CN101492687A - 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe7基因及用途 - Google Patents
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Abstract
一种家蚕谷胱甘肽－S－转移酶BmGSTe7基因，通过利用鳞翅目害虫小菜蛾有机磷抗性基因PxGST3蛋白质序列，在家蚕基因组中进行TBLASTN检索，获得了多个谷胱甘肽－S－转移酶同源基因，对比对得最好的家蚕BmGSTe7基因进行了克隆、表达、纯化以及酶活性的测定。其表达产物对模式底物CDNB(1－氯－2，4－二硝基苯)的活性为15μmol/min/mg protein。通过这一基因靶点，有望设计出防治鳞翅目害虫药物，而对其他目的有益昆虫无毒无害。因此在药物开发和害虫防治中有着重要的价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种来自于家蚕的具有抗农药或抗氧化活性的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe7基因。
背景技术
农药在害虫防治中起着非常重要的作用，但是随着大量农药的使用，昆虫抗药性日益加剧，迫使人们开发新的农药产品或加大药剂的用量，这不但制约了经济的发展，也给环境带来了严重的负担，影响到了经济和人类的可持续性发展。加之，昆虫抗农药与昆虫的抗氧化往往联系在一起，例如：昆虫在解毒代谢有机磷农药过程中，可能会产生一些活性氧等物质，从而诱导昆虫的氧化应激反应，因此昆虫在提高农药抗性的同时，抗氧化的能力也在随之增加。
谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-transferase，GSTs，EC 2.5.1.18)是一类重要的同工酶超家族，广泛分布在动物、植物、酵母、细菌等生物体中，具有消除内源和外源性有毒物质的功能。在昆虫体内它不但行使对多种有机合成农药的代谢外，而且也具有消除昆虫体内多余的自由基，保持体内的氧化与抗氧化的动态平衡。家蚕作为鳞翅目昆虫的模式生物，对家蚕GST基因进行克隆，以及对其功能进行研究，为阐明GSTs与杀虫剂抗性的关系，以及为农林害虫的防治有着重要的理论和实践意义。到目前为止，尚无有关家蚕的具有抗农药或抗氧化活性的基因的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种来自于家蚕的具有抗农药或抗氧化活性的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe7基因，通过对该基因更进一步的研究，可为研制防治鳞翅目害虫药物提供理论基础。
本发明申请人利用鳞翅目害虫小菜蛾有机磷抗性基因PxGST3(accession numberU66342)(Huang HS，Hu NT，Yao YE，et al.Molecular cloning and heterologus expression of aglutathione S-transferase involved in insecticide resistance from the diamondback moth Plutellaxylostella.Insect Biochemistry and Molecular Biology，1998，28：651-658)蛋白质序列，在家蚕基因组中进行TBLASTN检索，获得了多个谷胱甘肽-S-转移酶同源基因，对比对得最好的家蚕BmGSTe7基因进行了克隆、表达、纯化以及酶活性的测定。具体方法如下：
(1)首先以家蚕基因组中预测的编码区序列(coding sequence，CDS)，在家蚕表达序列标签(expressed sequence tag，EST)数据库中为BmGSTe7基因寻找EST证据，找到了2条EST序列，以CDS和EST序列为此基因设计特异性引物；BmGSTe7的正向引物：5’CATATGAGTCTAATGTTGTACAAACTA 3’，反向引物：5’GGATCCTACATTTTATAGATTAAGATCCA3’；正向引物和反向引物中分别加有NdeI和BamHI酶切位点；
(2)以设计的特异性引物在家蚕5龄3的脂肪体cDNA为模板进行扩增，获得了目的条带，PCR产物回收后与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海Sangon测序，测序结果表明扩增的序列与预期的结果一致；
(3)将含有目的片断的T克隆与pET28a空质粒分别用NdeI和BamHI进行双酶切，分别回收目的片断，以T4连接酶将其连接并转化Bl21(DE3)感受态细胞，筛选获得含有pET28a-BmGSTe7的克隆，提取质粒并送往上海Sangon测序，获得正确的克隆；将含有pET28a-BmGSTe7重组质粒的单克隆在含有卡那的LB培养基中37℃振荡培养，至OD600＝0.6左右，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，继续诱导培养5小时，取50ml菌液10000g离心5分钟收集菌体沉淀，以His标签纯化目的蛋白质，纯化方法按照pET宝典进行；目的蛋白对模式底物CDNB(1-氯-2，4-二硝基苯)的活性为15μmol/min/mgprotein；
(4)序列同源性分析：相似性比较在NCBI站点上用BLAST完成，BLAST分析表明，BmGSTe7与昆虫特异的Epsilon家族成员相似性较高；在家蚕基因组中BmGSTe7也是与鳞翅目害虫小菜蛾PxGST3基因比对得最好，其蛋白质序列的一致性为53％，而且BmGSTe7与模式底物CDNB有较高的活性，说明BmGSTe7为抗药性相关的重要基因。
上述方法获得的BmGSTe7基因完整的CDS及其推断的氨基酸序列如下：
atgagtctaatgttgtacaaactaaacgcgagccctccggcgcgcactgccatgatggtg
M S L M L Y K L N A S P P A R T A M M V
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C E L F K V P V K M V D V N L S K G E H
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D L I I T D S H A I A M Y L A D K Y G K
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G C K T V T E K Q I N D I I E A Y G Y V
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S A Y A V V S S L L F I V P L D G A K F
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P K T Q T W L N E M E K K P F A Q K Y N
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V N G V A E L G A L L K E K L G S -
BmGSTe7基因在制备防治鳞翅目害虫药物中的应用。
本发明的优点是：
通过小菜蛾中有机磷抗性基因PxGST3在家蚕基因组中同源性检索，获得了比对最好的BmGSTe7基因，我们并对其进行了克隆表达。其表达产物对模式底物CDNB(1-氯-2，4-二硝基苯)的活性为15μmol/min/mg protein。通过这一基因靶点，有望设计出防治鳞翅目害虫药物，而对其他目的有益昆虫无毒无害。因此在药物开发和害虫防治中有着重要的价值。
具体实施方式：
实施例：
以家蚕基因组中预测的编码区序列(Coding sequence，CDS)，在家蚕表达序列标签(Expressed sequence tag，EST)数据库中为BmGSTe7基因寻找EST证据，找到了2条EST序列，以CDS和EST序列拼接后设计基因特异性引物；BmGSTe7的正向引物：5’CATATGAGTCTAATGTTGTACAAACTA 3’，反向引物：5’GGATCCTACATTTTATAGATTAAGATCCA 3’；以设计的特异性引物在家蚕5龄3的脂肪体cDNA为模板进行扩增，获得目的条带，PCR产物回收后与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海Sangon测序，测序结果表明扩增的序列与预期的结果一致；将含有目的片断与pET28a，以T4连接酶连接并转化Bl21(DE3)感受态细胞，筛选获得含有pET28a-BmGSTe7的克隆，将含有pET28 a-BmGSTe7重组质粒的单克隆在含有卡那的LB培养基中37℃振荡培养，至OD600＝0.6左右，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，继续诱导培养5小时，取50ml菌液10000g离心5分钟收集菌体沉淀，以His标签纯化目的蛋白质，纯化方法按照pET宝典进行；目的蛋白对模式底物CDNB(1-氯-2，4-二硝基苯)的活性为15μmol/min/mgprotein；在NCBI站点上用BLAST完成序列同源性分析，表明BmGSTe7基因是一个新基因。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>西南大学
<120>家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe7基因
<130>
<140>
<141>
<160>1
<170>
<210>1
<211>654
<212>DNA
<213>家蚕(Bombyx mori)
<400>1
1 atgagtctaa tgttgtacaa actaaacgcg agccctccgg cgcgcactgc catgatggtg
61 tgtgaactct tcaaggttcc tgttaaaatg gttgacgtaa atttatccaa aggagaacat
121 ttttccccgg aatatttaaa gagaaaccct cttcacactg tacctactct agaagatggc
181 gacctgatta ttactgatag ccacgcgatt gcaatgtatc tcgccgacaa atatggaaaa
241 gacgatagtc tgtaccctaa agacttaaaa agcagagcaa tagtgaacca aaggttattc
301 tttgatagca cggtgttgtt ctctagaatg agaagtgtta cttttccagt cataattgaa
361 ggatgtaaaa ctgtcacgga gaagcaaatt aatgacatta tcgaagcata tggttatgtt
421 gaaacttatc tatcgaacac caaattcata gccaccaata acttgacgat tgctgacatt
481 tctgcctacg ccgtagtttc atctctcctt tttattgtgc ctttagatgg agccaaattc
