CN107287227A - 一种山羊miR‑27a定点修饰系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种山羊miR‑27a定点修饰系统及其应用。本发明构建山羊miR‑27a定点修饰的体系能够有效识别和修饰山羊miR‑27a启动子区中转录因子CP2的结合位点。本发明所述的miR‑27a启动子结合位点如序列表SEQ ID NO：1所示核苷酸序列。本发明对山羊miR‑27a启动子区序列中的转录因子CP2集合位点进行分析，构建该结合位点的野生型双荧光素酶报告载体pGL3‑W，然后对集合位点进行碱基突变修饰，构建得到突变型双荧光素酶报告载体pGL3‑M。本发明所构建的两种双荧光素酶报告载体可用于研究山羊卵泡发育调控机制，对培育高产羔数山羊品种具有重要意义。

Description

一种山羊miR-27a定点修饰系统及其应用

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种山羊miR-27a定点修饰系统及其应用特别是涉及到对某些特定功能转录因子与目的基因启动子结合位点序列的编辑工作，例如在本发明中阐述的将miR-27a启动子区中转录因子CP2的结合位点进行修饰，从而改变CP2与miR-27a启动子的结合能力。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是由内源性基因编码的单链非编码RNA，长度一般为16-29核苷酸(nucleotide,nt)左右，通过与靶基因mRNA的3’UTR互补配对来调控其转录后的表达水平(Gu,2009.Gu S,Jin L,Zhang F,Sarnow P,Kay MA.Biological basis for restrictionof microRNA targets to the 3'untranslated region in mammalian mRNAs.NatStruct Mol Biol.2009 Feb；16(2):144-50)。作为一种小分子序列，miRNA可以全局调控基因的表达，功能涉及到组织生长、细胞凋亡、脂肪代谢、卵细胞发育、精子发生等重要生命过程(Brennecke et al.2003.Bantam encodes a developmentally regulated microRNAthat controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid inDrosophila.Cell.113:25-26；Yu et al.2005.MicroRNA Mirn122a reduces expressionof the post-transcriptionally regulated germcell transition protein 2(Tnp2)messenger RNA(mRNA)by mRNA cleavage.Biology of Reproduction.73:427-433)。例如，miR-21、miR-212和miR-132在小鼠颗粒细胞中呈显著的上调表达，并且当miR-21的表达量降低时会导致颗粒细胞凋亡(Carlettiet al.,2010.Carletti MZ,Fiedler SD,Christenson LK.MicroRNA 21 blocks apoptosis in mouse periovulatory granulosacells.Biol Reprod.2010 Aug 1；83(2):286-95)。在小鼠颗粒细胞中筛选出多个受TGF-β1信号调控的miRNA，其中miR-224可以靶向作用于Smad4基因来调控颗粒细胞的增殖(Yao etal.,2010.Yao G,Yin M,Lian J,Tian H,Liu L,Li X,Sun F.MicroRNA-224 is involvedin transforming growth factor-beta-mediated mouse granulosa cellproliferation and granulosa cell function by targeting Smad4.MolEndocrinol.2010 Mar；24(3):540-51)。有国外有研究团队通过高通量检测，在颗粒细胞中筛选出大量抑制雌激素分泌的miRNA，此外miR-28,miR-126,miR-105和miR-188等还可同时抑制雄激素和孕酮的分泌(Sirotkin et al.,2009.Sirotkin AV,Ovcharenko D,Grossmann R,Lauková M,Mlyncek M.Identification of microRNAs controlling humanovarian cell steroidogenesis via a genome-scalescreen.J Cell Physiol.2009May；219(2):415-20)。Dicer1^-/-雌鼠的卵母细胞中纺锤体发生异常，导致其不能完成第一次减数分裂(Murchison et a1.,2007.Murchison EP,Stein P,Xuan Z,Pan H,Zhang MQ,Schultz RM,Hannon GJ.Critical roles for Dicer in the female germline.GenesDev.2007 Mar 15；21(6):682-93)。对于卵泡发育而言，miRNA是一类发挥重要调控作用的小分子调控物。

