CN105296652B - 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法 - Google Patents

采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105296652B
CN105296652B CN201510838063.9A CN201510838063A CN105296652B CN 105296652 B CN105296652 B CN 105296652B CN 201510838063 A CN201510838063 A CN 201510838063A CN 105296652 B CN105296652 B CN 105296652B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hsp40
chalcid fly
zhou shi
nibbles
fly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201510838063.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105296652A (zh
Inventor
李敏
张新玥
王凤竹
李婷婷
朱耿平
刘强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Normal University
Original Assignee
Tianjin Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Normal University filed Critical Tianjin Normal University
Priority to CN201510838063.9A priority Critical patent/CN105296652B/zh
Publication of CN105296652A publication Critical patent/CN105296652A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105296652B publication Critical patent/CN105296652B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种采用荧光RT‑PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40相对表达量的方法。本发明中周氏啮小蜂Hsp40实时荧光RT‑PCR检测方法的建立，为研究周氏啮小蜂Hsp40表达调控机理及其生态防治奠定基础。研究温度的变化对于周氏啮小蜂体内Hsp40基因表达量的影响，研究结果可为科学利用天敌昆虫周氏啮小蜂提供理论基础，这对于以后在何种室外温度下放飞周氏啮小蜂防治美国白蛾具有重要意义。本发明为在mRNA水平对Hsp40基因的相对定量分析提供了技术平台。

