CN107460192A - 一种c‑Myc蛋白可结合DNA片段及在c‑Myc活性检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种c‑Myc蛋白可结合的DNA片段，其包含一个或多个c‑Myc蛋白结合框，每个c‑Myc蛋白结合框的序列为5'‑SCACGTGS‑3'，S表示C或G；还涉及该DNA片段的应用；还涉及一种用于检测细胞内c‑Myc蛋白转录调控活性的方法。通过使用本发明的DNA片段和方法，可直接针对性地检测细胞内c‑Myc蛋白的转录调控活性，而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量，从而使得能够更准确地分析c‑Myc蛋白作为转录因子在一些疾病发展中所起的作用。

Description

一种c-Myc蛋白可结合DNA片段及在c-Myc活性检测中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，更特别地，涉及一种c-Myc蛋白可结合的DNA片段及其在检测细胞内c-Myc转录调控活性中的应用。

背景技术

c-Myc是细胞周期相关转录因子Myc家族成员之一，能调控细胞凋亡、细胞周期进程、细胞代谢重编程。c-Myc基因定位于染色体8q24，主要通过扩增和染色体易位重排的方式激活，与肿瘤的发生、发展和演变转归密切相关。c-Myc基因在人类粒细胞性白血病、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、肺癌、结肠癌、成骨肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、脂肪肉瘤、横纹肌肉瘤等肿瘤组织中扩增和过度表达，与肿瘤的早期复发有关。

c-Myc蛋白在结构上可分为转录激活区、非特异DNA结合区、核定位序列、碱性区、螺旋-环-螺旋(HLH)及亮氨酸拉链区。c-Myc蛋白HLH区紧随着碱性区，当该碱性区以特殊方式结合至DNA上时，可变成螺旋结构，c-Myc蛋白发挥转录因子作用。

目前检测c-Myc有多种方法，western blot或qPCR等方法虽然灵敏度高，但检测到的只是c-Myc蛋白含量的差异，不能体现出c-Myc结合其特异靶序列后活性的改变情况。

因此，需要一种简单可靠的检测内源性c-Myc转录调控活性的方法。

发明内容

发明人通过研究发现，c-Myc蛋白结合的DNA序列存在高度的保守性，其结合的DNA核心序列为5'-SCACGTGS-3'(S表示C或G)。

基于以上研究，本发明提供了一种c-Myc蛋白可结合的DNA片段，其包含一个或多个c-Myc蛋白结合框，每个所述c-Myc蛋白结合框的序列独立地为5'-SCACGTGS-3'，S表示C或G。

在一个优选实施方案中，当包含多个c-Myc蛋白结合框时，每两个相邻的c-Myc蛋白结合框之间具有间隔序列，并且每两个相邻的c-Myc蛋白结合框之间的所述间隔序列为AT。

在一个优选实施方案中，序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还提供了上述DNA片段在检测细胞内c-Myc转录调控活性中的应用。

本发明还提供了一种用于检测细胞内c-Myc转录调控活性的方法，其包括以下步骤：

S1：将包括上述DNA片段以及连接于所述DNA片段下游的报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞；

S2：通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内c-Myc转录调控活性。

在一个优选实施方案中，所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统，包括重组质粒和对照质粒，并且所述重组质粒带有所述DNA片段以及连接在所述DNA片段下游的荧光素酶I的表达框，所述对照质粒带有荧光素酶II的表达框，所示荧光素酶I与所述荧光素酶II不同。

在一个实施方案中，所述重组质粒通过将所述DNA片段插入至质粒pGL3-Basic的Kpn I与Hind III位点之间得到。

在一个实施方案中，所述对照质粒为phRL-TK。

在一个实施方案中，S1具体包括：

S11：将所述细胞培养至贴壁，并恢复形态；

S12：将所述重组质粒和对照质粒转染至细胞中。

在一个优选实施方案中，S2具体包括：

S21：转染后将细胞继续培养24-36小时，洗涤细胞；

S22：分别检测转染后的细胞中的荧光素酶I和荧光素酶II的活性；

S23：将荧光素酶II活性归一化荧光素酶I活性得到值作为衡量c-Myc转录调控活性的指标。

通过使用本发明的DNA片段和方法，可直接针对性地检测细胞内c-Myc的转录调控活性，而非仅仅检测其转录本或蛋白质的含量，从而使得能够更准确地分析c-Myc作为转录因子在一些疾病发展中所起的作用。