养羊业在畜牧业中占有重要地位。繁殖是决定规模化养殖产出的一大主要经济性状。繁殖性状属于数量性状，具有遗传力低、选择周期长、选育进展慢等缺陷，成为制约养羊产业经济效益的主要原因。山羊尽管属于多胎动物，其每窝产羔数远远低于猪，在母畜繁殖性能对总效益值的所占的贡献比猪大。因此，提高羊的繁殖性能尤为重要。排卵率是产仔数性状的重要组分性状，卵巢中卵泡的生长发育决定了排卵数。因此探索卵巢中基因表达情况、发育规律和调控因素，对于揭示排卵率的遗传调控机制，进行高繁殖力品种的选育具有重要意义。

综上所述，在山羊卵泡的发育过程中miRNA发挥着重要作用。miRNA多数是通过与靶基因的3’UTR区序列特异性识别来实现对基因表达的调控作用，其前体也会受到特定转录因子的调控作用。因此，通过定点修饰转录因子CP2在miR-27a启动子中的结合位点，可用于构建相应双荧光素酶报告载体，研究转录因子的具体调控作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山羊miR-27a定点修饰体系及其在山羊miR-27a启动子区域对转录因子CP2结合位点进行修饰的应用方法。

本发明特别是涉及到对某些特定功能转录因子与目的基因启动子结合位点序列的编辑工作，例如在本发明中阐述的将miR-27a启动子区中转录因子CP2的结合位点进行修饰，从而改变CP2与miR-27a启动子的结合能力。

本发明的技术方案如下所述：

一种山羊miR-27a定点修饰系统,发明的要点在于：由山羊miR-27a的双荧光素酶报告基因载体pGL3-W和突变修饰后获得的载体pGL3-M构成，所述的pGL3-W载体包含有SEQID NO：2所示的核苷酸序列，pGL3-M载体包含有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，两段序列均位于山羊miR-27a的5’UTR区段，

通过如下步骤制备得到：

(1)以登录号为NC_030814(GeneBank登录号NC_030814)的山羊miR-27a前体序列，利用NCBI数据库检索工具往前延伸1000bp为扩增模板，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；利用上述扩增模板，通过Touch-down PCR方法克隆获得miR-27a前体5’UTR区段，测序验证序列正确性，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)利用JASPAR数据库(http://jaspar.genereg.net/)，预测得到山羊miR-27a的5’UTR启动子区中包含转录因子CP2的结合位点，其序列为GCTGCTGCCACACCCAGGG；

(3)将步骤(1)扩增得到的序列插入双荧光素酶报告基因载体pGL3(见图6)中，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证和抽提重组质粒，获得野生型双荧光素酶报告基因载体pGL3-W，其序列如SEQ ID NO：2所示；

(4)将步骤(3)构建的pGL3-W载体，针对需要修饰的转录因子CP2结合位点，设计如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列的突变引物，利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示序列的引物对PCR扩增出如SEQ ID NO：7所示序列的目的片段；利用SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：4所示序列的引物对PCR扩增出如SEQ ID NO：8所示序列的目的片段；将SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的序列通过融合PCR进行连接；以连接后产物为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列为引物对，得到PCR扩增产物，其序列如SEQ ID NO：9所示，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证、抽提重组质粒，得到转录因子CP2的结合位点突变型载体pGL3-M；

融合PCR的扩增条件为：95℃5min；95℃30s，30℃30s，35℃5s，40℃5s，45℃5s，50℃5，、55℃5s，60℃5s，65℃5s，72℃30s，共计30个循环；72℃10min；于4℃保存。

申请人提供了一种扩增山羊miR-27a的5’UTR区的Touch-down PCR引物对，所述引物对的序列如下所示：

上游引物：CTAGCTAGCAGTGGTTTCCTCCTGCCCTTCA，

下游引物：CCCAAGCTCCCTTGCCGCCATCCTTTG-3。

在本发明中，申请人还提出了一种对山羊miR-27a启动子区中转录因子CP2结合位点进行突变修饰的PCR引物对，所述引物对的序列如下所示：

正向引物：TGGTATCTTTAGCTATGATACTACCCAGGGATGGGG，

反向引物：CCCCATCCCTGGGTAGTATCATAGCTAAAGATACCA。

申请人提供了一种用于非诊断目的的一种山羊miR-27a定点修饰系统的制备方法,所述的方法包括由山羊miR-27a的双荧光素酶报告基因载体pGL3-W和突变修饰后获得的载体pGL3-M构成，所述的pGL3-W载体包含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，pGL3-M载体包含有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，两段序列均位于山羊miR-27a的5’UTR区段，