Description

采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法
本发明得到：国家自然科学基金（31201730）；天津市高等学校科技发展计划项目（20110602）；天津师范大学博士基金（52XB1003）及天津市动植物抗性重点实验室开放基金的资助。
技术领域
本发明涉及生物技术领域，涉及用于检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的特异性引物，更具体的说是一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法。主要用于周氏啮小蜂Hsp40基因表达调控机理及其生态防治的研究，研究结果可为科学利用天敌昆虫周氏啮小蜂进行生物防治提供理论基础。
背景技术
热激蛋白 Heat shock protein (Hsp) 是一类在生物体内广泛存在的，对体内外环境变化极为敏感的高保守性蛋白质，广泛参与了各种生理代谢途径，近年来已成为生物研究领域中的一个热点。根据其分子量的大小可将其分为不同的蛋白家族，其中Hsp40与温度胁迫应激性密切相关。温度是影响生物体生存至关重要的环境因子，只有在一定的温度范围内生物体才能进行物质能量代谢以维持正常生理活动，超出温度的耐受范围都会使生物的生长发育停滞甚至死亡。一般来说生物体受到高温或低温刺激后，蛋白合成量会有显著变化，用以增强抗逆境能力。由于热激蛋白会在胁迫消除后一段时间内保持一定的含量使生物体更好生存，可以认为其存在对于生物体适应环境有着重要作用。
周氏啮小蜂Chouioiacunea Yang 是我国重要入侵物种美国白蛾Hyphantriacunea（Drury）的重要寄生性天敌，体长1.1-1.5 mm，群集内寄生于美国白蛾蛹中，是抑制美国白蛾的主要天敌因子，对控制美国白蛾的危害起到重要作用。除寄生于美国白蛾外，还可寄生于鳞翅目的枯叶蛾科、毒蛾科、舟蛾科、尺蛾科、菜蛾科和双翅目的蝇科、寄蝇科及鞘翅目的叶甲科和瓢甲科等。
通过野外释放C. cunea可以达到有效防治美国白蛾的目的。然而，在野外环境下，C. cunea的活力会受到多重因素的影响，其中，温度作为一个主要生态因素，会影响C. cunea的生命力。在合适的温度范围投放小蜂，才会起到更好的防治效果。
实时荧光PCR技术是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光PCR不仅实现了常规PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光PCR技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。目前，已广泛应用于分子生物学和医学研究等领域。随着实时荧光PCR试剂盒的进一步开发，近年来，实时荧光PCR技术在动物生态防治中也得到了广泛的应用。
发明内容
本发明的目的是公开一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下:
设计一种采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的特异性引物，其特征在于包括符合荧光PCR反应特点的特异上下游引物：Hsp40-F：5'-AATGGGCGGCACCACTTA-3'; Hsp40-R：5'-CCACCAGGACCACCAAACT-3'；
以及作为内参基因的周氏啮小蜂GADPH基因特异性上下游引物：GADPH-F：5'-GAGGTGGTAGAGCCGCTTCC-3'; GADPH-R：5'-TTTAGCTTTGATCGCGTCGT-3'组成。
本发明所述特异性引物快速检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法，其特征在于按如下步骤进行：
（1）使用下述引物进行该基因的检测：
符合荧光PCR反应特点的该序列特异上下游引物：
Hsp40-F：5'-AATGGGCGGCACCACTTA-3'
Hsp40-R：5'-CCACCAGGACCACCAAACT-3'
以及作为内参基因的周氏啮小蜂GADPH基因特异性上下游引物：
GADPH-F：5'-GAGGTGGTAGAGCCGCTTCC-3'
GADPH-R：5'-TTTAGCTTTGATCGCGTCGT-3'
（1）总RNA的提取：采用各种通用的RNA提取方法，从周氏啮小蜂成体中提取总RNA；
（3）cDNA 合成：以周氏啮小蜂总RNA为模板合成cDNA，反应体系为20μL ；
（4）实时荧光PCR：以上述合成的cDNA为模板，上述（1）中Hsp40-F和Hsp40-R、GADPH-F和GADPH-R为特异性引物，进行实时荧光PCR 扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值取平均数。
（5）周氏啮小蜂在不同温度下Hsp40基因相对表达量计算：
实时荧光PCR后，当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用2法计算不同温度下Hsp40基因相对于内参GADPH基因的mＲNA相对表达量。
本发明所述的检测方法，其中每条引物分别配制成浓度为25 μmol/L 的贮存液，工作浓度为0.5 μmol/L。