附图说明

图1为Kpn I与Hind III对重组质粒进行双酶切后的琼脂糖凝胶电泳照片；

图2为分别转染有pGL3-Basic和pGL3-c-Myc-Luc的293、PC-3和HeLa细胞中的相对c-Myc活性(即，萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图；

图3为分别转染有pcDNA3.1空载体和pcDNA3.1-c-Myc的细胞中相对c-Myc活性(即，萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性的比值)的统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

1.构建c-Myc蛋白可结合的DNA片段

发明人对c-Myc进行研究分析，发现c-Myc蛋白结合的DNA序列为5'-SCACGTGS-3'(S表示C或G)，合成该DNA核心序列时，将这段DNA核心序列重复三次，以核心碱基附近出现频率较高的A/T碱基进行间隔，序列如SEQ ID NO:1所示，将该序列连接至携带萤火虫荧光素酶的表达载体(pGL3.0-Basic)中。

为保证载体构建的成功，在末端加入相应的限制性内切酶酶切位点的粘性末端，本例在5’端加入Kpn I酶切位点的粘性末端(CATGG)，在3’端加入Hind III酶切位点的粘性末端(TTCGA)，序列两边的粘性末端的设计有助于片段与载体的连接。

通过从头合成的方法，分别合成该片段的两条寡核苷酸链，其序列分别如SEQ IDNO:2和3所示，这两条寡核苷酸链皆由武汉擎科生物技术有限公司合成。两条寡核苷酸链互补配对后形成包含Kpn I酶切位点粘性末端和Hind III酶切位点粘性末端的双链DNA片段。100μl退火体系如下：Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)20μl、寡核苷酸链(50μM)各20μl，余下为ddH₂O。

充分混匀后，设置PCR仪程序进行退火反应，具体程序为：95℃退火2分钟(目的是让DNA oligo充分变性)；每90秒下降1℃，降至25℃后结束反应。DNA退火产物用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定(由于DNA片段较小，电泳鉴定无法看到单一、特异的条带)，测浓度后置冰上备用。

2.将c-Myc蛋白可结合的DNA片段插入荧光素酶表达载体

用内切酶Kpn I和Hind III(购自TAKARA公司，Kpn I货号为1618，Hind III货号为1615)对上述pGL3-Basic空载体进行双酶切，20μl酶切体系如下：10x QuickCut Greenbuffer 2μl，Kpn I 1μl，Hind III 1μl，pGL3-Basic空载体1μg，余下为ddH₂O。

充分混匀后，37℃酶切反应90分钟，用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒双酶切后的情况，然后切胶回收(DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，货号为DP209)，回收结束后测样品浓度，置冰上备用。

将退火得到的双链DNA连接至pGL3-Basic荧光素酶表达载体上。10μl连接体系如下：DNA连接酶(购自TAKARA公司，货号为6022)5μl，双链DNA片段与经双酶切的pGL3-Basic载体共5μl。为促进酶连成功率，将DNA片段与载体的摩尔比控制在10:1左右。充分混匀后，将酶连体系置于PCR仪中，16℃反应1小时，连接反应结束后得到重组质粒，置于冰上备用。

将重组质粒(含有c-Myc蛋白可结合的DNA片段的pGL3-Basic表达载体)转化至大肠杆菌。按照经典的热激法进行转化，具体方法如下：从-80℃冰箱中取出大肠杆菌感受态细胞DH5α置于冰上解冻2分钟，加入上述连接好的重组质粒，轻轻混匀，冰上孵育20分钟，然后42℃热激90秒，迅速放至冰上静置2分钟，然后加入450μl不含抗生素的无菌LB液体培养基，放置于恒温摇床中复苏1小时，恒温摇床温度设置为37℃，转速为200转/分钟。取复苏后的菌液200μl均匀涂布于直径为3.5厘米含氨苄青霉素的LB固体选择培养基中，吸收10分钟后，倒置于37℃恒温培养箱中过夜。次日，挑取单菌落至5ml含氨苄青霉素的LB液体培养基中，放置于恒温摇床中摇菌繁殖，恒温摇床温度设置为37℃，转速为200转/分钟，12小时后提取质粒，质粒提取结束后用1.5％普通琼脂糖凝胶电泳鉴定。

用内切酶Kpn I和Hind III(购自TAKARA公司，Kpn I货号为1618，Hind III货号为1615)对上述提取的质粒进行双酶切鉴定，本发明实施例双酶切鉴定如图1所示(泳道1为marker，泳道2显示为阳性克隆)。阳性质粒送至武汉擎科生物技术有限公司测序，确认DNA片段已整合至pGL3-Basic载体上。至此，含有c-Myc蛋白可结合的DNA片段的pGL3-Basic表达载体(以下均表示为pGL3-c-Myc-Luc)构建成功。

