CN110308123A - 一种用于ogt抑制剂高通量筛选的荧光报告分子 - Google Patents

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李玲
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Abstract

本发明涉及一种用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子，涉及分子生物学领域。包括荧光报告系统，所述荧光报告系统用于生成荧光报告分子，所述荧光报告分子包括转录因子、报告基因和内参基因。本方案解决了如何构建用于OGT抑制剂的高通量筛选的荧光报告分子的技术问题，适用于OGT抑制剂的高通量筛选。

Description

一种用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及一种用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子。
背景技术
许多研究表明异常的O-GlcNAc修饰与包括癌症在内的多种疾病的发生、发展密切相关。目前常用于检测O-GlcNAc修饰的方法多是依赖抗体进行的免疫组化染色或western-blot检测，虽然准确，但步骤繁琐，样品要求严格、所用抗体价格高，不适用于O-GLcNAc修饰的批量检测以及相关抑制剂的高通量筛选。
为了解决上述技术问题，还有人在代谢标记法的基础上引入FRET技术，即荧光共振能量转移技术，能够进行O-GlcNAc修饰的成像与检测，但是此类方法中有的只能进行细胞外检测，有的需要引入特殊化合物容易引起细胞毒性，适用性不高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何构建用于OGT抑制剂的高通量筛选的荧光报告分子。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子，包括：荧光报告系统，所述荧光报告系统用于生成荧光报告分子，所述荧光报告分子包括转录因子、报告基因和内参基因。
本发明的有益效果是：本方案的荧光报告系统是根据转录调控原理构建的，通过荧光报告系统生成包括转录因子、报告基因和内参基因的荧光报告分子，这样生成的荧光报告分子能够检测细胞内O-GlcNAc修饰水平下调的情况，例如：响应不同浓度的OGT抑制剂——OSMI-1和HBP通路的抑制剂——DON。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述转录因子为功能受O-GlcNAc修饰影响的转录因子TF。
进一步，所述报告基因包括1条活性受转录调控的转录启动子和所述转录启动子驱动表达的增强型绿色荧光蛋白eGFP。
采用上述进一步方案的有益效果是，这样设置后，在O-GlcNAc修饰水平发生变化时，转录因子的功能受到影响，作用到报告基因上改变转录启动子的活性，荧光蛋白的表达量随之改变，通过荧光值的变化反应O-GlcNAc修饰水平的变化。
进一步，所述内参基因包括CMV启动子和所述CMV启动子驱动表达的红色荧光蛋白RFP。
采用上述进一步方案的有益效果是，这样设置后的内参基因能够稳定表达，相比常规的内参基因，本方案的内参基因有光，能够排除因转染效率导致的差异。
进一步，所述报告基因和所述内参基因之间间隔有转录终止序列和翻译终止序列。
采用上述进一步方案的有益效果是，这样设置后，报告基因和内参基因这两个部分是相互独立的，不会产生干扰。
进一步，所述转录因子为功能上受O-GlcNAc修饰影响的转录因子NeuroD1。
采用上述进一步方案的有益效果是，这样的荧光报告分子可以准确检测细胞内O-GlcNAc修饰水平下调的情况，例如：响应不同浓度的OGT抑制剂——OSMI-1和HBP通路的抑制剂——DON。
进一步，所述第二报告基因IG为胰岛素启动子IP驱动表达的增强型绿色荧光蛋白eGFP，其中所述第二报告基因IG受所述转录因子NeuroD1的调控。
进一步，所述内参基因CR是CMV启动子驱动表达的红色荧光蛋白RFP。
进一步，所述报告基因和内参基因之间间隔有转录终止信号和翻译终止密码子，将所述转录因子NeuroD1通过P2A连在红色荧光蛋白RFP下游，使转录因子NeuroD1和红色荧光蛋白RFP共用一个CMV启动子。
采用上述进一步方案的有益效果是，P2A为一段自我剪切肽链，通过P2A能够将转录因子NeuroD1和红色荧光蛋白RFP彼此分开，各自发挥功能。
本发明附加的方面的优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明实践了解到。
附图说明
图1为本发明用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子的实施例的荧光报告分子结构示意图；
图2本发明用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子的其它实施例的荧光报告分子结构示意图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例基本如附图1所示，其中promoter为启动子，TF为转录因子TF，G为O-GlcNAc修饰蛋白，eGFP为增强型绿色荧光蛋白eGFP，TAA为终止密码子，polyA为转录终止信号，CMV为CMV启动子，RFP为红色荧光蛋白RFP。
本实施例中用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子，包括：荧光报告系统，荧光报告系统用于生成荧光报告分子，荧光报告分子包括转录因子、报告基因和内参基因。
本发明的有益效果是：本方案的荧光报告系统是根据转录调控原理构建的，通过荧光报告系统生成包括转录因子、报告基因和内参基因的荧光报告分子，这样生成的荧光报告分子能够检测细胞内O-GlcNAc修饰水平下调的情况，也可以响应不同浓度的OGT抑制剂——OSMI-1和HBP通路的抑制剂——DON。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
可选的，在一些其它实施例中，转录因子为功能受O-GlcNAc修饰影响的转录因子TF。
可选的，在一些其它实施例中，报告基因包括1条活性受转录调控的转录启动子和转录启动子驱动表达的增强型绿色荧光蛋白eGFP。
这样设置后，在O-GlcNAc修饰水平发生变化时，转录因子的功能受到影响，作用到报告基因上改变转录启动子的活性，荧光蛋白的表达量随之改变，通过荧光值的变化反应O-GlcNAc修饰水平的变化。
可选的，在一些其它实施例中，内参基因包括CMV启动子和CMV启动子驱动表达的红色荧光蛋白RFP。
这样设置后的内参基因能够稳定表达，相比常规的内参基因，本方案的内参基因有光，能够排除因转染效率导致的差异。
可选的，在一些其它实施例中，报告基因和内参基因之间间隔有转录终止序列和翻译终止序列。
这样设置后，报告基因和内参基因这两个部分是相互独立的，不会产生干扰。
可选的，如附图2所示，其中，图2的insulin promoter为胰岛素启动子IP；eGFP为增强型绿色荧光蛋白eGFP，即第二报告基因IG；TAA为终止密码子；polyA为转录终止信号；CMV为CMV启动子；RFP为红色荧光蛋白RFP，即内参基因CR；P2A为具有自我剪切功能的短肽P2A；NeuroD1为转录因子NeuroD1；在一些其它实施例中；转录因子为功能上受O-GlcNAc修饰影响的转录因子NeuroD1。
这样的荧光报告分子可以准确检测细胞内O-GlcNAc修饰水平下调的情况，也可以响应不同浓度的OGT抑制剂——OSMI-1和HBP通路的抑制剂——DON。
可选的，在一些其它实施例中，第二报告基因IG为胰岛素启动子IP驱动表达的增强型绿色荧光蛋白eGFP，其中第二报告基因IG受转录因子NeuroD1的调控。
可选的，在一些其它实施例中，内参基因CR是CMV启动子驱动表达的红色荧光蛋白RFP。
可选的，在一些其它实施例中，报告基因和内参基因之间间隔有转录终止信号和翻译终止密码子，将转录因子NeuroD1通过P2A连在红色荧光蛋白RFP下游，使转录因子NeuroD1和红色荧光蛋白RFP共用一个CMV启动子。
P2A为一段自我剪切肽链，通过P2A能够将转录因子NeuroD1和红色荧光蛋白RFP彼此分开，各自发挥功能。
需要说明的是，上述各实施例是与上述各方法实施例对应的产品实施例，对于本实施例中各结构装置及可选实施方式的说明可以参考上述各方法实施例中的对应说明，在此不再赘述。
读者应理解，在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
所属领域的技术人员可以清楚地了解到，为了描述的方便和简洁，上述描述的装置和单元的具体工作过程，可以参考前述方法实施例中的对应过程，在此不再赘述。
以上，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求的保护范围为准。