本发明进一步公开了采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的特异性引在制备检测周氏啮小蜂适应外界环境变化方面的应用。实验结果表明：图1为不同温度下周氏啮小蜂Hsp40基因的相对表达量。从图中看出无论是高温还是低温都可以影响周氏啮小蜂体内的Hsp40的表达。在低温胁迫的情况下，随着温度的不断降低，周氏啮小蜂体内的Hsp40的相对表达量呈上升的趋势，并且在-7℃时达到最大表达量；在高温胁迫的情况下，随着温度的不断升高，周氏啮小峰体内的Hsp40的相对表达量也呈上升的趋势，但在40℃时达到最大表达量。这对于以后在何种室外温度下放飞白蛾周氏啮小蜂防治美国白蛾具有重要意义。
本发明提供的特异性引物快速检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法与现有技术相比的有益效果是：
（1）本发明采用的实时荧光RT-PCR技术与常规PCR 相比，实时荧光PCR 技术由自动化仪器收集荧光信号，避免了肉眼判断的主观性，可进一步提高灵敏度；实时荧光PCR技术全封闭反应，无须PCR后处理，避免污染，保证了结果的可靠性和重复性。实时荧光RT-PCR技术也免除了常规PCR 中的电泳、定量扫描等后续繁琐步骤，大大缩短了实验时间。
（2）在通过RT-qPCR 的方法研究不同温度下Hsp40基因表达的变化，结果显示在不同温度条件下周氏啮小蜂体内的Hsp40基因的表达水平处于一个动态过程中，高温和低温胁迫都使周氏啮小蜂体内Hsp40有一个高的表达量，在40℃和-7℃体内表达量最大。
（3）因此本发明提出研究了周氏啮小蜂适应外界环境的变化，避免受到胁迫因子对自身的伤害的保护机制，对于防治美国白蛾有重大意义，为绿色防治林业害虫提供了一个新的思路和技术。
周氏啮小蜂热激蛋白Hsp40基因，其cDNA序列和编码氨基酸的序列如序列表1、表2所示。
序列表
表2
MGKDYYKILGIAKGANDDEIKKAYRKLALKYHPDKNRAAGAEEKFKEIAEAYEVLSDAKKRDVYDKFGEEGLKGGAGGGSGGAGQGMGGTTYTFHGDPRATFAQFFGTASPFQTFFEFGGPGGGGSGNRMFFHDDDMETDDPFGLGGGMRQGAGIGPGGAFRSHSFNFAGPTGRVAGKERQQDPAIEHDLYVGLEDILRGCTKKMKISRRVVQPDGSTKKEDKVLTINVKPGWKAGTKITFQKEGDQGRGKVPADIVFIIRDKPHPQFRREGSDIRYTCKLSLKQALCGTVLEIPTLTGEKITLNVTREIVKPTTVKRIQGRGLPFPKEPSRKGDLLVSFDIKFPESLTQSAKDILYDTLPN。
附图说明
图1为周氏啮小蜂Hsp40在相同时间不同温度胁迫下表达变化。
具体实施方式
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售。本发明中所述的提取白蛾周氏啮小蜂总RNA的提取，cDNA的合成，实时荧光定量RT-qPCR等方法都是本领域成熟的技术，试剂盒TransScript®RT、TransStart® Top Green qPCR SuperMix等都可以从生产商家购买。
实施例1：
获得白蛾周氏啮小蜂Hsp40基因序列
实验材料取自室内传代培养的白蛾周氏啮小蜂（培养条件：于人工气候箱（PQX-350H）中，温度25℃，相对湿度60%~80%，无光黑暗）。取羽化后24 h内的雌性周氏啮小蜂，于解剖镜下切取触角，立即浸于RNAlater（Ambion公司，AM7020）中；每200头雌性白蛾周氏啮小蜂的触角贮存于一个1.5 mL离心管中，共搜集8管样品，并于-20℃下低温保存，样品制备完成后送华大基因科技服务有限公司（http://www.genomics.cn/index）进行转录组测序。
应用高通量测序平台Illumina HiSeq™ 2000对周氏啮小蜂触角样本进行转录组测序，采用Trinity 软件对每个读取序列片段进行聚类后拼接成unigene，再结合生物信息学软件进行靶标序列cDNA全长的判定，进行Blast同源序列检索予以确认，得到Hsp40基因cDNA序列和编码氨基酸的序列。
实施例2：
总RNA的提取
选取30头左右白蛾周氏啮小蜂进行不同温度处理，高温处理（1h）为28℃、32℃、36℃、40℃和42℃；低温处理（1h）为11℃、6℃、1℃、-3℃、-7℃。处理后产物立即使用或保存于-20℃冷冻。
（1）取30头左右白蛾周氏啮小蜂置于1.5mL的无菌离心管内，倒入液氮并迅速用研磨棒进行充分研磨。将600μL Trizon溶液加入离心管，静置5min。
（2）将200μL氯仿加入离心管，剧烈振荡15s，静置3min。
（3）4℃下12000rpm离心15min，将上层无色水相转入新无菌离心管中，加入400μL异丙醇，-20℃下放置20min，12000rpm离心10min。
（4）小心倒掉管中液体，保留沉淀，加入600μL 75%乙醇洗涤沉淀。4℃下7500rpm离心5min，再重复一次乙醇洗涤沉淀操作。
（5）小心弃去上清液，室温干燥2min。将RNA沉淀溶于20μLRelution Buffer中，必要时可55℃-60℃水浴10min。
（6）所得沉淀即为白蛾周氏啮小峰总RNA，产物立即使用或冷冻保存于-70℃。
实施例3：
cDNA的合成