通过如下步骤制备得到：

(1)以登录号为NC_030814(GeneBank登录号NC_030814)的山羊miR-27a前体序列，利用NCBI数据库检索工具往前延伸1000bp为扩增模板，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；利用上述扩增模板，通过Touch-down PCR方法克隆获得miR-27a前体5’UTR片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)利用JASPAR数据库(http://jaspar.genereg.net/)，预测得到山羊miR-27a的5’UTR启动子区中包含转录因子CP2的结合位点，其序列为GCTGCTGCCACACCCAGGG；

(3)将步骤(1)扩增得到的序列插入双荧光素酶报告基因载体pGL3(见图6)中，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证和抽提重组质粒，获得野生型双荧光素酶报告基因载体pGL3-W，其序列如SEQ ID NO：2所示；

(4)将步骤(3)构建的pGL3-W载体，针对需要修饰的转录因子CP2结合位点，设计如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列的突变引物，利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示序列的引物对PCR扩增出如SEQ ID NO：7所示序列的目的片段；利用SEQ ID NO：5和SEQ IDNO：4所示序列的引物对PCR扩增出如SEQ ID NO：8所示序列的目的片段；将SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的序列通过融合PCR进行连接；以连接后产物为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示序列为引物对，得到PCR扩增产物，其序列如SEQ ID NO：9所示，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证、抽提重组质粒，得到转录因子CP2的结合位点突变型载体pGL3-M；

融合PCR的扩增条件为：95℃5min；95℃30s，30℃30s，35℃5s，40℃5s，45℃5s，50℃5，、55℃5s，60℃5s，65℃5s，72℃30s，共计30个循环；72℃10min；于4℃保存。

本发明的双荧光素酶报告载体pGL3-W和pGL3-M，可用于对候选转录因子p53对山羊miR-27a表达的调控活性的检测，用于筛选可调控山羊miR-27a表达的重要转录因子。

更详细技术方案和发明效果如《具体实施方式》所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1：是山羊miR-27a潜在启动子区段，序列长度为1083bp。

序列表SEQ ID NO：2：是通过扩增测序获得的包含转录因子CP2的片段，序列长678bp。

序列表SEQ ID NO：3：是快速扩增包含转录因子CP2序列的Touch-down PCR上游引物。

序列表SEQ ID NO：4：是快速扩增包含转录因子CP2序列的Touch-down PCR下游引物。

序列表SEQ ID NO：5：是用于对转录因子CP2结合位点进行修饰的上游突变引物。

序列表SEQ ID NO：6：是用于对转录因子CP2结合位点进行修饰的下游突变引物。

序列表SEQ ID NO：7：是由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6引物扩增测序获得突变片段。

序列表SEQ ID NO：8：是由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.4引物扩增测序获得突变片段。

序列表SEQ ID NO：9：是扩增测序获得的包含突变转录因子CP2结合位点的片段，序列长度为678bp。

图1：是本发明的总体技术流程图。

图2：是山羊miR-27a的启动子区扩增结果图。附图标记说明：在图2中：泳道M是DL2000 DNA marker，泳道1是目的扩增片段。

图3：是重叠片段SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8扩增结果图。附图标记说明：在图3中：泳道M是DL2000 DNA marker，泳道1是SEQ ID NO.7的扩增片段,泳道2是SEQ ID NO.8的扩增片段。

图4：是山羊miR-27a的启动子区中转录因子CP2突变修饰后扩增结果。附图标记说明：在图3中：泳道M是DL2000 DNA marker，泳道1是SEQ ID NO：9的扩增片段.

