wt)+双链阴性对照(Negativecontrol，NC)、野生型(PTGS2-Wt)+miR-101-3P抑制剂(inhibitors)、野生型(PTGS2-Wt)+单链阴性对照(NCH)、突变型(PTGS2-Mut)+miR-101-3P抑制剂(inhibitors)、突变型(PTGS2-Mut)+双链阴性对照(Negative control，NC)、突变型(PTGS2-Mut)+miR-101-3P抑制剂(inhibitors)和突变型(PTGS2-Mut)+单链阴性对照(NCH)；

3)采用RT-qPCR法检测miR-101-3P对PTGS2基因在mRNA水平的影响

根据GenBank山羊PTGS2基因即XM_018060731.1和内参基因β-actin即NM_001314342.1的mRNA序列，设计PTGS2基因和参基因β-actin的实时定量引物，将双链阴性对照(Negative control，NC)和miR-101-3P模拟物(mimic)转入卵泡颗粒细胞细胞，培养48h后提取RNA，然后进行反转录得到cDNA，通过实时定量PCR检测PTGS2基因的mRNA相对表达量；

所述的PTGS2基因实时定量引物如下：

上游引物F：5'-TTGATTGAGAGTCCGCCAAC-3'；

下游引物R：5'-GCAGTCATCAGGCACAGGAG-3'；

所述的内参基因β-actin实时定量引物如下：

上游引物F：5'-GCAAGTTCCACGGCACAG-3'；

下游引物R：5'-GGTTCACGCCCATCACAA-3'；

所述的反转录的条件是：

所述的反转录程序如下：

37℃孵育15min，85℃孵育5s，4℃保存；

所述的RT-qPCR的条件是：

4)采用Western blot法检测miR-101-3P对PTGS2基因在蛋白水平的影响

将双链阴性对照(Negative control，NC)和miR-101-3P模拟物(mimic)转入卵泡颗粒细胞细胞，培养48h后收集细胞，利用细胞蛋白裂解液提取总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度；

将双链阴性对照(Negative control，NC)和miR-101-3P转染组细胞蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将凝胶电泳(SDS-PAGE)上的蛋白转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜并用对应兔抗PTGS2、鼠抗β-ACTIN及HRP标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗进行孵育，加入ECL发光液反应后进行曝光，拍照，采用Image J图像分析软件对灰度进行量化分析，以β-actin为内参。

以下是发明人给出的具体实施例。

在以下的实施例中，酶切、连接、回收、转化、RNA提取、PCR扩增等常规分子生物学实验操作步骤可详见《分子克隆(第三版)》。

在以下的实施例中，引物PTGS2扩增PTGS2基因3'UTR区的2％琼脂糖凝胶电泳图参见图1，双荧光素酶报告载体构建结果见图2，miR-101-3P对野生型(PTGS2-Wt)及突变型(PTGS2-Mut)载体的荧光素酶活性的影响参见图3，PTGS2基因mRNA表达量如图4所示，PTGS2基因蛋白相对表达量参见图5。

1、山羊样品的采集及处理

卵巢组织和血样采自于杨陵上洛首的山羊屠宰厂，组织样品采集后立刻放入已灭菌的PBS溶液内，血液和组织样品放入装有冰袋的泡沫箱中带回实验室。血样样品采用ACD抗凝，-20℃保存，用于提取基因DNA，组织样品带回后直接分离卵泡颗粒细胞。

2、奶山羊卵泡卵泡颗粒细胞的分离、培养

(1)铺胶原蛋白：用0.006M的醋酸溶液配制0.012mg/ml的胶原蛋白溶液，铺胶原蛋白溶液于培养皿中，其中60mm培养皿为3500uL/皿，35mm培养皿为1330uL/皿，6孔板为1580uL/孔；

