CN103160524A

CN103160524A - 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因

Info

Publication number: CN103160524A
Application number: CN2013101227535A
Authority: CN
Inventors: 潘敏慧; 鲁成; 刘佳; 陈向云; 余泉友; 代方银; 向仲怀
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2013-03-27
Filing date: 2013-03-27
Publication date: 2013-06-19

Abstract

本发明公开了核苷酸序列如SEQIDNo.1所示的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因，其表达产物具有谷胱甘肽-S-转移酶（GSTs）活性，由于GSTs在昆虫的抗药性和抗氧化能力形成中发挥重要作用，而家蚕为鳞翅目昆虫模式生物，因此以BmGSTe4基因为靶标，有望设计出特异性杀灭鳞翅目害虫而对其它有益昆虫无害的生物防治药物；此外，本发明还发现BmGSTe4基因具有抑制细胞凋亡的作用，可作为抗癌药物筛选的潜在靶标。

Description

家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种家蚕谷胱甘肽-S-转移酶基因。

背景技术

农药在害虫防治中起着非常重要的作用，但是随着大量农药的使用，昆虫抗药性日益加剧，迫使人们开发新农药或加大农药的剂量，这不仅制约了经济的发展，也给环境带来了严重的负担，影响了经济和人类的可持续发展。另外，昆虫的抗药性与昆虫的抗氧化能力有一定相关性，例如，昆虫在解毒代谢有机磷农药过程中可能会产生一些活性氧，从而诱导昆虫的氧化应激反应，因此昆虫在提高农药抗性的同时，其抗氧化能力也在随之增加。如何利用当今发展迅速的基因工程技术，从根本上降低昆虫对农药的抗性，是农业害虫防治领域的重要研究课题。

谷胱甘肽-S-转移酶（Glutathione S-transferase, GSTs, EC 2.5.1.18）是一类重要的同工酶超家族，广泛分布于动物、植物、酵母、细菌等生物体中，具有消除内源和外源性有毒物质的功能。GSTs在昆虫体内不但对多种有机合成农药进行代谢，而且具有消除多余自由基，保持体内氧化与抗氧化的动态平衡的功能。与昆虫抗药性相关的GSTs主要是昆虫特异的Delta类及Epsilon类。目前，GSTs还被发现在控制细胞增殖与死亡的信号调节途径中扮演了重要角色，包括癌细胞的生长与分化、抗癌药物抗性的产生等，它们已成为抗癌药物筛选的靶标。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因，其表达产物具有GSTs活性。

经研究，本发明提供如下技术方案：

1.家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.含有所述家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因的重组表达载体。

进一步，所述重组表达载体为昆虫杆状病毒重组表达载体。

进一步，所述昆虫杆状病毒重组表达载体由以下方法制得：将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因插入pFastBacHTA杆状病毒转座载体的多克隆位点中，获得重组转座载体，再将所得重组转座载体转化含有杆状病毒穿梭载体的大肠杆菌DH10Bac，进行蓝白斑筛选，从白色菌落培养物中提取质粒DNA，即获得昆虫杆状病毒重组表达载体。

3.含有所述家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因的重组杆状病毒。

4.所述家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因编码的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的有益效果在于：本发明利用NCBI中已知的其它物种GST的Epsilon家族成员在家蚕基因组中检索，获得了Epsilon家族的同源基因，最终克隆出了家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因，其表达产物具有GSTs活性。由于GSTs在昆虫的抗药性和抗氧化能力形成中发挥重要作用，而家蚕为鳞翅目昆虫模式生物，因此，以BmGSTe4基因为靶标，有望设计出特异性杀灭鳞翅目害虫而对其它有益昆虫无害的生物防治药物。此外，本发明还发现BmGSTe4基因具有抑制细胞凋亡的作用，可作为抗癌药物筛选的潜在靶标。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为BmGSTe4基因重组转座载体pFastBacHTA-BmGSTe4的构建示意图。

图2为BmGSTe4基因重组表达产物的GSTs活性。

图3为BmGSTe4基因过度表达后对细胞凋亡的抑制作用。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

一、BmGSTe4基因的克隆

以家蚕基因组中预测的编码区序列（CDS），在家蚕表达序列标签（EST）数据库中为BmGSTe4基因寻找EST证据，以CDS和EST序列设计如下特异性引物：BmGSTe4-F：5'-cccaagcttatggtgttcatcctgtac-3'（SEQ ID No.3）；BmGSTe4-R：5'-atgccatggatggtgttcatcctgtac-3'（SEQ ID No.4）；下划线部分分别为HindIII和NcoI酶切位点。