Claims (9)

1.一种用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子，其特征在于，包括：荧光报告系统，所述荧光报告系统用于生成荧光报告分子，所述荧光报告分子包括转录因子、报告基因和内参基因，所述报告基因为第一报告基因或第二报告基因IG。
2.根据权利要求1所述的用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子，其特征在于：所述转录因子为功能受O-GlcNAc修饰影响的转录因子TF。
3.根据权利要求2所述的用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子，其特征在于：所述第一报告基因包括1条活性受转录调控的转录启动子和所述转录启动子驱动表达的增强型绿色荧光蛋白eGFP。
4.根据权利要求2所述的用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子，其特征在于：所述内参基因包括CMV启动子和所述CMV启动子驱动表达的红色荧光蛋白。
5.根据权利要求1所述的用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子，其特征在于：所述报告基因和所述内参基因之间间隔有转录终止序列和翻译终止序列。
6.根据权利要求1所述的用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子，其特征在于：所述转录因子为功能上受O-GlcNAc修饰影响的转录因子NeuroD1。
7.根据权利要求6所述的用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子，其特征在于：所述第二报告基因IG为胰岛素启动子IP驱动表达的增强型绿色荧光蛋白eGFP，其中所述第二报告基因IG受所述转录因子NeuroD1的调控。
8.根据权利要求6所述的用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子，其特征在于：所述内参基因CR是CMV启动子驱动表达的红色荧光蛋白RFP。
9.根据权利要求1所述的用于OGT抑制剂高通量筛选的荧光报告分子，其特征在于：所述报告基因和内参基因之间间隔有转录终止信号和翻译终止密码子，将所述转录因子NeuroD1通过P2A连在红色荧光蛋白RFP下游，使转录因子NeuroD1和红色荧光蛋白RFP共用一个CMV启动子。
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