541 cccaaaacac aaacgtggtt gaatgaaatg gaaaagaaac cttttgcaca gaaatataat
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<210>2
<211>217
<212>PRT
<213>家蚕(Bombyx mori)
<400>1
1 MSLMLYKLNA SPPARTAMMV CELFKVPVKM VDVNLSKGEH
FSPEYLKRNP LHTVPTLEDG
61 DLIITDSHAI AMYLADKYGK DDSLYPKDLK SRAIVNQRLF FDSTVLFSRM
RSVTFPVIIE
121 GCKTVTEKQI NDIIEAYGYV ETYLSNTKFI ATNNLTIADI SAYAVVSSLL
FIVPLDGAKF
181 PKTQTWLNEM EKKPFAQKYN VNGVAELGAL LKEKLGS
Claims (3)
1、一种家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe7基因，其特征在于其序列如下：
1 atgagtctaa tgttgtacaa actaaacgcg agccctccgg cgcgcactgc catgatggtg
61 tgtgaactct tcaaggttcc tgttaaaatg gttgacgtaa atttatccaa aggagaacat
121 ttttccccgg aatatttaaa gagaaaccct cttcacactg tacctactct agaagatggc
181 gacctgatta ttactgatag ccacgcgatt gcaatgtatc tcgccgacaa atatggaaaa
241 gacgatagtc tgtaccctaa agacttaaaa agcagagcaa tagtgaacca aaggttattc
301 tttgatagca cggtgttgtt ctctagaatg agaagtgtta cttttccagt cataattgaa
361 ggatgtaaaa ctgtcacgga gaagcaaatt aatgacatta tcgaagcata tggttatgtt
421 gaaacttatc tatcgaacac caaattcata gccaccaata acttgacgat tgctgacatt
481 tctgcctacg ccgtagtttc atctctcctt tttattgtgc ctttagatgg agccaaattc
541 cccaaaacac aaacgtggtt gaatgaaatg gaaaagaaac cttttgcaca gaaatataat
601 gtgaacggcg tggccgaatt gggcgcacta ttgaaagaga aacttggatc ttaa。
2、一种家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe7基因编码的蛋白质，其特征在于其序列如下：
1 MSLMLYKLNA SPPARTAMMV CELFKVPVKM VDVNLSKGEH FSPEYLKRNP LHTVPTLEDG
61 DLI ITDSHAI AMYLADKYGK DDSLYPKDLK SRAIVNQRLF FDSTVLFSRM RSVTFPVIIE
121 GCKTVTEKQI NDIIEAYGYV ETYLSNTKFI ATNNLTIADI SAYAVVSSLL FIVPLDGAKF
181 PKTQTWLNEM EKKPFAQKYN VNGVAELGAL LKEKLGS。
3、BmGSTe7基因在制备防治鳞翅目害虫药物中的应用。
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| CN102604906A (zh) * | 2012-03-27 | 2012-07-25 | 西南大学 | 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4及其基因 |
| CN103160524A (zh) * | 2013-03-27 | 2013-06-19 | 西南大学 | 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因 |
| CN107384882A (zh) * | 2017-08-22 | 2017-11-24 | 西南大学 | 一种家蚕基因的分子克隆与鉴定方法 |
-
2008
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| CN102604906B (zh) * | 2012-03-27 | 2013-06-19 | 西南大学 | 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTD4及其基因 |
| CN103160524A (zh) * | 2013-03-27 | 2013-06-19 | 西南大学 | 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因 |
| CN107384882A (zh) * | 2017-08-22 | 2017-11-24 | 西南大学 | 一种家蚕基因的分子克隆与鉴定方法 |
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| PB01 | Publication | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090729 |