以家蚕大造品种5 龄第3 天幼虫的头部cDNA 为模板，以BmGSTe4-F和BmGSTe4-R为引物，PCR扩增两端带有HindIII和NcoI酶切位点的BmGSTe4基因，PCR程序为：94℃预变性4分钟；94℃变性40秒，退火40秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；最后72℃延伸10分钟。所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定、切胶回收纯化后，与T载体pMD19-T连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选出抗氨苄青霉素（Ampr）的重组子进行测序鉴定，获得阳性克隆质粒pMD19-T-BmGSTe4，其中BmGSTe4基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

二、BmGSTe4基因昆虫杆状病毒重组表达载体的构建

分别用限制性核酸内切酶HindIII和NcoI双酶切pFastBacHTA杆状病毒转座载体和pMD19-T-BmGSTe4质粒，回收纯化pFastBacHTA载体线性片段和BmGSTe4基因，在T4连接酶的作用下连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，筛选出同时抗庆大霉素（Gentamicin）和抗Ampr的重组子进行酶切鉴定，获得BmGSTe4基因重组转座载体pFastBacHTA-BmGSTe4（图1）；再将该重组转座载体转化含有杆状病毒穿梭载体（Bacmid）和辅助质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行蓝白斑筛选，从白色菌落培养物中提取质粒DNA，获得BmGSTe4基因重组杆状病毒穿梭载体Bac-BmGSTe4。

三、BmGSTe4基因重组杆状病毒的获得

取1μg Bac-BmGSTe4（约5μl），用100μl不完全Grace's培养基（不含青霉素、链霉素和小牛血清）稀释；另取6μl Cellfectin Reagent（脂质体转染试剂），用100μl不完全Grace's培养基稀释；将上述两种稀释液合并（总体积约210μl），轻轻混匀，室温孵育10~50分钟，制得Bac-BmGSTe4与Cellfectin Reagent的复合物，再加入800μl不完全Grace's培养基稀释，备用。在6孔板中接种sf9细胞9×10⁵/2ml/孔，用完全Grace's培养基（含有50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10%小牛血清），27℃培养1小时使细胞贴壁，去除培养基，用2ml不完全Grace's培养基洗涤细胞1次，加入Bac-BmGSTe4与Cellfectin Reagent的复合物稀释液2ml，孵育5小时，去除复合物稀释液，再加入完全Grace's培养基2ml，37℃孵育约72小时，至细胞出现病毒感染迹象（细胞变大、变圆；胞浆中出现较多折光性很强的颗粒；细胞之间紧密连接逐渐消失，成片的细胞慢慢从壁上脱落下来）时，吸取细胞培养液，500g离心5分钟去除细胞碎片，收集含病毒上清，即得原代（P1）重组杆状病毒，测定病毒滴度。在6孔板中接种sf9细胞2×10⁶/孔，用完全Grace's培养基（含有50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素和10%小牛血清）于27℃培养，待细胞活力>97%时，按感染复数（MOI）为0.01~0.1，病毒接种量(mL)=MOI (phf/mL) × (细胞总数)/病毒滴度，加入P1重组杆状病毒，37℃孵育48小时，吸取细胞培养液，500g离心5分钟，收集含病毒上清，即得P2重组杆状病毒，测定病毒滴度。按上述方法依次进行P3重组杆状病毒、P4重组杆状病毒的扩增。

四、BmGSTe4基因重组表达产物的GST活性测定

收集P4重组杆状病毒感染48小时的sf9细胞，用PBS洗涤3次去除残留的培养基，加入1倍体积的BugBuster蛋白抽提试剂，37℃裂解15~20分钟，以CDNB（1-氯-2,4-二硝基苯）为模式底物进行GSTs活性测定，以Excel、SPSS13.0分析软件对数据进行处理，用学生氏t检验分析数据的差异显著性。结果如图2所示，P4重组杆状病毒感染48小时的sf9细胞中GSTs活性（11.04 nmol/min/mg protein）较正常sf9细胞（3.313 nmol/min/mg protein）高出3倍多，二者存在显著性差异（P<0.01），表明BmGSTe4基因重组表达产物具有良好的生物学活性。

五、BmGSTe4基因过度表达后对细胞凋亡的抑制作用测定

将HEK293细胞（人胚胎肾细胞）用DEME培养基（含有10%小牛血清）在温度为37℃、CO₂气体体积分数为5%的条件下培养，用Roch公司的脂质体转染试剂将P4重组杆状病毒转染细胞，转染细胞培养72小时后，用2%多聚甲醛固定细胞13分钟，PBS洗涤细胞3次，再用含0.1% Triton-100和5ng/L DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的混合溶液孵育10分钟，PBS洗涤细胞3次，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果如图3所示，经紫外照射6、8、10分钟诱导细胞凋亡处理后，正常HEK293细胞的凋亡率分别为12%、16.5%、12%，而过表达BmGSTe4基因的HEK293细胞的凋亡率分别为5%、4%、6%，过表达BmGSTe4基因的HEK293细胞凋亡率较正常HEK293细胞显著下降（p<0.01），表明BmGSTe4基因在细胞中过度表达后对细胞凋亡具有抑制作用。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照上述实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 西南大学

