CN108504683A - 一种miR-3880靶基因筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种miR‑3880靶基因筛选的方法，以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg2+、dNTPs存在的情况下，利用引物OGR1在PCR条件下进行扩增，确定得到的PCR产物为OGR1基因3'UTR区的序列；然后构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，初步鉴定miR‑3880的靶基因；采用RT‑qPCR法检测miR‑3880模拟物对OGR1基因在mRNA水平的影响；再采用Western blot法检测miR‑3880模拟物对OGR1基因在蛋白水平的影响。明确了OGR1 3'UTR区存在与miR‑3880的结合位点，验证了miR‑3880与靶基因OGR1的靶向调控关系，miR‑3880可以抑制OGR1基因在mRNA和蛋白水平上的表达，进一步确认OGR1是miR‑3880的靶基因。为研究miR‑3880对奶山羊乳腺发育和泌乳功能的影响奠定了基础。

Description

一种miR-3880靶基因筛选方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及分子克隆、RT-qPCR和Western blot检测技术，具体涉及一种miR-3880靶基因筛选方法，主要通过构建双荧光素酶报告载体，运用现代分子生物技术探寻并验证miR-3880的靶基因。
背景技术
miRNA是一种较短的(21-23个核苷酸)、进化保守的、非编码的RNA分子，具有转录后调控基因表达的功能，首次在秀丽隐杆线虫中被发现，其可通过与靶基因的3'非编码(UTR)结合，抑制mRNA翻译成蛋白。miRNA的调控相当复杂，每种miRNA能通过不同的信号通路调控多个靶基因，而每个靶基因可能同时受到几种miRNA的调节。miRNA作为一种重要的调控因子，广泛存在于动物体内，调控着动物体内大约1/3基因的表达，在哺乳动物生长发育、细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡、细胞内环境稳态等生命活动中起到重要的调节作用，研究表明miRNA通过调控靶基因的表达对乳腺上皮细胞的生长发育和泌乳功能的调节具有重要作用。
成熟的miRNA结合到RISC之后，通过以下两种方式发挥其在生物体内的功能：
(1)miRNA与靶基因mRNA完全匹配互补配对，降解靶基因，从而抑制基因的表达。在植物体内，几乎全部miRNA都是通过这种方式来抑制基因的表达，这也是动物和植物的miRNA之间重要的区别，并且在植物体内miRNA与靶基因的结合位点不仅仅局限于3'UTR内，靶基因的转录区域也可以进行结合。
(2)miRNA通过与靶基因不完全互补配对结合，抑制mRNA在翻译过程中基因的表达，从而使基因不能正常翻译表达形成功能蛋白，以此来达到基因表达调控的目的。这是在动物体内主要的调节方式，当然也存在mRNA与靶基因完全互补配对从而降解靶基因的调节方式。
研究发现，大多数miRNA通过使其靶mRNA的翻译抑制或降解来抑制基因表达。miRNA与靶基因相结合，在细胞凋亡、增殖、代谢、分化、肿瘤转移、发育等多种生物过程中发挥重要的作用。快速准确的鉴定miRNA的靶基因，对于研究miRNA与靶基因之间的相互作用关系和参与的生物过程以及在信号通路中发挥的作用具有很大的研究价值。目前研究miRNA的方法主要有生物信息学方法和生物学试验方法。
动物源miRNA主要通过与靶基因mRNA的3'UTR碱基互补结合，从而调控靶基因的表达，因此动物源miRNA的靶位点主要位于靶基因mRNA的3'UTR，同时这些区域往往包含多个miRNA的多个靶位点，这些靶位点往往具有物种间保守性，且无明显二级结构。目前寻找miRNA靶基因的方法主要有生物信息学以及生物实验方法。生物信息学方法主要是利用已经确定的miRNA序列和它们的靶基因序列相互匹配的规律，根据生物学的几个原则设计具有针对性的软件来进行，如TargetScan、miRanda、RNAhybrid、TargetScanS、PicTar、DIANA-microT、FindTar和RNA22等软件。生物信息学的方法只是通过算法为研究人员提供可能性最大的参考信息，还需要通过实验进行验证。miRNA与靶基因间的相互作用具有一定的规律性。
目前常规的算法主要遵循以下几个常用原则：
(1)miRNA与靶基因的互补性；
(2)miRNA靶位点在不同物种之间的保守性；
(3)miRNA-mRNA双链之间的热稳定性；
(4)miRNA靶位点不会有复杂的二级结构；
(5)miRNA的5'端与靶基因的结合能力强于3'端。除了这些基本原则以外，不同的预测方法还会根据各自总结的规律对算法进行限制和优化。
由于计算预测miRNA靶基因时存在很高的假阳性，因此必须利用生物学实验的方法对预测的靶基因进行验证。最常用的实验方法是采用双荧光素酶系统检测荧光素酶的活性，并利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测靶基因mRNA水平及蛋白水平的变化，从而确定miRNA与靶基因的对应关系，或者利用免疫共沉淀技术筛选miRNA的靶基因。
卵巢癌G蛋白偶联受体(ovarian cancer G protein-coupled receptor 1，OGR1or GPR68)可介导细胞内多种信号通路并参与多种生理过程。OGR1(ovarian cancer Gprotein-coupled 1，卵巢癌蛋白偶联受1)，G2A(G2accumulation)，GPR4(G-proteincoupled receptor 4，G蛋白偶联受体4)及TDAG8(T cell death associated gene 8，细胞死亡相关基因8)都属于OGR1亚家族，它们之间有40％-50％的同源性。当前研究表明，OGR1亚家族具有重要而广泛的生理作用，涉及到免疫反应，细胞骨架重组，癌症，细胞增殖，凋亡等。