以实施例2所述白蛾周氏啮小蜂总RNA 作为模板。取一消毒的0.2mL离心管，加入以下反应体系（20μL体系)：Total RNA 5μL，or Random Primer（N9）（0.1μg/μL）1μL，2×TSReaction Mix 10μL，TransScript®RT/RI Enzyme Mix 1μL，RNase-free Water 3μL，混匀。
反应条件为25℃水浴保温10分钟，42℃水浴保温30分钟，85℃高温加热5分钟，以使离心管中存留的TransScript®RT失去活性。产物立即使用或保存于-20℃冷冻。
实施例4：
荧光定量PCR反应体系和条件
(1) 引物设计：
根据所述周氏啮小蜂Hsp40基因的全长序列，使用Primer 5 软件设计适用于实时荧光PCR 检测的特异性引物，引物序列如下：
Hsp40-F：5'-AATGGGCGGCACCACTTA-3'
Hsp40-R：5'-CCACCAGGACCACCAAACT-3'
PCR 产物预计长度为 111 bp
同时，根据转录组数据库里提供的周氏啮小蜂GADPH基因的cds序列设计用于实时荧光PCR内对照的引物，引物序列如下：
GADPH-F：5'-GAGGTGGTAGAGCCGCTTCC-3'
GADPH-R：5'-TTTAGCTTTGATCGCGTCGT-3'
PCR 产物预计长度为154 bp
（2）实时荧光PCR：运用SYBR Green嵌合荧光法进行RT-PCR分析。使用CF96X PCR仪（Bio-Rad）进行PCR反应。以上述实施例3中合成的cDNA为模板，使用Hsp40-F和Hsp40-R、GADPH-F和GADPH-R为特异性引物，进行实时荧光PCR扩增反应，每个样品设3个平行管，扩增后所得3个平行管的Ct值（即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的反应循环数）取平均数。
实时荧光PCR 扩增体系设置如下：
实时荧光PCR 扩增参数设置如下：
（3）白蛾周氏啮小蜂在不同温度下Hsp40基因相对表达量计算：
当目的基因与内参基因的扩增效率相近时，采用2－ΔΔCT法计算各个温度下Hsp40基因相对于内参基因的的mＲNA相对表达量，用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，Duncan氏新复极差法检验不同处理间差异显著性。
图1为不同温度下周氏啮小蜂Hsp40基因的相对表达量。从图中看出无论是高温还是低温都可以影响周氏啮小蜂体内的Hsp40的表达。在低温胁迫的情况下，随着温度的不断降低，周氏啮小蜂体内的Hsp40的相对表达量呈上升的趋势，并且在-7℃时达到最大表达量；在高温胁迫的情况下，随着温度的不断升高，周氏啮小峰体内的Hsp40的相对表达量也呈上升的趋势，但在40℃时达到最大表达量。这对于以后在何种室外温度下放飞白蛾周氏啮小蜂防治美国白蛾具有重要意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津师范大学
<120> 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aatgggcggc accactta 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ccaccaggac caccaaact 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaggtggtag agccgcttcc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tttagctttg atcgcgtcgt 20
<210> 5
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgggcaaag attattacaa aatccttggc atagccaagg gcgccaacga cgacgagatc 60
aagaaagcct atcgcaagtt ggcactgaag tatcacccgg acaagaatcg cgctgccggc 120
gccgaggaga agttcaaaga gatcgccgag gcgtacgaag tgttgtcgga cgcgaaaaaa 180
cgcgacgtct acgacaaatt cggcgaggaa ggtctaaaag gtggagccgg tggtggcagc 240
ggtggagccg gccaaggaat gggcggcacc acttacactt tccacggcga tccacgcgcg 300
acgttcgcac agttcttcgg cacggcatcg cccttccaaa cgttcttcga gtttggtggt 360
cctggtggcg gcggcagcgg caatcgcatg ttcttccacg acgacgacat ggaaaccgac 420
gacccgtttg gcttgggcgg tggtatgagg caaggtgccg ggatcggacc gggcggcgcg 480
ttccgctcgc actcgttcaa ctttgctggg cccacaggtc gggtggctgg caaggaaaga 540
cagcaagatc cggcgatcga gcacgatctc tacgttggcc tcgaggatat cttgcgaggt 600
tgcacgaaaa agatgaaaat ctcgcgtcgc gtcgtgcagc cggatggttc caccaagaaa 660