图5：是商业载体(质粒)pMD18-T的结构图谱。

图6：是空载体pGL3-Basic的结构图谱。

图7：是内参载体pRL-TK的结构图谱

图8：是用pGL3-W和pGL3-M分别转染CHO细胞24h后相对荧光素酶活性检测结果。附图标记说明：在图8中：纵坐标Related Luciferase Activity表示相对荧光素酶活性值，Basic为空白对照，**P<0.01。

具体实施方式

实施例1

1.山羊miR-27a启动子区分析与扩增

1.1山羊组织DNA提取与检测

利用北京百泰克生物技术有限公司提供的细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)来进行山羊卵泡组织全基因组DNA的提取，将提取的DNA于-20℃下保存备用。

基因组DNA浓度测定：使用NanoDrop 2000型DNA/RNA浓度测定仪，测定DNA浓度和OD值，按照所测浓度将管中的DNA做相应稀释，以50ng/μL分装，于-20℃保存。

基因组DNA质量检测：取3μL DNA点样于1％的琼脂糖凝胶(EB染色液)上，同时点5μL标准分子量DL 2000 DNA Marker作为参照。15V/cm条件下电泳，然后在凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。

1.2 miR-27a启动子生物信息学分析

根据GeneBank山羊miR-27a前体序列(GeneBank登录号NC_030814)，利用NCBI数据库检索工具往前延伸1000bp，利用JASPAR数据库(http://jaspar.genereg.net/)对该区域进行转录因子扫描，结果发现343-361位核苷酸(序列为GCTGCTGCCACACCCAGGG)为转录因子CP2(GeneBank登录号NC_030812.1)的结合区域。

1.3引物设计

以miR-27a前体启动子区为模板，利用Primer 5设计用于扩增获得山羊miR-27a前体的5’UTR区片段的Touch-down PCR引物(5’端分别添加NheI和HindIII酶切位点及保护碱基见引物中下划线部分)，引物序列如下：

上游引物：5'-CTAGCTAGCAGTGGTTTCCTCCTGCCCTTCA-3'(对应于SEQ ID NO：3)

下游引物：5'-CCCAAGCTCCCTTGCCGCCATCCTTTG-3'(对应于SEQ ID NO：4)

1.4扩增山羊miR-27a启动子片段和回收

利用设计的引物SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，以山羊全基因组DNA为模板，通过Touch-down PCR扩增得到山羊miR-27a启动子的5’UTR片段，该片段全长为678bp(见图2)。Touch-down PCR反应程序见表1。PCR反应体系见表2。

表1 Touch-down PCR反应程序

表2 PCR反应体系(50μL)

组分	体积(μL)
		PCR Mix	25
0.5μmol/L上游引物	0.5
		0.5μmol/L下游引物	0.5
DNA	50-200ng
		加去离子水至	50

取5μL PCR扩增产物，加0.5μL Loading Buffer(试剂盒自带)，混匀后点样于2％的琼脂糖凝胶上，以5μL DNA标准分子量DL 2000Marker作为参照，15V/cm电泳，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果并拍照保存。

PCR产物采用Omega Bio-tek公司的凝胶回收试剂盒切胶回收，具体操作步骤按照该试剂盒说明书进行。

1.5克隆并测序验证

回收后的PCR产物连接宝生物工程大连有限公司生产的pMD18-T载体(见图5)，连接反应总体系10μL，置于16℃条件下连接1h。PCR反应体系见表3。

表3 PCR反应体系(10μL)

无菌条件下取10μL连接产物加入到50μL DH5α感受态细胞中，混匀后静置冰浴30min，42℃热激90s，立即置于冰上2-3min，加入400μL不含AMP抗生素的LB液体培养基，置于37℃恒温摇床培养45min，低速离心(<5000g)，留150μL上清，其余弃除。将剩余上清吹打混匀然后均匀涂布于平板(含有100mg/L的Amp)上，平放于37℃恒温培养箱中约1h，之后倒置过夜培养。

用小枪头挑取平板上形态正常的单菌落，置于含400μL LB液体培养基(附加100mg/L Amp)的1.5mL Ependorff管中，于37℃恒温摇床培养8h。取lμL菌液作为PCR扩增的模板，PCR扩增体系和程序参见1.4。PCR扩增产物用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统中拍照记录。

经菌液PCR检测，结果为阳性的含重组质粒的菌液送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。

2.构建山羊miR-27a启动子5’UTR荧光素酶报告载体

2.1载体pGL3 Basic扩增

载体pGL3 Basic(见图6)，经过大肠杆菌DH5α扩增后，使用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒(Omega E.Z.N.A.TM Endo-Free PlasmidMini KitISpin)进行抽提载体DNA，具体步骤见试剂盒的说明书。

2.2双酶切

由2.1中抽提的pGL3 Basic质粒和1.4中回收纯化的PCR产物，分别用NheI和HindIII限制性内切酶进行双酶切，所用内切酶均购自NEB。双酶切反应体系见表4。

表4 双酶切反应体系(10μL)

组分	体积(μL)
		NheⅠ	0.5
HindⅢ	0.5
		Buffer	1
质粒1	4
		质粒2	4

体系于37℃酶切3h。酶切产物在2％琼脂糖凝胶电泳，采用过柱离心的方法回收。

2.3连接

将酶切后纯化的载体pGL3 Basic和miR-27a的5’UTR片段，用T4连接酶16℃连接2h。连接体系见表5。

表5 连接体系(10μL)

组分	体积(μL)
		5’UTR片段	7
pGL3 Basic	1
		T4 DNA Ligase	1
Buffer	1

2.4克隆并测序验证

采用1.5中的方法进行重组载体pGL3-W的克隆和测序验证。

2.5重组质粒的抽提

使用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒(Omega E.Z.N.A.TM Endo-FreePlasmidMini KitISpin)进行抽提载体DNA，具体步骤见试剂盒的说明书。

3.构建转录因子CP2结合位点突变型荧光素酶报告载体

3.1结合位点突变型引物设计

先将转录因子CP2的结合位点GCTGCTGCCACACCCAGGG突变为GCTATGATACTACCCAGGG，下划线部分为突变的8个碱基位点。利用Primer 5设计用于扩增的突变型PCR引物，突变型引物完全互补，具体引物序列如下：

正向引物：5'-TGGTATCTTTAGCTATGATACTACCCAGGGATGGGG-3'(对应于SEQ ID NO：5)

反向引物：5'-CCCCATCCCTGGGTAGTATCATAGCTAAAGATACCA-3'(对应于SEQ ID NO：6)

3.2重叠片段的扩增

将SEQ ID NO：3的序列作为上游引物，SEQ ID NO：6的序列作为下游引物，扩增出重叠片段SEQ ID NO：7；将SEQ ID NO：5序列作为上游引物和SEQ ID NO：4的序列作为下游引物，扩增出重叠片段SEQ ID NO：8(见图3)。SEQ ID NO：7和SEQ ID N：8重叠部分为TGGTATCTTTAGCTATGATACTACCCAGGGATGGGG(下划线部分为突变后的碱基序列)。

3.3重叠片段的融合

SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所述的片段需要通过融合PCR程序(见表6)进行连接，将二者连接为一体，形成与如1.4中除突变位点外均完全一致的678bp片段(图4)。

表6 融合PCR程序(10μL)

3.4突变型片段的扩增

以3.3中的转录因子CP2结合位点突变后的重叠片段为模板，仍然使用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的序列为引物，利用Touch-down PCR扩增得到目的片段。具体步骤参见1.4所述。

3.5突变型载体构建

构建方法同2中所述，测序结果如SEQ ID NO：9所示。

4.山羊野生型和突变型转录因子CP2荧光素酶报告载体的应用

4.1利用荧光报告载体转染CHO(仓鼠卵巢细胞)细胞

(1)在转染前1天，5×104细胞接种于24孔板内，继续培养至细胞密度到80％；

(2)将每孔转染的0.8μg质粒加入50μL OPTI-MEM培养基(购于Hyclone公司)中混匀，取2.0μL Lipofectamine 2000和1/20μg pRL-TK(图7)加入50μL OPTI-MEM培养基中混匀，将上述两份混合液在室温下静置5min；

(3)将步骤(2)中的两份混合液混合均匀，室温静置20min；(4)期间吸除各孔中原有的细胞培养基，用OPTI-MEM清洗两遍；

(5)将每孔细胞加入步骤(3)中混合液100μL，后用OPTI-MEM补至为500μL；

(6)置于37℃，5％CO₂细胞培养箱培养24h后收集细胞，利用1×PLB(Passivelysis buffer，试剂盒自带)裂解细胞，将获得的蛋白置于-70℃冰箱中保存。

4.2双荧光素酶活性检测

利用Dual-LuciferaseReporter Assay System在多功能酶标仪中检测荧光载体的相对荧光活性：吸取10μL 2.6.2.4中获得的细胞裂解液加入酶标板中，首先加入50μL的LARⅡ读取样品中荧火虫荧光素酶的活性值A，加入50μL的Stop&Glo Reagent读取样品中海肾荧光素酶的活性值B。A/B比值即代表该荧光载体的活性，采用SAS8.0软件对所得结果进行单因素方差分析，P<0.05时为差异显著，P<0.01时为差异极显著。相对荧光活性检测结果如图8所示。结果表明，相对于阴性对照Basic而言，pGL3-W载体的荧光活性有显著的上升，说明构建pGL3-W载体的miR-27a启动子片段具有活性，当对该启动子片段中的转录因子CP2的结合位点进行突变修饰后丧失了与CP2蛋白的结合能力，所构建的突变型载体pGL3-M的荧光活性较之pGL3-W有显著的升高，说明转录因子CP2对于miR-27a启动子的荧光活性具有抑制作用，进而得出结论CP2较有可能抑制miR-27a的表达。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种山羊miR-27a定点修饰系统及其应用

<130>

<141> 2016-11-07

<160> 9

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1083

<212> DNA

<213> 山羊

<220>

<221> promoter

<222> (1)..(1083)

<223>

<400> 1

aggcctggcc actgaggaga cgggaccatg gggggaggcc ctagtggttt cctcctgccc 60

ttcaggcttc taggaagtgg cgccagctgg ggtgagatca cttcctcagc cgcctgcccg 120

ccaccccctc agcttcctct ccccatggcc ccatttagcc tgcccagggc tccgtgctgc 180

gggcggggcg ggggtggggg tgggggctcg gccaaggaat ggagtgggtg ctggctctgg 240

gagttcctac agcctccttg gccgaaagtg actctgtggg tatctctact tctctgggtc 300

tgggaagcct ggctgggggt gtccagcctg gtggtatctt tagctgctgc cacacccagg 360

gatgggggag cctggagggc tgccgtctat ggggtcgcac agagtcggac acgactgaag 420

cgacttagcc gcagcagcag cacatgcgga aggccttccc gggtggcgct agtggtaaag 480

agcccgcctg ccaacgcagg agacaagaga acgagggttc gatccctggg tggcgaagat 540

tccctggagg agggcatggc aacccactcc agtattcttg cctggagaat cccatggaca 600

ggggagcctg atgggctata gtccgtgggg tcgcaagagt cagacacgac tgaagcgacg 660

gcacggacgc acatggggaa agcggcttct ctgcgagacc tcaaaggatg gcggcaaggg 720

gggacatgga aggcaggtgt cctcaaatct cacgacctcc tttcgtctct cctaggtgcc 780

agctgctggc cctgcccggt gccctgcccc tcgaccctgg tgccatggcc ggctggggtt 840

cctggggatg ggatttgctg cctgtcacaa atcacattgc cagggatttc caaccgaccc 900

tgagccctgc ctccggggcc gccactgcca ctgccgccgc tgaggacgct gaccctgggg 960

atggggatgg ggtggcagag aggcccccac cgctcacatc tggcctgggg agcagggctt 1020

agctgcttgt gagcaggtcc acatcaagtc gtgttcacag tggctaagtt ccgccccccc 1080

ggg 1083

<210> 2

<211> 678

<212> DNA

<213> 山羊

<220>

<221> gene

<222> (1)..(678)

<223>

<400> 2

agtggtttcc tcctgccctt caggcttcta ggaagtggcg ccagctgggg tgagatcact 60

tcctcagccg cctgcccgcc accccctcag cttcctctcc ccatggcccc atttagcctg 120

cccagggctc cgtgctgcgg gcggggcggg ggtgggggtg ggggctcggc caaggaatgg 180

agtgggtgct ggctctggga gttcctacag cctccttggc cgaaagtgac tctgtgggta 240

tctctacttc tctgggtctg ggaagcctgg ctgggggtgt ccagcctggt ggtatcttta 300

gctgctgcca cacccaggga tgggggagcc tggagggctg ccgtctatgg ggtcgcacag 360

agtcggacac gactgaagcg acttagccgc agcagcagca catgcggaag gccttcccgg 420

gtggcgctag tggtaaagag cccgcctgcc aacgcaggag acaagagaac gagggttcga 480

tccctgggtg gcgaagattc cctggaggag ggcatggcaa cccactccag tattcttgcc 540

tggagaatcc catggacagg ggagcctgat gggctatagt ccgtggggtc gcaagagtca 600

gacacgactg aagcgacggc acggacgcac atggggaaag cggcttctct gcgagacctc 660

aaaggatggc ggcaaggg 678

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(31)

<223>

<400> 3

ctagctagca gtggtttcct cctgcccttc a 31

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(27)

<223>

<400> 4

cccaagctcc cttgccgcca tcctttg 27

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(36)

<223>

<400> 5

tggtatcttt agctatgata ctacccaggg atgggg 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> primer_bind

<222> (1)..(36)

<223>

<400> 6

ccccatccct gggtagtatc atagctaaag atacca 36

<210> 7

<211> 325

<212> DNA

<213> 山羊

<220>

<221> gene

<222> (1)..(325)

<223>

<400> 7

agtggtttcc tcctgccctt caggcttcta ggaagtggcg ccagctgggg tgagatcact 60

tcctcagccg cctgcccgcc accccctcag cttcctctcc ccatggcccc atttagcctg 120

cccagggctc cgtgctgcgg gcggggcggg ggtgggggtg ggggctcggc caaggaatgg 180

agtgggtgct ggctctggga gttcctacag cctccttggc cgaaagtgac tctgtgggta 240

tctctacttc tctgggtctg ggaagcctgg ctgggggtgt ccagcctggt ggtatcttta 300

gctatgatac tacccaggga tgggg 325

<210> 8

<211> 389

<212> DNA

<213> 山羊

<220>

<221> gene

<222> (1)..(389)

<223>

<400> 8

tggtatcttt agctatgata ctacccaggg atgggggagc ctggagggct gccgtctatg 60

gggtcgcaca gagtcggaca cgactgaagc gacttagccg cagcagcagc acatgcggaa 120

ggccttcccg ggtggcgcta gtggtaaaga gcccgcctgc caacgcagga gacaagagaa 180

cgagggttcg atccctgggt ggcgaagatt ccctggagga gggcatggca acccactcca 240

gtattcttgc ctggagaatc ccatggacag gggagcctga tgggctatag tccgtggggt 300

cgcaagagtc agacacgact gaagcgacgg cacggacgca catggggaaa gcggcttctc 360

tgcgagacct caaaggatgg cggcaaggg 389

<210> 9

<211> 678

<212> DNA

<213> 山羊

<220>

<221> gene

<222> (1)..(678)

<223>

<400> 9

agtggtttcc tcctgccctt caggcttcta ggaagtggcg ccagctgggg tgagatcact 60

tcctcagccg cctgcccgcc accccctcag cttcctctcc ccatggcccc atttagcctg 120

cccagggctc cgtgctgcgg gcggggcggg ggtgggggtg ggggctcggc caaggaatgg 180

agtgggtgct ggctctggga gttcctacag cctccttggc cgaaagtgac tctgtgggta 240

tctctacttc tctgggtctg ggaagcctgg ctgggggtgt ccagcctggt ggtatcttta 300

gctatgatac tacccaggga tgggggagcc tggagggctg ccgtctatgg ggtcgcacag 360

agtcggacac gactgaagcg acttagccgc agcagcagca catgcggaag gccttcccgg 420

gtggcgctag tggtaaagag cccgcctgcc aacgcaggag acaagagaac gagggttcga 480

tccctgggtg gcgaagattc cctggaggag ggcatggcaa cccactccag tattcttgcc 540

tggagaatcc catggacagg ggagcctgat gggctatagt ccgtggggtc gcaagagtca 600

gacacgactg aagcgacggc acggacgcac atggggaaag cggcttctct gcgagacctc 660

aaaggatggc ggcaaggg 678

Claims (4)

1.一种山羊miR-27a定点修饰系统,其特征在于：由山羊miR-27a的双荧光素酶报告基因载体pGL3-W和突变修饰后获得的载体pGL3-M构成，所述的pGL3-W载体包含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，pGL3-M载体包含有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，两段序列均位于山羊miR-27a的5’UTR，