发明内容
为了利用生物学技术寻找并验证miRNA靶基因，本发明的目的在于，提供一种miR-3880靶基因筛选方法，该方法主要采用分子克隆、RT-qPCR和Western blot检测技术验证miR-3880与靶基因OGR1之间的调控关系。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
一种miR-3880靶基因筛选方法，其特征在于，按下列步骤进行：
1)以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg2+、dNTPs存在的情况下，利用引物OGR1在PCR条件下进行扩增，确定得到的PCR产物为OGR1基因3'UTR区的序列；
2)构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，初步鉴定miR-3880的靶基因；
3)采用RT-qPCR法检测miR-3880模拟物对OGR1基因在mRNA水平的影响；
4)采用Western blot法检测miR-3880模拟物对OGR1基因在蛋白水平的影响。
根据本发明，步骤1)中，所述的引物OGR1如下所示，其中的下划线为XhoI和NotI内切酶的酶切位点；
上游引物F：5'-CGCTCGAGGTGGAGGTTGGATGGGGAGA-3'；
下游引物R：5'-ATGCGGCCGCACACATGCACACACAGAGCC-3'。
所述的PCR扩增的条件是：
15μL反应体系，包括DNA模板0.5μl，7.5μl的MasterMix，引物OGR1的上游引物F和下游引物R各0.5μl，加灭菌水至15μl；
利用引物OGR1在PCR条件下进行扩增的反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，退火温度为60℃，退火时间30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。
进一步地，步骤2)所述的构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，初步鉴定miR-3880的靶基因的具体实施方法为：
分别构建野生型及突变型报告基因质粒；
收集对数生长期的293T细胞，按照脂质体Lipofectamine2000转染说明书分别将miR-3880模拟物、阴性对照和OGR1荧光素酶报告载体共转入293T细胞，分为4组：野生型+miR-3880模拟物、野生型+阴性对照、突变型+miR-3880模拟物和突变型+阴性对照；
培养36h后，检测不同组别萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的强度，用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶强度的比值计算相对荧光素酶的活性。
步骤3)所述的采用RT-qPCR法检测miR-3880模拟物对OGR1基因在mRNA水平的影响的具体实施方法为：
根据GenBank山羊OGR1基因即XM_018066129.1，以及内参基因β-actin即NM_001314342.1的mRNA序列，设计OGR1基因和参基因β-actin的实时定量引物，将阴性对照和miR-3880模拟物转入乳腺上皮细胞，培养48h后提取RNA，然后进行反转录得到cDNA，通过实时定量PCR检测OGR1基因的mRNA相对表达量；
所述的OGR1基因的实时定量引物如下：
上游引物F：5'-GCAGACAACACCTCGATGAA-3'；
下游引物R：5'-GTAGAGGGACAGGCAGTTGG-3'。
所述的内参基因β-actin的实时定量引物如下：
上游引物F：5'-GCAAGTTCCACGGCACAG-3'；
下游引物R：5'-GGTTCACGCCCATCACAA-3'。
所述的反转录的条件是：
20μl反应体系：10μl的eaction solution，4μl的5×Prime Script Buffer，1μl的rime Script RT Enzyme Mix I和1μl的RT Prime Mix，加灭菌水至20μl；
所述的反转录程序为：37℃孵育15min，85℃孵育5s，4℃保存；
所述的RT-qPCR的条件是：
20μl反应体系：12.5μl的latinum RTS SYBR Super Mix，OGR1基因和内参基因β-actin实时定量引物的上游引物F、下游引物R各1μl，1μl的DNA模板，加灭菌水至20μl；
所述的RT-qPCR反应程序如下：
95℃预变性5min，94℃变性15s，退火温度为60℃，退火时间20s，72℃延伸20s，共进行35个循环，4℃保存；
步骤4)所述的采用Western blot法检测miR-3880模拟物对OGR1基因在蛋白水平的影响的具体方法为：
将阴性对照和miR-3880mimic转入乳腺上皮细胞，培养48h后收集细胞，利用细胞蛋白裂解液提取总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度；
将阴性对照组和miR-3880模拟物转染组细胞蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶电泳上的蛋白转到聚偏氟乙烯膜并用对应兔抗OGR1、兔抗GAPDH及HRP标记的羊抗兔二抗进行孵育，加入ECL发光液反应后进行曝光，拍照，采用Image J图像分析软件对灰度进行量化分析，以β-actin为内参。
本发明的miR-3880靶基因筛选方法，与现有技术相比，具有以下技术效果：
明确了OGR1 3'UTR区存在与miR-3880的结合位点，利用现代分子生物技术验证了miR-3880与靶基因OGR1的靶向调控关系，miR-3880可以抑制OGR1基因在mRNA和蛋白水平上的表达，进一步确认OGR1是miR-3880的靶基因。为进一步研究miR-3880对奶山羊乳腺发育和泌乳功能的影响奠定了基础。
为miRNA靶基因的筛选以及确定其与靶基因的调控关系奠定了基础，以便用于研究miRNA对奶山羊乳腺发育和泌乳功能的调控作用。