3.pGL3-c-Myc-Luc转染细胞

本发明实施例采用人前列腺癌细胞系PC-3、人宫颈癌细胞系HeLa、人源胚胎肾293细胞进行双荧光素酶实验。分别将对数期生长的细胞PC-3、HeLa和293均匀种植在24孔板内，每孔约10万个细胞，用10％胎牛血清，高糖DMEM培养基培养过夜。待细胞贴壁并恢复形态后，将报告基因系统相关质粒转染至细胞中(转染时细胞密度约为60-80％为宜)。使用的转染试剂为Neofect(购自零客创智生物科技有限公司，货号为TF20121201)。50μl转染体系如下：质粒0.5μg，Neofect转染试剂0.5μl，余下为无血清培养基。

本实验中使用的质粒分别为：pGL3-Basic空载体、pGL3-c-Myc-Luc(含有c-Myc蛋白可结合的DNA片段的pGL3-Basic表达载体)、phRL-TK(带有海肾荧光素酶基因的载体)、pcDNA3.1-c-Myc(c-Myc过表达质粒)。

4.计算c-Myc的活性

以海肾荧光素酶活性作为内参进行标准化，计算c-Myc活性。具体实验方法如下：转染后的细胞继续培养24-36小时，再弃培养基上清，用1xPBS清洗细胞3次，每次5分钟，清洗细胞时注意操作轻柔，避免正面吹打细胞。采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(购自盖宁生物科技有新公司，货号为GN201-01)进行检测。

本发明实施例为验证该报告基因系统是否具有活性，将pGL3-c-Myc-Luc重组质粒转染至细胞中，检测c-Myc报告基因系统的活性，测定结果如图2所示，处理组(转染pGL3-c-Myc-Luc)荧光活性明显高于对照组(转染pGL3-Basic空载体)。

本发明实施例为验证该报告基因系统是否可以特异性检测c-Myc活性，将pcDNA3.1-c-Myc转染至细胞，结果如图3所示，外源导入c-Myc后，阳性处理组(转染pcDNA3.1-c-Myc)荧光活性明显高于对照组(转染pcDNA3.1空载体)。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120> 一种c-Myc蛋白可结合DNA片段及在c-Myc活性检测中的应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aaccacgtgc tcatagggca cgtggtctat gaccacgtgc cc 42

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caaccacgtg ctcatagggc acgtggtcta tgaccacgtg ccca 44

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcttgggca cgtggtcata gaccacgtgc cctatgagca cgtggttggt ac 52

Claims (10)

1.一种c-Myc蛋白可结合的DNA片段，其特征在于，包含一个或多个c-Myc蛋白结合框，每个所述c-Myc蛋白结合框的序列独立地为5'-SCACGTGS-3'，S表示C或G。

2.根据权利要求1所述的DNA片段，其特征在于，当包含多个c-Myc蛋白结合框时，每两个相邻的c-Myc蛋白结合框之间具有间隔序列，并且每两个相邻的c-Myc蛋白结合框之间的所述间隔序列为AT。

3.根据权利要求2所述的DNA片段，其特征在于，序列如SEQ ID NO:1所示。

4.权利要求1-3中任一项所述的DNA片段在检测细胞内c-Myc转录调控活性中的应用。

5.一种用于检测细胞内c-Myc转录调控活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：将包括权利要求1-3中任一项所述的DNA片段以及连接于所述DNA片段下游的报告基因表达框的报告基因系统导入所述细胞；

S2：通过检测所述报告基因的表达来计算所述细胞内c-Myc转录调控活性。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述报告基因系统为双荧光素酶报告基因系统，包括重组质粒和对照质粒，并且所述重组质粒带有所述DNA片段以及连接在所述DNA片段下游的荧光素酶I的表达框，所述对照质粒带有荧光素酶II的表达框，所示荧光素酶I与所述荧光素酶II不同。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组质粒通过将所述DNA片段插入至质粒pGL3-Basic的Kpn I与Hind III位点之间得到。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述对照质粒为phRL-TK。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，S1具体包括：

S11：将所述细胞培养至贴壁，并恢复形态；

S12：将所述重组质粒和对照质粒转染至细胞中。

10.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，S2具体包括：

S21：转染后将细胞继续培养24-36小时，洗涤细胞；

S22：分别检测转染后的细胞中的荧光素酶I和荧光素酶II的活性；

S23：将荧光素酶II活性归一化荧光素酶I活性得到值作为衡量c-Myc转录调控活性的指标。