<120> 家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因

<160> 4

<210> 1

<211> 654

<212> DNA

<213> 家蚕（Bombyx mori Linnaeus）

<400> 1

atggtgttca tcctgtacaa aaaggacaca agtcctcctt gcagatcagt tcagatggta 60

ctccacgagc tcggaattta tgacgtggaa ctcattgaag tgaatctgcc agaaagggac 120

catctgaaag aagaatttct gaggatgaat ccgcaacaca ctgttcccac gttaatagac 180

ggagatttca taatatggga cagccacgcc atagtcacat atttggtgaa cagatatgct 240

aaaaatgaca cattatatcc taaagagcct aaacaaagag ccattgttga tcagaggtta 300

cattttgata ccggagtgct cttcgccata ttacgagcca ctgctgaacc ggtattatac 360

aacaatgaaa agagctttaa acaagaaaat ctagagaaaa tggaggcagc ctacgaattc 420

gttgaaaaat tcctgacttc cgattggcta gccggagacc aagttacatt agccgatatc 480

tgctgtgtat ctacaatcag ttccatgaac gtaattgtcc ctattgacaa aaagaagtac 540

ccaaaaataa tttcatggct acagcgctgt tccgaacaag aattttacaa gaaagccaac 600

gaaccaggct tgaagaaatt catagaaatg ttcaaaaata aaatcggcaa ctaa 654

<210> 2

<211> 217

<212> PRT

<213> 家蚕（Bombyx mori Linnaeus）

<400> 2

Met Val Phe Ile Leu Tyr Lys Lys Asp Thr Ser Pro Pro Cys Arg

1 5 10 15

Ser Val Gln Met Val Leu His Glu Leu Gly Ile Tyr Asp Val Glu

20 25 30

Leu Ile Glu Val Asn Leu Pro Glu Arg Asp His Leu Lys Glu Glu

35 40 45

Phe Leu Arg Met Asn Pro Gln His Thr Val Pro Thr Leu Ile Asp

50 55 60

Gly Asp Phe Ile Ile Trp Asp Ser His Ala Ile Val Thr Tyr Leu

65 70 75

Val Asn Arg Tyr Ala Lys Asn Asp Thr Leu Tyr Pro Lys Glu Pro

80 85 90

Lys Gln Arg Ala Ile Val Asp Gln Arg Leu His Phe Asp Thr Gly

95 100 105

Val Leu Phe Ala Ile Leu Arg Ala Thr Ala Glu Pro Val Leu Tyr

110 115 120

Asn Asn Glu Lys Ser Phe Lys Gln Glu Asn Leu Glu Lys Met Glu

125 130 135

Ala Ala Tyr Glu Phe Val Glu Lys Phe Leu Thr Ser Asp Trp Leu

140 145 150

Ala Gly Asp Gln Val Thr Leu Ala Asp Ile Cys Cys Val Ser Thr

155 160 165

Ile Ser Ser Met Asn Val Ile Val Pro Ile Asp Lys Lys Lys Tyr

170 175 180

Pro Lys Ile Ile Ser Trp Leu Gln Arg Cys Ser Glu Gln Glu Phe

185 190 195

Tyr Lys Lys Ala Asn Glu Pro Gly Leu Lys Lys Phe Ile Glu Met

200 205 210

Phe Lys Asn Lys Ile Gly Asn

215

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 上游引物BmGSTe4-F

<400> 3

cccaagctta tggtgttcat cctgtac 27

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 下游引物BmGSTe4-R

<400> 4

atgccatgga tggtgttcat cctgtac 27

Claims

1.家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.含有权利要求1所述家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因的重组表达载体。

3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为昆虫杆状病毒重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述昆虫杆状病毒重组表达载体由以下方法制得：将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因插入pFastBacHTA杆状病毒转座载体的多克隆位点中，获得重组转座载体，再将所得重组转座载体转化含有杆状病毒穿梭载体的大肠杆菌DH10Bac，进行蓝白斑筛选，从白色菌落培养物中提取质粒DNA，即获得昆虫杆状病毒重组表达载体。

5.含有权利要求1所述家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因的重组杆状病毒。

6.权利要求1所述家蚕谷胱甘肽-S-转移酶BmGSTe4基因编码的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。