附图说明
图1是引物OGR1扩增OGR1基因3'UTR区的2％琼脂糖凝胶电泳图，图中M表示：Marker；
图2是双荧光素酶报告载体构建结果图，图中：
A：OGR1-3ˊUTR双酶切凝胶电泳图(目的片段为391bp)；
B：OGR1-3ˊUTR在psiCHECK-2载体中的插入位置图；
C：miR-3880靶位点突变图；
图3是相对荧光素酶表达活性图，其中：
A：miR-3880对OGR1-Wt载体的荧光素酶活性的影响；
B：miR-3880对OGR1-Mut载体的荧光素酶活性的影响；
图4是OGR1基因mRNA表达量；
图5是OGR1基因蛋白相对表达量，图中：
A：Western Blotting检测结果；
B：OGR1蛋白相对表达量；
以下通过对山羊样品采集及双荧光素酶报告载体的构建和荧光素酶活性检测，RT-qPCR和Western blotting分析实施来进一步对本发明作详细说明。
具体实施方式
本实施例给出一种miR-3880靶基因筛选方法，包括下列步骤：
1)以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg2+、dNTPs存在的情况下，利用引物OGR1在PCR条件下进行扩增，确定得到的PCR产物为OGR1基因3'UTR区的序列；
所述的引物OGR1如下(下划线为XhoI和NotI内切酶的酶切位点)：
上游引物F：5'-CGCTCGAGGTGGAGGTTGGATGGGGAGA-3'；
下游引物R：5'-ATGCGGCCGCACACATGCACACACAGAGCC-3'。
所述的PCR扩增的条件是：
15μl反应体系包括：DNA模板0.5μl，7.5μl的MasterMix，引物OGR1的上游引物F和下游引物R各0.5μl，加灭菌水至15μl；
所述的PCR扩增反应程序如下：
利用引物OGR1的PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，退火温度为60℃，退火时间30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。
2)构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，初步鉴定miR-3880的靶基因
分别构建野生型(OGR1-Wt)及突变型(OGR1-Mut)报告基因质粒；
收集对数生长期的293T细胞，按照脂质体Lipofectamine2000转染说明书分别将miR-3880模拟物(mimic)、阴性对照(Negative control，NC)和OGR1荧光素酶报告载体共转入293T细胞，分为4组，即野生型OGR1-Wt+miR-3880模拟物(mimic)、野生型(OGR1-Wt)+阴性对照(Negative control，NC)、突变型(OGR1-Mut)+miR-3880模拟物(mimic)和突变型(OGR1-Mut)+阴性对照(Negative control，NC)；培养36h后，检测不同组别萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的强度，用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶强度的比值计算相对荧光素酶的活性；
3)采用RT-qPCR法检测miR-3880模拟物(mimic)对OGR1基因在mRNA水平的影响
根据GenBank山羊OGR1基因(XM_018066129.1)和内参基因β-actin(NM_001314342.1)的mRNA序列，设计OGR1基因和内参基因β-actin实时定量引物，由上海生物工程有限公司合成。将阴性对照(Negative control，NC)和miR-3880模拟物(mimic)转入乳腺上皮细胞，培养48h后提取RNA，然后进行反转录得到cDNA，通过实时定量PCR检测OGR1基因的mRNA相对表达量；
所述的OGR1基因实时定量引物如下：
上游引物F：5'-GCAGACAACACCTCGATGAA-3'；
下游引物R：5'-GTAGAGGGACAGGCAGTTGG-3'。
所述的内参基因β-actin实时定量引物如下：
上游引物F：5'-GCAAGTTCCACGGCACAG-3'；
下游引物R：5'-GGTTCACGCCCATCACAA-3'。
所述的反转录的条件是：
20μL反应体系包括：10μl的Reaction solution，4μl的×Prime Script Buffer，1μl的rime Script RT Enzyme Mix I和1μl的RT Prime Mix，加灭菌水至20μl。
所述的反转录程序如下：
37℃孵育15min，85℃孵育5s，4℃保存；
所述的RT-qPCR的条件是：
20μl反应体系：12.5μl的latinum RTS SYBR Super Mix，OGR1基因和内参基因β-actin实时定量引物的上游引物F、下游引物R各1μl，1μl的DNA模板，加灭菌水至20μl。
所述的RT-qPCR反应程序如下：
95℃预变性5min，94℃变性15s，退火温度为60℃，退火时间20s，72℃延伸20s，共进行35个循环，4℃保存。
4)采用Western blot法检测miR-3880对OGR1基因在蛋白水平的影响。
将阴性对照和miR-3880模拟物转入乳腺上皮细胞，培养48h后收集细胞，利用细胞蛋白裂解液提取总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度。
将阴性对照组和miR-3880模拟物转染组细胞蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将凝胶电泳上的蛋白转到聚偏氟乙烯(PVDF)膜并用对应兔抗OGR1、兔抗GAPDH及HRP标记的羊抗兔二抗进行孵育，加入ECL发光液反应后进行曝光，拍照，采用Image J图像分析软件对灰度进行量化分析，以β-actin为内参。
以下是发明人给出的具体实施例。
在以下的实施例中，酶切、连接、回收、转化、RNA提取、PCR扩增等常规分子生物学实验操作步骤可详见《分子克隆(第三版)》。
在以下的实施例中，引物OGR1扩增OGR1基因3'UTR区的2％琼脂糖凝胶电泳图参见图1，双荧光素酶报告载体构建结果如图2所示，相对荧光素酶表达活性参见图3，OGR1基因mRNA表达量参见图4，OGR1基因蛋白相对表达量参见图5。
1、山羊样品的采集及处理
乳腺组织和血样采自于杨陵上洛首的山羊屠宰厂，组织样品采集后立刻放入已灭菌的PBS溶液内，血液和组织样品放入装有冰袋的泡沫箱中带回实验室。血样样品采用ACD抗凝，-20℃保存，用于提取基因DNA，组织样品带回后直接分离乳腺上皮细胞。
2、乳腺上皮细胞的培养
(1)乳腺上皮细胞的原代培养
用3倍双抗的D-Hankk's液反复冲洗乳腺组织，直到组织发白为止。在超净台剥离脂肪组织和结缔组织，将白色颗粒状的腺泡组织剪成约1mm3大小，按照1.5cm左右间隔在预处理的培养皿中接种，置37℃、浓度5％的CO2、饱和湿度的培养箱中20-30分钟左右，然后向培养皿中轻轻加入1mL培养液继续培养1-2小时后再补1mL培养液，以后每2到3天更换一次培养液。
(2)乳腺上皮细胞的传代培养
当直径60mm皿培养的细胞生长汇合至95％左右时(约1.6×106-2.0×106个)，将培养基吸出，加入胰酶消化液，置培养箱内37℃消化3-5min；在倒置显微镜下观察，待大部分细胞回缩变圆、将要脱落时将消化液吸出，继续在37℃放置2-3min；加入培养基，用移液器反复吹打培养皿底部使大部分细胞脱落，吸出三分之二左右的培养基(约0.7×106-1.0×106个细胞)，离心后接种到新的培养皿或冻存；
在原皿中补足新鲜培养基继续培养。第3天或第4天，细胞可生长汇合至95％左右，重复上述过程。
3、基因组DNA的提取
(1)取290ul加入抗凝剂的冷冻或新鲜血液，放入1.5ml离心管中；
(2)加入29ul的20mg/ml的蛋白酶K溶液，室温15分钟(期间颠倒混匀几次)，加入300ul混合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮(但颜色偏黑色)；
(3)加入145ul的异丙醇(陈旧血加290ul异丙醇)，剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
上述各操作步骤中适当力度充分混匀非常重要，混匀不充分严重降低产量，必要时加入样品粘稠不易混匀时可以涡旋震荡15秒混匀，但不可用手剧烈震荡，以免剪切DNA。
(4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱VI中，(吸附柱放入收集管中)10000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液；
(5)加入725ul的抑制物去除IR，12000rpm离心30秒，弃废液；
(6)加入750ul的漂洗液WB(注意，先检查是否已加入无水乙醇！)，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
(7)加入750ul的漂洗液WB，12000rpm离心30秒，弃掉废液。
(8)将吸附柱VI放回空收集管中，13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(9)取出吸附柱VI，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加70ul洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，-20℃保存；
注意：洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA浓度较高，可以适当减少洗脱体积，但是最小体积不应少于50ul，体积过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量。
4、乳腺上皮细胞RNA的提取
转染48h乳腺上皮细胞RNA提取：12孔板，PBS洗涤细胞1～2遍，加1ml的RNAisoPlus，吹打5～6次，使细胞全部裂解，之后转至无酶离心管中；静置5min，加210μl预冷的氯仿，盖紧离心管盖，上下充分震荡2min，待完全溶解后，常温静置5min；12000rpm、4℃离心15min；吸取上清至新的无酶管中，切忌吸出中间白色蛋白层；向上清中加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，-20℃冰浴20min，在12000rpm、4℃的条件下离心10min。离心过后，RNA在管底凝集成白色沉淀；倒掉上清，缓缓沿着管壁加入浓度为75％的乙醇1ml，上下轻轻颠倒离心管，于12000rpm、4℃的条件下离心5min，弃掉乙醇，常温进行10～15min的干燥沉淀过程，要尽量除尽乙醇，最后加25μl的RNAse-free水，待沉淀溶解后测量浓度，放入-80℃保存。
5、293T细胞培养
(1)293T细胞复苏
从液氮罐中取出293T细胞迅速放入灭菌的37℃水浴中，待细胞融化，拿进细胞间，1000rpm离心10min，倒掉上清液，加入培养基重新悬浮细胞，用移液器转移到单皿中，混匀细胞，37℃恒温培养箱中培养。培养至试验需要的细胞密度。
(2)细胞传代
将达到90％的单皿细胞，吸除培养液，PBS清洗一遍，加入1ml的胰酶，37℃消化1min，待细胞由贴壁变成圆形时加入2ml含胎牛血清的培养液终止消化，用移液枪吸至10ml离心管中，1000rpm离心10min，倒掉上清液，保留细胞沉淀。加入培养液，重新悬浮细胞，等量转移至24孔板，37℃恒温培养箱中培养。
6、双荧光素酶报告载体的构建
根据预测的miR-3880与OGR1 3'UTR区的结合位点，利用NCBI中奶山羊OGR1基因3'UTR序列作为模板，使用Primer 5.0软件设计上下游引物，在引物序列的5'端加入相应的酶切位点。
本实施例采用psiCHECKTM-2载体，对应的酶切位点为：XhoI和NotI。引物由上海生工生物工程公司合成。通过PCR扩增，得到OGR1 3'UTR区，1.5％的琼脂电泳后回收目的片段，将回收的目的片段连接到pMD19-T载体上，将连接产物转入Top10感受态细胞中克隆，然后测序验证目的片段是否插入载体。采用质粒提试剂盒提取测序结果正确的菌液质粒，利用XhoI和NotI酶将psiCHECK-2空载体和含有OGR1-3'UTR的T载体的质粒进行双酶切，总体积100μl，在恒温水浴锅中37℃水浴4h，加入10μL的10×Loading buffer混匀，将酶切产物进行电泳和胶回收。将上述纯化回收的OGR1-3'UTR小片段和psiCHECK-2的大片段按照4：1的比例，用T4DNA Liase连接酶连接并进行转化，克隆、菌液PCR、测序、结果比对，最后提取正确的菌液质粒。载体命名为野生型(OGR1-Wt)。
根据野生型(OGR1-Wt)3'UTR序列，设计miRNA靶位点3'UTR突变序列，加酶切位点XhoI和NotI，送上海生物工程有限公司合成突变序列，用于构建突变型(OGR1-Mut)载体。突变型(OGR1-Mut)载体的构建方法与野生型(OGR1-Wt)相同。
以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg2+、dNTPs存在的情况下，利用引物OGR1在PCR条件下进行扩增，确定得到的PCR产物为OGR1基因3'UTR区的序列；
所述的引物OGR1如下(下划线为XhoI和NotI内切酶的酶切位点)：
上游引物F：5'-CGCTCGAGGTGGAGGTTGGATGGGGAGA-3'；
下游引物R：5'-ATGCGGCCGCACACATGCACACACAGAGCC-3'。
所述的PCR扩增的条件是：
15μl反应体系：包括DNA模板0.5μl，7.5μl的MasterMix，引物OGR 1的上游引物F和下游引物R各0.5μl，加灭菌水至15μl；
利用引物OGR1的PCR条件下进行扩增的反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，退火温度为60℃，退火时间30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。
胶回收实验步骤：
(1)电泳：根据DNA片段大小选择1.5％琼脂糖凝胶进行电泳。
(2)切胶：电泳结束后，在紫外灯下迅速切下目的片段，尽量除去胶块边缘不含DNA的部分，并且将胶块尽可能的切碎。
(3)称量：将胶块装入一个预先称量过的1.5ml离心管中，称取重量，计算胶重。每管内的胶块不应超过700mg。
(4)溶胶：按每1mg凝胶加入1μl的膜结合液(MB)的比例(1:1)加入膜结合液(MB)，混匀后置于55℃水浴，每间隔1～2分钟混匀一次，直至胶块完全溶解(约5分钟)。
(5)DNA结合：待凝胶溶液冷却至室温后，转移到插入收集管的离心吸附柱内，静置1分钟，室温下≥12，000×g离心1分钟，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。
(6)清洗：加入600μl的膜漂洗液(MW，提前加入无水乙醇)于离心吸附柱中，室温下≥12，000×g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。
(7)再次清洗：加入600μl的膜漂洗液(MW)于离心吸附柱中，室温下≥12，000×g离心30秒，弃除收集管中的废液，将离心吸附柱重新插回收集管中。将离心吸附柱去盖再次离心2min，彻底除去残余漂洗液。
(8)洗脱：小心取出离心吸附柱，将其套入一个1.5ml灭菌离心管中。向硅胶吸附膜的中央加入30μl洗脱缓冲液(EB)，室温静置1分钟后，≥12，000×g离心1分钟收集纯化的DNA片段。离心后可将洗脱后的溶液再次加入离心吸附柱中重复洗脱一次，可提高产量。
(9)储存：弃除离心吸附柱，将获得的DNA片段放于-20℃长期保存。
转化克隆实验步骤：
(1)将感受态细胞至于冰浴中，如需分装可将刚融化细胞悬液分装到无菌预冷的离心管中，至于冰浴中。
(2)向感受态细胞悬液中加入目的DNA，100μl感受态细胞+10μl目的DNA，轻弹混匀，在冰浴中静置30min。
(3)将离心管置于42℃水浴中放置60～90sec，然后快速将离心管转移到冰浴中，使细胞冷却4min，该过程不可摇动离心管。
(4)向每个离心管中加入900μL的液体LB培养(不含抗生素)，混匀后置于37℃摇床震荡培养45min，目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
(5)将离心管内容物混匀，吸取100μl已转化的感受态细胞加到含相应抗生素的LB固体琼脂培养基上，用无菌的弯头棒轻轻的将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃培养12-16h。
质粒提取实验步骤：
(1)柱平衡：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12，000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(2)取1ml-6ml过夜培养的菌液，加入离心管，使用常规台式离心机，12，000rpm离心1min，尽量吸除上清(菌液较多时可通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)。
(3)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl的溶液P1(已加入RNaseA)，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀。
(4)向离心管中加入250μl的溶液P2，温和地上下翻转6～8次使菌体充分裂解。
(5)向离心管中加入350μl的溶液P3，立即温和地上下翻转6～8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12，000rpm离心15min。
(6)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀。12，000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(7)向吸附柱CP3中加入600μl的漂洗液PW(提前加入无水乙醇)，12，000rpm离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。
(8)重复操作(7)。
(9)将吸附柱CP3放入收集管中，12，000rpm离心2min，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。将吸附柱开盖，室温下晾干残余的漂洗液。
(10)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50～100μl的ddH2O，室温放置2min，12，000rpm离心2min，将质粒溶液收集到离心管中。
7、293T细胞的转染及双荧光素酶活性检测
将构建的野生型(RUNX1-Wt)和突变型(RUNX1-Mut)psiCHECK2-OGR1-3′UTR的双荧光素酶载体质粒与miR-3880模拟物(mimic)和阴性对照(Negative control，NC)分别共转染到293T细胞，检测双荧光素酶的活性。
(1)共转步骤：
①转染前一日，将适量的293T细胞接种到24孔板里，向每孔加入500μl细胞完全培养液进行培养，293T细胞在24孔板中的融合率大约为60％时进行共转。共转6h前，将24孔细胞培养板中的培养液换成无双抗的培养液(消化细胞时，注意把成团的细胞消散，完全均匀的铺在24孔培养板中)。
②根据Lipofectamine2000Reagent的使用说明书将转染试剂(μl)、质粒(μg)和miRNA(μg)用Ⅰ培养基分别稀释后进行转染，24孔板中每孔转染混合溶液配制具体步骤如下：
miRNA稀释：每孔细胞用48μl的Ⅰ基础培养基分别稀释2μl的miR-3880mimic和阴性对照(Negative control，NC)，轻轻混匀，室温孵育5min；
质粒DNA稀释：每孔细胞用47μl的Ⅰ基础培养基稀释3μl的野生型和突变型质粒DNA，轻轻混匀，室温孵育5min；
lip2000稀释：每孔细胞用48μl的Ⅰ基础培养基稀释2μl的lip2000转染试剂，轻轻混匀，室温孵育5min；
将上述稀释后的lip2000转染试剂分别与miR-3880模拟物(mimic)和阴性对照(Negative control，NC，)以及野生型(OGR1-Wt)和突变型(OGR1-Mut)质粒DNA稀释液混合，室温下孵育15～20min，使转染复合物溶液充分孵育。
③在室温下将混合好的miRNA和质粒转染复合物分别加入到含有无双抗培养液的24孔板中，向每孔中各加100μl，且每个样做3个重复，轻轻混匀，使转染复合物溶液均匀分布于24孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱中培养；
④共转4～6h后，把24孔板中培养液换成完全培养液，继续置于细胞培养箱中培养。
⑤共转36h后，收共转染的293T细胞，检测双荧光素酶的活性。
(2)293T细胞的裂解
弃去24孔板中培养细胞的培养液，用PBS清洗培养的细胞3遍，去尽清洗液(注意不要把细胞洗掉)。向每孔中加入100μl的1×PLB裂解液，裂解液尽量完全把细胞覆盖。然后在室温摇床上轻轻晃动24孔板15min，把完全裂解的细胞裂解液转移到已灭菌的微量离心管中，待测。
(3)双荧光素酶活性检测
根据仪器操作说明书设置好双荧光素酶检测系统的程序，每个样品取20μl测定，且每个样品重复3个，先检测萤火虫荧光素酶的活性，向每个样品中加入100μl萤火虫荧光素酶检测试剂，轻轻吹打混匀后进行测定，待萤火虫荧光素酶的活性检测完成后，向每个样品中加入100μl海肾荧光素酶检测试剂，轻轻吹打混匀后进行测定。以海肾荧光素酶为内参，用萤火虫荧光素酶活性检测值除以海肾荧光素酶检测值，根据比值进行比较不同样品间的相对表达量。
8、乳腺上皮细胞的转染
将miR-3880mimic(模拟物)和阴性对照(Negative control，NC)与转染试剂稀释液分别转到乳腺上皮细胞中，根据lip2000使用说明书，具体试验步骤如下：
(1)转染前一天，把乳腺上皮细胞均匀铺在6孔板中，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱培养。
(2)转染6h前，把培养板中的原培养液换成无双抗的培养液。
(3)转染复合物溶液的配制：
miRNA稀释：每孔细胞用97μl的Ⅰ基础培养基稀释3μl的miR-3880mimic(模拟物)和阴性对照(Negative control，NC)，轻轻混匀，室温孵育5min(表1)；
lip2000稀释：每孔细胞用96μl的Ⅰ基础培养基稀释4μl的lip2000转染试剂，轻轻混匀，室温孵育5min；
将上述稀释后的lip2000转染试剂分别与miR-3880模拟物(mimic)和阴性对照(Negative control，NC，)稀释液混合，室温下孵育15～20min，使转染复合物溶液充分孵育。
(4)将miR-3880mimic(模拟物)和阴性对照(Negative control，NC)转染复合物溶液分别向6孔板中加入200μl，轻轻晃动培养板混匀，置于培养箱中培养。
(5)在转染48h后，收集并处理细胞。
表1miRNA序列
9、RT-qPCR检测
采用RT-qPCR法检测miR-3880对OGR1基因在mRNA水平的影响。根据GenBank山羊OGR1基因(即M_018066129.1)和内参基因β-actin(即M_001314342.1)的mRNA序列，设计OGR1基因和内参基因β-actin实时定量引物，由上海生物工程有限公司合成。将阴性对照(Negative control，NC，)和miR-3880模拟物(mimic)转入乳腺上皮细胞，培养48h后提取RNA，然后进行反转录得到cDNA，通过实时定量PCR检测OGR1基因的mRNA相对表达量。
所述的OGR1实时定量引物如下：
上游引物F：5'-GCAGACAACACCTCGATGAA-3'；
下游引物R：5'-GTAGAGGGACAGGCAGTTGG-3'。
所述的内参基因β-actin实时定量引物如下：
上游引物F：5'-GCAAGTTCCACGGCACAG-3'；
下游引物R：5'-GGTTCACGCCCATCACAA-3'。
所述的反转录的条件是：
20μl反应体系包括：10μl的Reaction solution，4μl的5×Prime Script Buffer，1μl的Prime Script RT Enzyme Mix I和1μl的RT Prime Mix，加灭菌水至20μl。
所述的反转录程序如下：
37℃孵育15min，85℃孵育5s，4℃保存；
所述的RT-qPCR的条件是：
20μl反应体系包括：12.5μl的Platinum RTS SYBR Super Mix，OGR1和内参基因β-actin的实时定量引物的上游引物F、下游引物R各1μl，1μl的cDNA模板，加灭菌水至20μl。
利用定量引物OGR1的RT-qPCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性15s，退火温度为60℃，退火时间20s，72℃延伸20s，共进行35个循环，4℃保存。
10、Western Blot检测
(1)蛋白样品准备
细胞转染培养48h后，用PBS洗涤两遍，每孔加入150μl含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA，用细胞刮收集细胞于1.5ml离心管中，冰浴30min。在12000rpm，4℃下离心15min，取上清于1.5ml离心管中，-80℃保存。使用BCA试剂盒，测定蛋白样品浓度。根据样品体积，加入4×Loading Buffer蛋白上样液，120℃水浴10min。
(2)制胶
A分离胶：6.6ml的H2O，8.0ml的30％Acrylamide，5.0ml的1.5M Tris-HCL(pH8.8)，0.2ml的10％SDS，0.2ml的10％过硫酸铵，0.008ml的TEMED混合，小心加入已经安装好的电泳垂直板，加入1.5～2ml的异丙醇封面以赶走气泡。待分离胶凝固之后，再用ddH2O将异丙醇完全洗掉；
B SDS-PAGE浓缩胶：4.1ml的H2O，1.0ml浓度为30％的Acrylamide，0.75ml的1.0MTris-HCL(pH6.8)，0.06ml浓度为10％的SDS，0.06ml的浓度为10％的过硫酸铵，0.006ml的TEMED，混合均匀，加到分离胶上的同时快速放入梳子，防止有气泡出现。
(3)上样
待浓缩胶自然晾干后，谨慎拔掉电泳梳，将垂直板放入电泳槽，加1×Tris-Gly电泳缓冲液，根据蛋白浓度，计算每空加入的蛋白样品，Marker点5μl。
(4)电泳跑胶
60～80V电压进行电泳，直到Marker分离，再将电压换成110～120V，直到溴酚蓝电泳至凝胶下端，终止跑胶。根据蛋白分子量，选取合适的区间，切下目的胶。
(5)转膜
转膜夹的阴极在下，阳极在上，按顺序铺3层海绵、3层滤纸、目的胶、PVDF膜、3层滤纸、3层海绵。每放置一层，用玻璃棒赶走气泡，之后将转膜夹垂直放置转膜槽中，倒入转膜液，60V冰浴电泳2h。
(6)封闭
配备5％的脱脂奶粉封闭液，进行1～2h封闭。
(7)一抗孵育
按相应比用浓度为5％的脱脂奶粉稀释一抗，放入PVDF膜，4℃冰箱过夜，回收一抗，TBST清洗3遍，一次10min。
(8)二抗孵育
按1：1000用浓度为5％的脱脂奶粉稀释二抗，室温下放在摇床缓慢摇动2小时，回收二抗，TBST清洗3遍，一次10min。
(9)照胶
按照1：1的比例，将ECL超敏发光液的A液和B液混合并避光，滴在PVDF膜上，利用成像系统显影拍照。
(10)结果处理
使用ImageJ图像分析软件进行灰度分析，数据用SPSS 18.0分析差异显著性(**P＜0.01，*P＜0.05)。
结果显示：明确了OGR1 3'UTR区存在与miR-3880的结合位点，验证了miR-3880与靶基因OGR1的靶向调控关系，miR-3880可以抑制OGR1基因在mRNA和蛋白水平上的表达，进一步确认OGR1是miR-3880的靶基因。为进一步研究miR-3880对奶山羊乳腺发育和泌乳功能的影响奠定了基础。
核苷酸或氨基酸序列表
<110> 西北农林科技大学
<120>一种miR-3880靶基因筛选方法
<160>
<210> 1
<211> 28
<212>引物OGR1的上游引物F
<213> DNA
<220>
<400>
5'- CGCTCGAGGTGGAGGTTGGATGGGGAGA -3'
<210> 2
<211> 30
<212> 引物OGR1的下游引物R
<213> DNA
<220>
<400>
5'- ATGCGGCCGCACACATGCACACACAGAGCC -3'
<210> 3
<211> 20
<212> OGR1基因实时定量引物的上游引物F
<213> DNA
<220>
<400>
5'-GCAGACAACACCTCGATGAA-3'
<210> 4
<211> 20
<212>OGR1基因实时定量引物的下游引物R
<213> DNA
<220>
<400>
5'-GTAGAGGGACAGGCAGTTGG-3'
<210> 5
<211> 18
<212> 内参基因β-actin实时定量引物的上游引物F
<213> DNA
<220>
<400>
5'-GCAAGTTCCACGGCACAG-3'
<210> 6
<211> 18
<212> 内参基因β-actin实时定量引物的下游引物R
<213> DNA
<220>
<400>
5'-GGTTCACGCCCATCACAA-3'
<210> 7
<211> 21
<212>阴性对照（Negative control，NC）的Sense序列
<213> DNA
<220>
<400>
UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
<210> 8
<211> 21
<212>阴性对照（Negative control，NC）的Antisense序列
<213> DNA
<220>
<400>
ACGUGACACGUUCGGAGAATT
<210> 9
<211> 18
<212> miR-3880mimic的Sense序列
<213> DNA
<220>
<400>
GGUCCCGCCGCCGCCGCC
<210> 10
<211> 18
<212> miR-3880 mimic的Antisense序列
<213> DNA
<220>
<400>
CGGCGGCGGCGGGACCUU

Claims (5)

1.一种miR-3880靶基因筛选方法，其特征在于，按下列步骤进行：
1)以山羊基因组DNA为模板，在Taq DNA聚合酶、缓冲环境、Mg2+、dNTPs存在的情况下，利用引物OGR1在PCR条件下进行扩增，确定得到的PCR产物为OGR1基因3'UTR区的序列；
2)构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，初步鉴定miR-3880的靶基因；
3)采用RT-qPCR法检测miR-3880模拟物对OGR1基因在mRNA水平的影响；
4)采用Western blot法检测miR-3880模拟物对OGR1基因在蛋白水平的影响。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的引物OGR1如下所示，其中的下划线为XhoI和NotI内切酶的酶切位点；
上游引物F：5'-CGCTCGAGGTGGAGGTTGGATGGGGAGA-3'；
下游引物R：5'-ATGCGGCCGCACACATGCACACACAGAGCC-3'；
所述的PCR扩增的条件是：
15μl反应体系，包括DNA模板0.5μl，7.5μl的MasterMix，引物OGR1的上游引物F和下游引物R各0.5μl，加灭菌水至15μl；
利用引物OGR1在PCR条件下进行扩增的反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，退火温度为60℃，退火时间30s，72℃延伸30s，共进行30个循环，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的构建双荧光素酶报告系统，检测荧光素酶活性，初步鉴定miR-3880的靶基因的具体实施方法为：
分别构建野生型及突变型报告基因质粒；
收集对数生长期的293T细胞，按照脂质体Lipofectamine2000转染说明书分别将miR-3880模拟物、阴性对照和OGR1荧光素酶报告载体共转入293T细胞，分为4组：野生型+miR-3880模拟物、野生型+阴性对照、突变型+miR-3880模拟物和突变型+阴性对照；
培养36h后，检测不同组别萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的强度，用萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶强度的比值计算相对荧光素酶的活性。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的采用RT-qPCR法检测miR-3880模拟物对OGR1基因在mRNA水平的影响的具体实施方法为：
根据GenBank山羊OGR1基因即XM_018066129.1，以及内参基因β-actin即NM_001314342.1的mRNA序列，设计OGR1基因和参基因β-actin的实时定量引物，将阴性对照和miR-3880模拟物转入乳腺上皮细胞，培养48h后提取RNA，然后进行反转录得到cDNA，通过实时定量PCR检测OGR1基因的mRNA相对表达量；
所述的OGR1基因的实时定量引物如下：
上游引物F：5'-GCAGACAACACCTCGATGAA-3'；
下游引物R：5'-GTAGAGGGACAGGCAGTTGG-3'；
所述的内参基因β-actin的实时定量引物如下：
上游引物F：5'-GCAAGTTCCACGGCACAG-3'；
下游引物R：5'-GGTTCACGCCCATCACAA-3'；
所述的反转录的条件是：
20μl反应体系：10μl的eaction solution，4μl的5×Prime Script Buffer，1μl的rimeScript RT Enzyme Mix I和1μl的RT Prime Mix，加灭菌水至20μl；
所述的反转录程序为：37℃孵育15min，85℃孵育5s，4℃保存；
所述的RT-qPCR的条件是：
20μl反应体系：12.5μl的latinum RTS SYBR Super Mix，OGR1基因和内参基因β-actin的实时定量引物的上游引物F、下游引物R各1μl，1μl的DNA模板，加灭菌水至20μl；
所述的RT-qPCR反应程序如下：
95℃预变性5min，94℃变性15s，退火温度为60℃，退火时间20s，72℃延伸20s，共进行35个循环，4℃保存。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的采用Western blot法检测miR-3880模拟物对OGR1基因在蛋白水平的影响的具体方法为：
将阴性对照和miR-3880模拟物转入乳腺上皮细胞，培养48h后收集细胞，利用细胞蛋白裂解液提取总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度；
将阴性照组和miR-3880模拟物转染组细胞蛋白样品进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，将凝胶电泳上的蛋白转到聚偏氟乙烯膜并用对应兔抗OGR1、兔抗GAPDH及HRP标记的羊抗兔二抗进行孵育，加入ECL发光液反应后进行曝光，拍照，采用Image J图像分析软件对灰度进行量化分析，以β-actin为内参。
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