gaggacaaag tacttacgat caacgtgaag cccggctgga aagccggtac aaagataacc 720
ttccagaagg aaggcgacca gggtcgaggt aaagtacccg ccgacattgt tttcatcatc 780
agggacaagc ctcatccgca attccgaaga gagggtagcg acatcaggta tacctgtaag 840
ctcagcttga agcaagcgct gtgcggcacg gtgctcgaga tcccaacgct caccggtgag 900
aaaatcacgc tgaacgtcac gagggaaatc gtcaaaccaa ccacggtcaa gaggattcaa 960
ggtcgcgggt tacctttccc caaggaacca tcgaggaaag gcgacctttt ggtttcgttc 1020
gacatcaagt tccccgagtc actgacgcag agcgccaagg acatactcta cgacacgctg 1080
cccaattaa 1089
<210> 6
<211> 362
<212> PRT
<213> 周氏啮小蜂热激蛋白Hsp40编码的氨基酸
<400> 6
Met Gly Lys Asp Tyr Tyr Lys Ile Leu Gly Ile Ala Lys Gly Ala Asn
1 5 10 15
Asp Asp Glu Ile Lys Lys Ala Tyr Arg Lys Leu Ala Leu Lys Tyr His
20 25 30
Pro Asp Lys Asn Arg Ala Ala Gly Ala Glu Glu Lys Phe Lys Glu Ile
35 40 45
Ala Glu Ala Tyr Glu Val Leu Ser Asp Ala Lys Lys Arg Asp Val Tyr
50 55 60
Asp Lys Phe Gly Glu Glu Gly Leu Lys Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ser
65 70 75 80
Gly Gly Ala Gly Gln Gly Met Gly Gly Thr Thr Tyr Thr Phe His Gly
85 90 95
Asp Pro Arg Ala Thr Phe Ala Gln Phe Phe Gly Thr Ala Ser Pro Phe
100 105 110
Gln Thr Phe Phe Glu Phe Gly Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asn
115 120 125
Arg Met Phe Phe His Asp Asp Asp Met Glu Thr Asp Asp Pro Phe Gly
130 135 140
Leu Gly Gly Gly Met Arg Gln Gly Ala Gly Ile Gly Pro Gly Gly Ala
145 150 155 160
Phe Arg Ser His Ser Phe Asn Phe Ala Gly Pro Thr Gly Arg Val Ala
165 170 175
Gly Lys Glu Arg Gln Gln Asp Pro Ala Ile Glu His Asp Leu Tyr Val
180 185 190
Gly Leu Glu Asp Ile Leu Arg Gly Cys Thr Lys Lys Met Lys Ile Ser
195 200 205
Arg Arg Val Val Gln Pro Asp Gly Ser Thr Lys Lys Glu Asp Lys Val
210 215 220
Leu Thr Ile Asn Val Lys Pro Gly Trp Lys Ala Gly Thr Lys Ile Thr
225 230 235 240
Phe Gln Lys Glu Gly Asp Gln Gly Arg Gly Lys Val Pro Ala Asp Ile
245 250 255
Val Phe Ile Ile Arg Asp Lys Pro His Pro Gln Phe Arg Arg Glu Gly
260 265 270
Ser Asp Ile Arg Tyr Thr Cys Lys Leu Ser Leu Lys Gln Ala Leu Cys
275 280 285
Gly Thr Val Leu Glu Ile Pro Thr Leu Thr Gly Glu Lys Ile Thr Leu
290 295 300
Asn Val Thr Arg Glu Ile Val Lys Pro Thr Thr Val Lys Arg Ile Gln
305 310 315 320
Gly Arg Gly Leu Pro Phe Pro Lys Glu Pro Ser Arg Lys Gly Asp Leu
325 330 335
Leu Val Ser Phe Asp Ile Lys Phe Pro Glu Ser Leu Thr Gln Ser Ala
340 345 350
Lys Asp Ile Leu Tyr Asp Thr Leu Pro Asn
355 360