(2)配制培养液：添加浓度10％的胎牛血清于DMEM/F-12培养基中，双抗为青-链霉素；

(3)采样：从屠宰场采集奶山羊卵巢组织样，置于灭菌预冷的PBS缓冲液中，迅速带回实验室细胞间处理；

(4)清洗样品：浓度75％的乙醇清洗样品一次，PBS清洗样品3-5次；

(5)分离卵泡：用手术剪分离出单个卵泡，选取的卵泡大小为2mm-6mm，依次用PBS缓冲液、DMEM/F-12培养液清洗；

(6)收集卵泡液：将单个卵泡置于DMEM/F-12培养液中，用10mm注射器针头扎破，释放卵泡中的卵泡液；

(7)静置：吸取混合溶液于10ml无菌离心管中，静置10min，吸取上清于新的10ml无菌离心管中；

(8)离心：1000r/min离心10min，弃上清；

(9)接种：使用配制培养液重悬细胞，将细胞接种于培养皿或六孔板中，置于37℃、浓度5％的CO2培养箱中培养；

(10)去除杂质细胞：培养12h-24h，PBS缓冲液清洗，轻轻吹走培养皿表面的卵母细胞等杂质细胞及未贴壁卵巢卵泡颗粒细胞，更换细胞培养液，继续培养，进行后续试验。

3、基因组DNA的提取

(1)取290ul加入抗凝剂的冷冻或新鲜血液，放入1.5ml离心管中；

(2)加入29ul的20mg/ml的蛋白酶K溶液，室温15分钟(期间颠倒混匀几次)，加入300ul混合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮(但颜色偏黑色)；

(3)加入145ul的异丙醇(陈旧血加290ul异丙醇)，剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。

上述各操作步骤中适当力度充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时加入样品粘稠不易混匀时可以涡旋震荡15秒混匀，但不可用手剧烈震荡，以免剪切DNA。

(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱VI中(吸附柱放入收集管中)，10000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液；

(5)加入725ul的抑制物去除IR，12000rpm离心30秒，弃废液；

(6)加入750ul的漂洗液WB(请先检查是否已加入无水乙醇！)，12000rpm离心30秒，弃掉废液。

(7)加入750ul的漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液。

(8)将吸附柱VI放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

(9)取出吸附柱VI，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加70ul洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，-20℃保存；

注意：洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50ul，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。

4、卵泡颗粒细胞RNA的提取

转染48h卵泡颗粒细胞RNA提取：12孔板，PBS洗涤细胞1～2遍，加1ml的RNAisoPlus，吹打5～6次，使细胞全部裂解，之后转至无酶离心管中；静置5min，加210μl预冷的氯仿，盖紧离心管盖，上下充分震荡2min，待完全溶解后，常温静置5min；12000rpm、4℃离心15min；吸取上清至新的无酶管中，切忌吸出中间白色蛋白层；向上清中加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，-20℃冰浴20min，在12000rpm，4℃的条件下离心10min。离心过后，RNA在管底凝集成白色沉淀；倒掉上清，缓缓沿着管壁加入浓度为75％的乙醇1ml，上下轻轻颠倒离心管，于12000rpm，4℃的条件下离心5min，弃掉乙醇，常温进行10～15min的干燥沉淀过程，要尽量除尽乙醇，最后加25μL的RNAse-free水，待沉淀溶解后测量浓度，放入-80℃保存。

5、293T细胞培养

(1)293T细胞复苏

从液氮罐中取出293T迅速放入灭菌的37℃水浴中，待细胞融化，拿进细胞间，1000rpm离心10min，倒掉上清液，加入培养基重新悬浮细胞，用移液器转移到单皿中，混匀细胞，37℃恒温培养箱中培养。培养至试验需要的细胞密度。

(2)细胞传代

将达到90％的单皿细胞，吸除培养液，PBS清洗一遍，加入1ml的胰酶，37℃消化1min，待细胞由贴壁变成圆形时加入2ml含胎牛血清的培养液终止消化，用移液枪吸至10ml离心管中，1000rpm离心10min，倒掉上清液，保留细胞沉淀。加入培养液，重新悬浮细胞，等量转移至24孔板，37℃恒温培养箱中培养。

6、双荧光素酶报告载体的构建

根据预测的miR-101-3P与PTGS2 3'UTR区的结合位点，利用NCBI中奶山羊PTGS2基因3'UTR序列作为模板，使用Primer 5.0软件设计上下游引物，在引物序列的5'端加入相应的酶切位点。采用psiCHECKTM-2载体，对应的酶切位点为：XhoI和NotI。引物由上海生工生物工程公司合成。通过PCR扩增，得到PTGS2 3'UTR区，1.5％的琼脂电泳后回收目的片段，将回收的目的片段连接到pMD19-T载体上，将连接产物转入Top10感受态细胞中克隆，然后测序验证目的片段是否插入载体。采用质粒提试剂盒提取测序结果正确的菌液质粒，利用XhoI和NotI酶将psiCHECK-2空载体和含有PTGS2-3'UTR的T载体的质粒进行双酶切，总体积100μl，在恒温水浴锅中37℃水浴4h，加入10μl的10×Loading buffer混匀，将酶切产物进行电泳和胶回收。将上述纯化回收的PTGS2-3'UTR小片段和psiCHECK-2的大片段按照4：1的比例，用T4DNA Liase连接酶连接并进行转化，克隆、菌液PCR、测序、结果比对，最后提取正确的菌液质粒。载体命名为野生型(PTGS2-Wt)。根据野生型(PTGS2-Wt)3'UTR序列，设计miRNA靶位点3'UTR突变序列，加酶切位点XhoI和NotI，送上海生物工程有限公司合成突变序列，用于构建突变型(PTGS2-Mut)载体。突变型(PTGS2-Mut)的构建方法与野生型(PTGS2-Wt)相同。

以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg²⁺、dNTPs存在的情况下，利用引物PTGS2在PCR条件下进行扩增，确定得到的PCR产物为PTGS2基因3'UTR区的序列；

所述的引物PTGS2如下(其中下划线为XhoI和NotI内切酶的酶切位点)：

上游引物F：5'-CCGCTCGAGTAGTTCCCAGGGAGACAG-3'；

下游引物R：5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGCACATCCAGGGTAATG-3'。

所述的PCR扩增的条件是：

15μl反应体系：包括DNA模板0.5μl，7.5μl的MasterMix，引物PTGS2的上游引物F和下游引物R各0.5μl，加灭菌水至15μl；

胶回收实验步骤：

(1)电泳：根据DNA片段大小选择1.5％琼脂糖凝胶进行电泳。

(2)切胶：电泳结束后，在紫外灯下迅速切下目的片段，尽量除去胶块边缘不含DNA的部分，并且将胶块尽可能的切碎。

(3)称量：将胶块装入一个预先称量过的1.5ml离心管中，称取重量，计算胶重。每管内的胶块不应超过700mg。

(4)溶胶：按每1mg凝胶加入1μl膜结合液(MB)的比例(1：1)加入膜结合液(MB)，混匀后置于55℃水浴，每间隔1～2分钟混匀一次，直至胶块完全溶解(约5分钟)。

(5)DNA结合：待凝胶溶液冷却至室温后，转移到插入收集管的离心吸附柱内，静置1分钟，室温下≥12，000×g离心1分钟，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。

(6)清洗：加入600μl的膜漂洗液(MW，提前加入无水乙醇)于离心吸附柱中，室温下≥12，000×g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。

(7)再次清洗：加入600μl的膜漂洗液(MW)于离心吸附柱中，室温下≥12，000×g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。将离心吸附柱去盖再次离心2min，彻底除去残余漂洗液。

(8)洗脱：小心取出离心吸附柱，将其套入一个1.5ml灭菌离心管中。向硅胶吸附膜的中央加入30μl的洗脱缓冲液(EB)，室温静置1分钟后，≥12，000×g离心1分钟收集纯化的DNA片段。离心后可将洗脱后的溶液再次加入离心吸附柱中重复洗脱一次，可提高产量。

(9)储存：弃除离心吸附柱，将获得的DNA片段放于-20℃长期保存。

转化克隆实验步骤：

(1)将感受态细胞至于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，至于冰浴中。

(2)向感受态细胞悬液中加入目的DNA，100μl感受态细胞+10μl目的DNA，轻弹混匀，在冰浴中静置30min。

(3)将离心管置于42℃水浴中放置60～90sec，然后快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却4min，该过程不可摇动离心管。

(4)向每个离心管中加入900μl的液体LB培养(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床震荡培养45min，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

(5)将离心管内容物混匀，吸取100μL已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16h。

质粒提取实验步骤：

(1)柱平衡：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

(2)取1-6ml过夜培养的菌液，加入离心管，使用常规台式离心机，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。

(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液P1(已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

(4)向离心管中加入250μL溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。

(5)向离心管中加入350μl的溶液P3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12，000rpm离心15min。

(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。12，000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(7)向吸附柱CP3中加入600μl的漂洗液PW(提前加入无水乙醇)，12，000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

(8)重复操作(7)。

(9)将吸附柱CP3放入收集管中，12，000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱开盖，室温下晾干残余的漂洗液。

(10)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～100μl的ddH2O，室温放置2min，12，000rpm离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

7、细胞转染

(1)细胞密度达到50％以上，转染前12h，将双抗培养液换成无双抗培养液。

(2)每个孔转染方式如下：

A、将0.8μg的质粒和100pmol的miR-101-3P模拟物(mimic)和双链阴性对照(NC)溶于50μl的opti-mem无血清培养液中(表1)，静置5min；

B、将2μl的转染试剂溶于50μl的opti-mem无血清培养液中，静置5min；

C、将A液和B液混合，静置20min，得到混合C液。

(3)在混合液静置过程中，将原细胞培养液吸除，尽量吸干净，加入400μl的无血清培养液opti-mem。

(4)将混合C液加入每孔中，在37℃恒温培养箱中培养4-6h，将无血清培养液换成含双抗的有血清培养液培养24h。

表1 miRNA序列

8、双荧光素酶活性检测

(1)裂解细胞：293T细胞培养24h之后，拿出细胞间，将培养液吸除，每孔加入1ml的PBS清洗三遍，尽量将PBS清洗吸尽。加入细胞裂解液100μl，摇晃振荡反应15min，用移液器枪头吹打，保证细胞充分裂解。移液器吸出置于PCR管中，10，000～15，000g离心3～5min，取上清备用。

(2)融解萤火虫萤光素酶检测试剂和海肾萤光素酶检测缓冲液，并达到室温。海肾萤光素酶检测底物(100×)置于冰盒上备用。

(3)按照每个样品需100微升的量，取适量海肾萤光素酶检测缓冲液，按照1:100加入海肾萤光素酶检测底物(100×)配制成海肾萤光素酶检测工作液。例如1毫升海肾萤光素酶检测缓冲液中加入10微升海肾萤光素酶检测底物(100×)充分混匀后即可配制成约1毫升海肾萤光素酶检测工作液。

(4)按仪器操作说明书开启多功能酶标仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。

(5)每个样品测定时，取样品20-100微升。

(6)加入100微升萤火虫萤光素酶检测试剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。

(7)在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，加入100微升海肾萤光素酶检测工作液，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。

(8)在以萤火虫萤光素酶为内参的情况下，用海肾萤光素酶测定得到的RLU值除以萤火虫萤光素酶测定得到的RLU值。根据得到的比值来比较不同样品间目的报告基因的激活程度。

9、RT-qPCR检测

采用RT-qPCR法检测miR-101-3P对PTGS2基因在mRNA水平的影响。

根据GenBank山羊PTGS2基因(XM_018060731.1)和内参基因β-actin(NM_001314342.1)的mRNA序列，设计实时PTGS2基因和内参基因β-actin定量引物，由上海生物工程有限公司合成。

将双链阴性对照(Negative control，NC)和miR-101-3P模拟物(mimic)转入卵泡颗粒细胞，培养48h后提取RNA，然后进行反转录得到cDNA，通过实时定量PCR检测PTGS2基因的mRNA相对表达量。

所述的PTGS2基因实时定量引物如下：

上游引物F：5'-TTGATTGAGAGTCCGCCAAC-3'；

下游引物R：5'-GCAGTCATCAGGCACAGGAG-3'。

所述的内参基因β-actin实时定量引物如下：

上游引物F：5'-GCAAGTTCCACGGCACAG-3'；

下游引物R：5'-GGTTCACGCCCATCACAA-3'。

所述的反转录的条件是：

20μl反应体系：包括10μl的Reaction solution，4μl的5×Prime Script Buffer，Prime Script RT Enzyme Mix I和RT Prime Mix各1μl，加灭菌水至20μl。

所述的反转录程序如下：

37℃孵育15min，85℃孵育5s，4℃保存；

所述的RT-qPCR的条件是：

20μl反应体系：包括12.5μl的Platinum RTS SYBR Super Mix，PTGS2基因和参基因β-actin的上游引物F、下游引物R各1μl，1μl的cDNA模板，加灭菌水至20μl。

利用定量引物PTGS2的RT-qPCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性15s，退火温度为60℃，退火时间20s，72℃延伸20s，共进行35个循环，4℃保存。

10、Western Blot检测

(1)蛋白样品准备

细胞转染培养48h后，用PBS洗涤两遍，每孔加入150μl含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA，用细胞刮收集细胞于1.5ml离心管中，冰浴30min。在12000rpm，4℃下离心15min，取上清于1.5ml离心管中，-80℃保存。使用BCA试剂盒，测定蛋白样品浓度。根据样品体积，加入4×Loading Buffer蛋白上样液，100℃水浴10min。

(2)制胶

A分离胶：6.6ml的H₂O，8.0ml的浓度30％的Acrylamide，5.0ml的1.5M Tris-HCL(pH8.8)，0.2ml的浓度10％的SDS，0.2ml的浓度10％的过硫酸铵，0.008ml的TEMED混合，小心加入已经安装好的电泳垂直板，加入1.5ml～2ml的异丙醇封面以赶走气泡。待分离胶凝固之后，再用ddH₂O将异丙醇完全洗掉；

B SDS-PAGE浓缩胶：4.1ml的H₂O，1.0ml的浓度30％的Acrylamide，0.75ml的1.0MTris-HCL(pH6.8)，0.06ml浓度10％的SDS，0.06ml浓度10％的过硫酸铵，0.006ml的TEMED，混合均匀，加到分离胶上的同时快速放入梳子，防止有气泡出现。

(3)上样

待浓缩胶自然晾干后，谨慎拔掉电泳梳，将垂直板放入电泳槽，加1×Tris-Gly电泳缓冲液，根据蛋白浓度，计算每空加入的蛋白样品，Marker点5μl。

(4)电泳跑胶

60V～80V电压进行电泳，直到Marker分离，再将电压换成110V～120V，直到溴酚蓝电泳至凝胶下端，终止跑胶。根据蛋白分子量，选取合适的区间，切下目的胶。

(5)转膜

转膜夹的阴极在下，阳极在上，按顺序铺3层海绵，3层滤纸，目的胶，PVDF膜，3层滤纸，3层海绵。每放置一层，用玻璃棒赶走气泡，之后将转膜夹垂直放置转膜槽中，倒入转膜液，60V冰浴电泳2h。

(6)封闭

配备浓度5％的脱脂奶粉封闭液，进行1～2h封闭。

(7)一抗孵育

按相应比用浓度5％的脱脂奶粉稀释一抗，放入PVDF膜，4℃冰箱过夜，回收一抗，TBST清洗3遍，一次10min。

(8)二抗孵育

按1:1000用浓度5％的脱脂奶粉稀释二抗，室温下放在摇床缓慢摇动2小时，回收二抗，TBST清洗3遍，一次10min。

(9)照胶

按照1：1的比例，将ECL超敏发光液的A液和B液混合并避光，滴在PVDF膜上，利用成像系统显影拍照。

(10)结果处理

使用ImageJ图像分析软件进行灰度分析，数据用SPSS 18.0分析差异显著性(**P＜0.01，*P＜0.05)。

结果显示：miR-101-3P可以抑制PTGS2基因在mRNA和蛋白水平上的表达，进一步确定miR-101-3P可与PTGS23'UTR结合，PTGS2是miR-101-3P的目标靶基因。

核苷酸或氨基酸序列表

<110> 西北农林科技大学

<120>一种筛选miR-101-3P靶基因的方法

<160>

<210> 1

<211> 27

<212>引物PTGS2的上游引物F

<213> DNA

<220>

<400>

5'- CCGCTCGAGTAGTTCCCAGGGAGACAG -3'

<210> 2

<211> 34

<212> 引物PTGS2的下游引物R

<213> DNA

<220>

<400>

5'- ATAAGAATGCGGCCGCAGCACATCCAGGGTAATG -3'

<210> 3

<211> 20

<212> PTGS2基因实时定量引物的上游引物F

<213> DNA

<220>

<400>

5'-TTGATTGAGAGTCCGCCAAC-3'

<210> 4

<211> 20

<212> PTGS2基因实时定量引物的下游引物R

<213> DNA

<220>

<400>

5'-GCAGTCATCAGGCACAGGAG-3'

<210> 5

<211> 18

<212> 内参基因β-actin实时定量引物的上游引物F

<213> DNA

<220>

<400>

5'-GCAAGTTCCACGGCACAG-3'

<210> 6

<211> 18

<212> 内参基因β-actin实时定量引物的下游引物R

<213> DNA

<220>

<400>

5'-GGTTCACGCCCATCACAA-3'

<210> 7

<211> 21

<212>双链阴性对照（Negative control，NC）的Sense序列

<213> DNA

<220>

<400>

UUCUCCGAACGUGUCACGUTT

<210> 8

<211> 21

<212>双链阴性对照（Negative control，NC）的Antisense序列

<213> DNA

<220>

<400>

ACGUGACACGUUCGGAGAATT

<210> 9

<211> 20

<212> miR-3880模拟物（mimic）的Sense序列

<213> DNA

<220>

<400>

UACAGUACUGUGAUAACUGA

<210> 10

<211> 20

<212> miR-3880模拟物（mimic）的Antisense序列

<213> DNA

<220>

<400>

AGUUAUCACAGUACUGUAUU

<210> 11

<211> 20

<212> miRNA-101-3p抑制剂（inhibitors）序列

<213> DNA

<220>

<400>

UCAGUUAUCACAGUACUGUA

<210> 12

<211> 21

<212> MircoRNA inhibitor N.C（NCH）序列

<213> DNA

<220>

<400>

CAGUACUUUUGUGUAGUACAA

Claims

1.一种筛选miR-101-3P靶基因的方法，其特征在于，包括下列步骤：

3)采用RT-qPCR法检测miR-101-3P对PTGS2基因在mRNA水平的影响；

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的引物PTGS2如下，其中下划线为XhoI和NotI内切酶的酶切位点；

上游引物F：5'-CCGCTCGAGTAGTTCCCAGGGAGACAG-3'；

下游引物R：5'-ATAAGAATGCGGCCGCAGCACATCCAGGGTAATG-3'。

所述的PCR扩增的条件是：

所述的PCR扩增反应程序如下：

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，初步鉴定miR-101-3P的靶基因的具体实施方法为：

分别构建野生型及突变型报告基因质粒；

收集对数生长期的293T细胞，按照脂质体Lipofectamine2000转染说明书分别将miR-101-3P模拟物、miR-101-3P抑制剂、双链阴性对照、单链阴性对照和PTGS2荧光素酶报告载体共转入293T细胞，分为8组：野生型+miR-101-3P模拟物、野生型+双链阴性对照、野生型+miR-101-3P抑制剂、野生型+单链阴性对照、突变型+miR-101-3P抑制剂、突变型+双链阴性对照、突变型+miR-101-3P抑制剂和突变型+单链阴性对照；

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的采用RT-qPCR法检测miR-101-3P对PTGS2基因在mRNA水平的影响的具体方法是：

根据GenBank山羊PTGS2基因即XM_018060731.1和内参基因β-actin即NM_001314342.1的mRNA序列，设计PTGS2基因和参基因β-actin的实时定量引物，将双链阴性对照(Negativecontrol，NC)和miR-101-3P模拟物(mimic)转入卵泡颗粒细胞细胞，培养48h后提取RNA，然后进行反转录得到cDNA，通过实时定量PCR检测PTGS2基因的mRNA相对表达量；

所述的PTGS2基因实时定量引物如下：

上游引物F：5'-TTGATTGAGAGTCCGCCAAC-3'；

下游引物R：5'-GCAGTCATCAGGCACAGGAG-3'；

所述的内参基因β-actin实时定量引物如下：

上游引物F：5'-GCAAGTTCCACGGCACAG-3'；

下游引物R：5'-GGTTCACGCCCATCACAA-3'；

所述的反转录的条件是：

20μL反应体系，包括10μl的Reaction solution，4μl的5×Prime Script Buffer，Prime Script RT Enzyme Mix I和RT Prime Mix各1μl，加灭菌水至20μl；

所述的反转录程序如下：

37℃孵育15min，85℃孵育5s，4℃保存；

所述的RT-qPCR的条件是：

所述的利用定量引物PTGS2的RT-qPCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性15s，退火温度为60℃，退火时间20s，72℃延伸20s，共进行35个循环，4℃保存。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的采用Western blot法检测miR-101-3P对PTGS2基因在蛋白水平的影响的具体方法为：

将双链阴性对照和miR-101-3P模拟物转入卵泡颗粒细胞细胞，培养48h后收集细胞，利用细胞蛋白裂解液提取总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度；

将双链阴性对照和miR-101-3P转染组细胞蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶电泳上的蛋白转到聚偏氟乙烯膜并用对应兔抗PTGS2、鼠抗β-ACTIN及HRP标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗进行孵育，加入ECL发光液反应后进行曝光，拍照，采用Image J图像分析软件对灰度进行量化分析，以β-actin为内参。