通过如下步骤制备得到：

(1)以登录号为NC_030814的山羊miR-27a前体序列，利用NCBI数据库检索工具往前延伸1000bp为扩增模板，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；利用上述扩增模板，通过Touch-down PCR方法克隆获得miR-27a前体5’UTR片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)利用JASPAR数据库，预测得到山羊miR-27a的5’UTR启动子区中包含转录因子CP2的结合位点，其序列为GCTGCTGCCACACCCAGGG；

(3)将步骤(1)扩增得到的序列插入双荧光素酶报告基因载体pGL3中，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证和抽提重组质粒，获得野生型双荧光素酶报告基因载体pGL3-W，其序列如SEQ ID NO：2所示；

(4)将步骤(3)构建的pGL3-W载体，针对需要修饰的转录因子CP2结合位点，设计如SEQID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列的突变引物，利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示序列的引物对PCR扩增出如SEQ ID NO：7所示序列的目的片段；利用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4所示序列的引物对PCR扩增出如SEQ ID NO：8所示序列的目的片段；将SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8所示的序列通过融合PCR进行连接；以连接后产物为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示序列为引物对，得到PCR扩增产物，其序列如SEQ ID NO：9所示，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证、抽提重组质粒，得到转录因子CP2的结合位点突变型载体pGL3-M；

融合PCR的扩增条件为：95℃5min；95℃30s，30℃30s，35℃5s，40℃5s，45℃5s，50℃5，、55℃5s，60℃5s，65℃5s，72℃30s，共计30个循环；72℃10min；于4℃保存。

2.一种扩增山羊miR-27a的5’UTR区的Touch-down PCR引物对，其特征在于：所述引物对的序列如下所示：

上游引物：CTAGCTAGCAGTGGTTTCCTCCTGCCCTTCA，

下游引物：CCCAAGCTCCCTTGCCGCCATCCTTTG-3。

3.一种对山羊miR-27a启动子区中转录因子CP2结合位点进行突变修饰的PCR引物对，其特征在于：所述引物对的序列如下所示：

正向引物：TGGTATCTTTAGCTATGATACTACCCAGGGATGGGG，

反向引物：CCCCATCCCTGGGTAGTATCATAGCTAAAGATACCA。

4.一种用于非诊断目的的一种山羊miR-27a定点修饰系统的制备方法,其特征在于：所述的方法包括由山羊miR-27a的双荧光素酶报告基因载体pGL3-W和突变修饰后获得的载体pGL3-M构成，所述的pGL3-W载体包含有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，pGL3-M载体包含有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，两段序列均位于山羊miR-27a的5’UTR，

通过如下步骤制备得到：

(1)以登录号为NC_030814的山羊miR-27a前体序列，利用NCBI数据库检索工具往前延伸1000bp为扩增模板，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；利用上述扩增模板，通过Touch-down PCR方法克隆获得miR-27a前体5’UTR片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

(2)利用JASPAR数据库，预测得到山羊miR-27a的5’UTR启动子区中包含转录因子CP2的结合位点，其序列为GCTGCTGCCACACCCAGGG；

(3)将步骤(1)扩增得到的序列插入双荧光素酶报告基因载体pGL3中，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证和抽提重组质粒，获得野生型双荧光素酶报告基因载体pGL3-W，其序列如SEQ ID NO：2所示；

(4)将步骤(3)构建的pGL3-W载体，针对需要修饰的转录因子CP2结合位点，设计如SEQID NO：5和SEQ ID NO：6所示序列的突变引物，利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6所示序列的引物对PCR扩增出如SEQ ID NO：7所示序列的目的片段；利用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：4所示序列的引物对PCR扩增出如SEQ ID NO：8所示序列的目的片段；将SEQ ID NO：7和SEQ IDNO：8所示的序列通过融合PCR进行连接；以连接后产物为模板，以SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示序列为引物对，得到PCR扩增产物，其序列如SEQ ID NO：9所示，通过酶切、连接、转化感受态细胞、筛选阳性克隆并测序验证、抽提重组质粒，得到转录因子CP2的结合位点突变型载体pGL3-M；

融合PCR的扩增条件为：95℃5min；95℃30s，30℃30s，35℃5s，40℃5s，45℃5s，50℃5，、55℃5s，60℃5s，65℃5s，72℃30s，共计30个循环；72℃10min；于4℃保存。