Claims (1)

1.采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的特异性引物在制备检测周氏啮小蜂适应外界环境变化的 试剂盒方面的应用，其中所述的特异性引物它是由符合荧光RT-PCR反应特点的特异性上下游引物：
Hsp40-F：5'-AATGGGCGGCACCACTTA -3'；Hsp40-R：5'-CCACCAGGACCACCAAACT -3'；以及作为内参基因的周氏啮小蜂GADPH基因特异性上下游引物：GADPH-F：5'-GAGGTGGTAGAGCCGCTTCC-3'；GADPH-R：5'-TTTAGCTTTGATCGCGTCGT-3'组成。
CN201510838063.9A 2015-11-26 2015-11-26 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法 Expired - Fee Related CN105296652B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510838063.9A CN105296652B (zh) 2015-11-26 2015-11-26 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510838063.9A CN105296652B (zh) 2015-11-26 2015-11-26 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105296652A CN105296652A (zh) 2016-02-03
CN105296652B true CN105296652B (zh) 2018-07-06

Family

ID=55194471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510838063.9A Expired - Fee Related CN105296652B (zh) 2015-11-26 2015-11-26 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105296652B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107475368A (zh) * 2017-07-07 2017-12-15 安徽省农业科学院蚕桑研究所 一种荧光RT‑PCR技术检测意大利蜜蜂免疫基因defensin‑1表达的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1283702A (zh) * 1999-07-29 2001-02-14 霍夫曼-拉罗奇有限公司 通过分子伴侣的共分泌制备天然折叠的和分泌的蛋白质的方法
CN104694547A (zh) * 2015-02-13 2015-06-10 中国水产科学研究院南海水产研究所 斑节对虾热休克蛋白40基因及其编码的蛋白

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1283702A (zh) * 1999-07-29 2001-02-14 霍夫曼-拉罗奇有限公司 通过分子伴侣的共分泌制备天然折叠的和分泌的蛋白质的方法
CN104694547A (zh) * 2015-02-13 2015-06-10 中国水产科学研究院南海水产研究所 斑节对虾热休克蛋白40基因及其编码的蛋白

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Mass rearing and augmentative releases of the native parasitoid Chouioia cunea for biological control of the introduced fall webworm Hyphantria cunea in China;Zhongqi Yang等;《BioControl》;20060831;第51卷(第4期);全文 *
温度、补充营养和体型大小对白蛾周氏啮小蜂成虫寿命的影响;邱燕等;《林业科学研究》;20150720;第28卷(第3期);全文 *
白蛾周氏啮小蜂滞育诱导及滞育后发育;孙守慧等;《昆虫学报》;20091231;第52卷(第12期);第1310页结论与讨论部分 *
马铃薯甲虫热激蛋白基因Ld-hsp90的克隆及温度胁迫下的表达;蒋健等;《植物保护学报》;20131031;第40卷(第5期);第400-401页引言部分，材料与方法部分 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN105296652A (zh) 2016-02-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Priya et al. Differential expression pattern of rubber elongation factor (REF) mRNA transcripts from high and low yielding clones of rubber tree (Hevea brasiliensis Muell. Arg.)
CN113106108A (zh) 一种增强生防菌杀灭白蚁效果的双链核酸Dicer-1 dsRNA
CN105296652B (zh) 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp40基因表达的方法
CN105296651B (zh) 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp90基因表达的方法
CN105296480B (zh) 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp70基因表达的方法
CN105296654B (zh) 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp60基因表达的方法
CN1763223B (zh) miRNA检测方法
CN106636148B (zh) 一种飞蝗细胞色素P450还原酶基因dsRNA及其应用
CN105296653B (zh) 采用荧光RT-PCR技术检测周氏啮小蜂Hsp83基因表达的方法
CN105420244B (zh) 周氏啮小蜂热激蛋白Hsp90的cDNA全长序列及应用
CN105296498B (zh) 周氏啮小蜂热激蛋白Hsp40的cDNA全长序列及应用
CN105296496A (zh) 周氏啮小蜂热激蛋白Hsp70的cDNA全长序列及应用
Lee et al. Transcriptome response of previtellogenic ovary in Anguilla japonica after artificial hormone injection
CN107557366A (zh) 一种斜带石斑鱼天然免疫受体tlr13基因及其真核表达载体与应用
CN110951730B (zh) 青翅蚁形隐翅甲V-ATPase-A基因的dsRNA及其人工饲料和应用
CN110144351B (zh) 一种飞蝗脂肪酸合成酶基因LmFAS2的dsRNA及其制备方法和应用
CN101492687A (zh) 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe7基因及用途
CN105296497A (zh) 周氏啮小蜂热激蛋白Hsp83的cDNA全长序列及应用
CN109022598B (zh) 检测莲草直胸跳甲cp基因表达特性的引物及其方法
CN108611334A (zh) 桑树类糖原合成酶激酶基因及其检测和应用
CN109182549B (zh) 检测莲草直胸跳甲or基因转录水平的引物及方法
CN115807065B (zh) 一种热激蛋白Hsp70基因检测抗药性的捕食螨种群的方法
CN109055507B (zh) 检测莲草直胸跳甲ef基因表达特性的引物及方法
CN105400793B (zh) 烟草abcf内参基因的克隆方法及其应用
Anee et al. Expression of heat shock protein genes Aaehsp26, Aaehsp83 and Aaehsc70 in response to thermal stress in Aedes aegypti larvae

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180706

Termination date: 20181126

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee