CN110526960A

CN110526960A - 一类抗病毒多肽及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN110526960A
Application number: CN201810508832.2A
Authority: CN
Inventors: 王献兵; 朱非凡; 邹婧泽; 王颖; 于嘉林; 李大伟; 韩成贵; 张永亮
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2018-05-24
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2019-12-03
Anticipated expiration: 2038-05-24
Also published as: CN110526960B

Abstract

本发明涉及一类抗病毒多肽及其制备方法与应用，所述抗病毒多肽含有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8所示的任意一种氨基酸序列，将所述抗病毒多肽基因转化至植物中具有显著的抗病毒效果，且对黄瓜花叶病毒、大麦条纹花叶病毒等多种病毒都具有较强的抗病毒作用。采用酵母表达系统制备所述抗病毒多肽，将表达多肽喷施至植物表面，植物的病毒侵染量显著降低。本发明提供的抗病毒多肽可以用于防治植物的多种病毒侵染，利用生物制剂在生产中进行植物保护，实现有效的植物免疫防御，从而减少农药使用，有效提高植物质量和产量，提高农作物的经济和社会效应。

Description

一类抗病毒多肽及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗病毒多肽及其制备方法与应用。

背景技术

植物生长过程中，面临包括真菌、细菌、病毒、卵菌和线虫等各种病原微生物的侵染，为求得长期生存，植物逐渐进化出一套防御机制。植物的免疫机制主要分为两大类，一种是病原/微生物相关的分子模式作为激发子引发的广谱性免疫(PAMP-triggeredimmunity,PTI)；另外一种是植物的R蛋白于病原菌的无毒基因的特异识别引发的免疫(Effectors-triggered immunity,ETI)。近年来，研究人员发现植物在受病原菌侵染时，植物自身也会分泌一些信号分子至胞外，引发免疫反应。这类分泌肽先在细胞质中合成前体肽，通过分泌信号由寄主植物的分泌系统分泌到细胞外，产生成熟肽。成熟肽与细胞表面的受体识别，诱导植物的免疫抗性(Matsubayashi Y,and Sakagami Y.Peptide hormones inplants.Annu Rev Plant Biol.2006,57,649-674.；Matsubayashi Y.Post-translationalmodifications in secreted peptide hormones in plants.Plant Cell Physiol.2011,52,5-13.)。

拟南芥能分泌上千种植物分泌肽，在植物生长发育以及响应外界生物胁迫或者非生物胁迫中都起到重要作用。植物分泌肽主要分为两类：翻译后修饰小肽和富含半胱氨酸肽。参与免疫调节的几种植物分泌肽主要有CLV3p，PSKs，PSYl，HypSys和PIP1等。CLV3p能够结合FLS2受体激活免疫反应(Lee H et al.Stem-cell-triggered immunity throughCLV3p–FLS2signaling.Nature.2011,473,376)；PSK和PSY1是酪氨酸硫酸化修饰的小肽，可以增强植物对腐生病原真菌的抗性，但能降低对细菌的抗性(Igarashi D et al.Thepeptide growth factor,phytosulfokine,attenuates pattern-triggeredimmunity.Plant J.2012,71,194-204；Mosher S et al.The tyrosine-sulfated peptidereceptors PSKR1and PSY1R modify the immunity of Arabidopsis to biotrophic andnecrotrophic pathogens in an antagonistic manner.Plant J.2013,73,469-482)；HypSys是一个糖基化分泌肽，还有多个羟基脯氨酸，能够诱导抗食草昆虫相关基因表达并诱导免疫(Pearce G.Systemin,hydroxyproline-rich systemin and the induction ofprotease inhibitors.Current Protein and Peptide Science.2011,12,399-408)；PIP1识别RLK7,诱导植物免疫信号机制，增强拟南芥对病原细菌的抗性(Hou S et al.Thesecreted peptide PIP1amplifies immunity through receptor-like kinase 7.PLoSPathog.2017,10,e1004331.)。

然而，由于拟南芥分泌肽的编码基因的长度都比较短，很难通过定点突变获得功能缺失突变体，因此目前已知的具有抗病功能的分泌肽还比较少。此外，以往的研究都是用细菌、真菌或者食草昆虫作为生物胁迫，激发多肽的诱导和抗病过程，尚没有利用植物病毒诱导分泌具有抗病毒效应多肽的报道。因此，亟需研究和开发病毒诱导的多肽并在病毒防控过程起到关键作用的多肽类物质，作为绿色生物防治重要组成部分，高效地防控植物病毒病害发生。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种抗病毒多肽及其制备方法与应用。

本发明提供一种抗病毒多肽，所述抗病毒多肽含有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的任意一种氨基酸序列或含有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的任意一种氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。

根据本申请具体实施方式中提供的所述多肽的保守结构分析结果，本领域技术人员可以选择在此区域以外的氨基酸序列进行替换、缺失或插入获得具有相同功能的抗病毒多肽。

本发明提供的抗病毒多肽的全长多肽分为信号肽和成熟肽两部分部分。在植物体内，首先表达全长多肽，在多肽分泌过程中，信号肽降解，只有成熟肽被分泌到细胞膜外，激发抗病毒效应。本领域技术人员公知，成熟肽是抗病毒多肽发挥抗病毒作用的功能区，本领域技术人员可以根据需要在成熟肽的基础上偶联其它的信号肽进行多肽的表达和分泌，也可以选择单独表达成熟肽而利用表达宿主自身的信号肽分泌抗病毒多肽。

因此，本发明还提供了如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的全长多肽的成熟肽部分，其含有如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示的任意一种氨基酸序列或如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示的任意一种氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。

其中，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为来源于拟南芥的多肽，SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8为来源于水稻的多肽。

本发明还提供了编码所述抗病毒多肽的基因，其具有如下任意一种核苷酸序列：

(1)具有如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16所示的任意一种核苷酸序列；

(2)具有如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16所示的任意一种核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入得到的编码具有相同功能多肽的核苷酸序列；

(3)在严格条件下，能够与SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16所示的任意一种核苷酸序列杂交的编码具有相同功能多肽的核苷酸序列。

进一步地，本发明还提供了含有所述基因的载体以及含有所述基因或含有所述载体的宿主细胞。

另一方面，本发明提供所述抗病毒多肽的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)扩增所述抗病毒多肽的基因；

(2)构建携带所述抗病毒多肽的基因的表达载体；

(3)将所述表达载体转化至宿主细胞；

(4)培养所述宿主细胞，获得所述抗病毒多肽。

其中，优选地，所述宿主细胞为酵母或大肠杆菌。

作为本发明具体实施方式中的优选方案，所述抗病毒多肽的制备方法为将所述抗病毒多肽的基因连接至pYES2/CT/a载体(购自invitrogen公司)并转化至酿酒酵母中进行表达，在培养物上清中获得了大量的所述抗病毒多肽的表达。本领域技术人员应该知晓，所述抗病毒多肽的表达载体和转化宿主的选择可以不限于此，能够实现抗病毒多肽的表达的和宿主均在本发明的保护范围内。

本发明提供的抗病毒多肽能够激发植物的抗病毒系统，具有显著的抗病毒作用，表达所述抗病毒多肽的基因或直接喷施所述抗病毒多肽能够显著降低侵染植物的病毒水平。

因此，本发明还提供了所述抗病毒多肽或编码所述抗病毒多肽的基因或含有所述基因的载体在植物病害防治或制备植物病害防治药剂中的应用。

在此基础上，本发明还提供一种包含所述抗病毒多肽的植物病害防治药剂。

所述植物病害防治优选为植物病毒感染防治。

所述应用包括将所述抗病毒多肽喷施在植物表面或使用所述抗病毒多肽进行灌根或将所述抗病毒多肽编码基因转化至植物中，但不限于此。

进一步地，本发明还提供了所述的抗病毒多肽或其编码基因或含有所述基因的载体在制备具有抗病毒能力的转基因植物中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了一种抗病毒多肽及其编码基因，经转化植物验证，该多肽具有较好的抗病毒作用，转化该多肽基因植物的多种病毒的侵染量均显著下降，最高降低了99％。

(2)本发明提供了该抗病毒多肽的制备方法，采用酵母表达系统能够获得大量的多肽表达，且该多肽分泌于培养基上清中，制备方法简单易行。

(3)本发明提供的抗病毒多肽可以直接喷施至植物表面，具有显著的抗病毒效果，使用所述抗病毒多肽后，植物的多种侵染病毒的侵染量均显著下降，最高降低了89％，从而实现有效的植物病毒免疫防御。

附图说明

图1:对接种CMV一周的拟南芥进行的转录组测序结果，其中，mock为未接种病毒的植物样品中AT1G76960的表达量，CMV为接种病毒一周后的植物样品中AT1G76960的表达量。

图2:实时定量PCR检测接种CMV一周后拟南芥中AT1G76960的表达量变化情况。其中，mock为未接种病毒的植物样品中AT1G76960的表达量，CMV为接种病毒一周后的植物样品中AT1G76960的表达量。

图3：为AtVISP1蛋白的结构特征，其中1-26位氨基酸为信号肽(AtVISP1-S)部分，27-52位氨基酸为成熟肽(AtVISP1-M)部分。

图4:为本发明使用的表达载体pMDC32的结构示意图

图5:为农杆菌渗入法瞬间表达AtVISP1基因后western blot检测接种叶片的CMV-cp的积累情况，其中，viral partical为直接接种CMV的病毒粒子，algroinfiltration为用农杆菌的方法注射接种CMV；上样量代表考马斯亮蓝染色作为上样量的对照，用来说明各样品的上样量一致；CMV-cp代表用以表征病毒含量的病毒的外壳蛋白的表达情况；AtVISP1代表AtVISP1蛋白在植物中的表达情况；V代表空载体对照；OE代表超表达AtVISP1，M为蛋白分子量marker，Mock为未接种病毒的植物样品的空白对照，用来说明其他泳道的杂交信号是真实可信的。

图6:为农杆菌渗入法瞬间表达AtVISP1基因后western blot检测接种叶片的BSMV-cp的积累情况，其中，上样量代表考马斯亮蓝染色作为上样量的对照，用来说明各样品的上样量一致；BSMV-cp代表用来表征病毒含量的病毒的外壳蛋白的表达情况；AtVISP1代表AtVISP1蛋白在植物中的表达情况；V代表空载体对照；OE代表超表达AtVISP1，M为蛋白分子量marker，Mock为未接种病毒的植物样品的空白对照，用来说明其他泳道的杂交信号是真实可信的。

图7:为农杆菌渗入法瞬间表达AtVISP1基因后western blot检测接种叶片的BBSV-cp的积累情况，其中，上样量代表考马斯亮蓝染色作为上样量的对照，用来说明各样品的上样量一致。BBSV-cp代表用来表征病毒含量的病毒的外壳蛋白的表达情况；AtVISP1代表AtVISP1蛋白在植物中的表达情况；V代表空载体对照；OE代表超表达AtVISP1，M为蛋白分子量marker，Mock为未接种病毒的植物样品的空白负对照，用来说明其他泳道的杂交信号是真实可信的。

图8:为本发明使用的表达载体pYES2/CT/a的结构示意图。

图9:为western blot检测酵母表达的AtVISP1-M分泌多肽，M为蛋白marker，星号(*)标记表示AtVISP1-M目的条带。

图10:为TuMV-GFP侵染的拟南芥样品的GFP荧光表达，喷施不同浓度AtVISP1-M及作为对照的拟南芥在8dpi时紫外灯下观察GFP荧光表达，EV代表喷施转化空载体(不含有AtVISP1-M)的酵母表达上清，即为阴性对照，黑色部分表示GFP荧光，即病毒侵染部分；Bars＝2cm。

图11:为喷施不同浓度的酵母表达分泌多肽AtVISP1-M后，TuMV-GFP侵染拟南芥叶片采用western blot检测接种叶片的GFP的积累情况，其中，上样量代表考马斯亮蓝染色作为各样品的上样量的对照，用来说明上样量一致；TuMV-GFP代表TuMV病毒含量；mock代表未接种病毒的植物样品，即为空白对照；EV代表喷施转化空载体(不含有AtVISP1-M)的酵母表达上清，即为阴性对照。

图12：为喷施不同浓度的酵母表达分泌多肽AtVISP1-M后，CMV侵染拟南芥叶片后采用western blot检测接种叶片的CMV-cp蛋白的积累情况(代表病毒含量)，其中，上样量代表考马斯亮蓝染色作为上样量的对照，用来说明各样品的上样量一致，CMV-cp代表用来表征病毒含量的病毒的外壳蛋白的表达情况；mock代表为未接种病毒的植物样品，即为空白对照；EV代表喷施转化空载体(不含有AtVISP1-M)的酵母表达上清，即为阴性对照。

图13：为AtVISP1和AtVISP2氨基酸序列同源性比对，加深的部分表示同源位点。

图14：为农杆菌渗入法瞬间表达AtVISP1基因和AtVISP2基因后western blot检测接种叶片的CMV-cp的积累情况，其中上样量代表考马斯亮蓝染色作为上样量的对照，用来说明各样品的上样量一致。CMV-cp代表用来表征病毒含量的外壳蛋白的表达情况；V代表空载体对照；OE代表超表达AtVISP1和AtVISP2，M为蛋白分子量marker，Mock为未接种病毒的植物样品，即为空白对照，说明其他泳道的杂交信号是真实可信的。

图15：为OsVISP1和OsVISP2与AtVISP1的氨基酸序列同源性比对，加深的部分表示同源位点。

图16：为农杆菌渗入法瞬间表达OsVISP1基因和OsVISP2基因后western blot检测接种叶片的CMV-cp的积累情况，其中上样量代表考马斯亮蓝染色作为上样量的对照，用来说明各样品的上样量一致。CMV-cp代表用来表征病毒含量的外壳蛋白的表达情况；V代表空载体对照；OsVISP1和OsVISP2分别代表超表达OsVISP1基因和OsVISP2基因。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1AtVISP1基因的获得及表达载体构建

(1)AtVISP1基因的获得

本实验是通过对接种黄瓜花叶病毒(CMV)一周的拟南芥植株进行转录组测序，对结果进行分析发现AT1G76960在接种病毒后表达量上调为原来的3.58倍(如图1所示)，后用realtime验证该结果(如图2所示)，将该基因命名为AtVISP1基因，根据基因序列设计合成扩增引物。

根据在线网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析AtVISP1蛋白的结构特征，表明AtVISP1含有52个氨基酸，其中1-26氨基酸为信号肽(AtVISP1-S)部分，后面27-52位氨基酸为成熟肽(AtVISP1-M)部分，此部分如图3所示。在植物体内，首先表达全长多肽(AtVISP1)，分泌过程中，信号肽降解，只有成熟肽(AtVISP1-M)被分泌到细胞膜外，激发抗病毒效应。AtVISP1全长肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

(2)植物组织总RNA的提取

称取0.1g野生型拟南芥叶片，用液氮处理后充分研磨，在样品融化之前快速加入1ml Trizol Reagent(ambion)，震荡混匀，当样品溶解成棕色液体后，加入200μl氯仿震荡混匀30s，静置5min。4℃，12000rpm离心10min，取上清转移至新的离心管。加入等体积的氯仿抽提，震荡混匀30s，静置5min，4℃，12000rpm离心10min，转移上清至新的离心管。加入等体积的异丙醇用于沉淀核酸，颠倒混匀，室温静置20min，4℃，12000rpm离心10min。去除上清，分别用70％和80％的乙醇洗涤沉淀两次，每次4℃，12000rpm，5min，在超净台中晾干沉淀，后溶解于50μl DEPC处理的ddH2O中。

(3)AtVISP1全长基因的PCR扩增及真核表达载体构建

以提取的拟南芥总RNA为模板，以SEQ ID NO.17(5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)为引物，用M-MLV Reverse Transcriptase进行反转录，反应体系为30μl，反应液中含有3个单位的M-MLV Reverse Transcriptase，1.5μg RNA，10μM引物，0.2mM4×dNTPs，1个单位的Recombinant RNase Inhibition,反应条件为先将RNA和oligo dT以及DEPC处理的ddH2O在75℃变性10min，后将反应体系中的其它物质加入，42℃反应90min，获得拟南芥全长cDNA。后以cDNA为模板，以SEQ ID NO.18(5’-AGGCGCGCCATGAAAAGTTCATCGGA GCTCC-3’，含AscI位点)与SEQ ID NO.19(5’-GGACTAGTTGGACGG CAATACGGTGGG-3’，含SpeI位点)为引物，以PrimeSTAR HS DNA polymerase(TaKaRa)扩增获得长度为156bp的DNA片段，反应体系为50μl，反应液中含有2.5个单位的PrimeSTAR，20μM引物，0.2mM 4×dNTPs，反应条件为95℃1min，95℃30s，54℃30s，72℃30s，循环30次后72℃延伸10min。将获得的PCR产物克隆到pMDC32-3×Flag载体(Wang X,Cao X,Liu M,et al.Hsc70-2is required for Beet blackscorch virus infection through interaction with replication and capsidproteins[J].Scientific reports,2018,8(1):4526)(图4)，获得一个全长序列的载体pMDC32-AtVISP1。采用引物SEQ ID NO.20(5’-GAGCTCCACCG CGGTGGCGGCCGC-3’)进行序列测定，从而获得AtVISP1的全长序列156bp(如SEQ ID NO.9所示)。

实施例2瞬时表达AtVISP1的抗病毒效果检测

(1)将实施例1构建的pMDC32-AtVISP1载体转化至农杆菌EHA105中，采用SEQ IDNO.18(5’-AGGCGCGCCATGAAAAGTTCATCG GAGCTCC-3’)和SEQ ID NO.20(5’-GAGCTCCACCGCGGTGGC GGCCGC-3’)对转化菌株进行菌落PCR鉴定及测序验证，获得转化pMDC32-AtVISP1的阳性农杆菌单菌落，命名为pMDC32-AtVISP1菌株。取新鲜活化的pMDC32-AtVISP1菌株和抑制子P19菌株接种于3ml LB培养基(含0.1mg/ml卡那霉素和0.025mg/ml利福平)中，28℃220rpm过夜震荡培养至OD₆₀₀约为1.0，4000rpm离心10min，弃上清，将沉淀悬浮于2ml悬浮缓冲液(10mM Morpholineethanesulfonic acid,10mM MgCl₂,150μMAcetosyringone)中，测定OD₆₀₀，用悬浮缓冲液调节pMDC32-AtVISP1菌株的OD₆₀₀为0.8，P19菌株的OD₆₀₀为0.2，混匀后静置2h以上注射本生烟(苗龄4-5叶期)，每棵苗注射2片叶，每片叶注射半片，另半片注射相同浓度的空载体pMDC32菌株和P19菌株为对照，注射48h后接种20μl浓度为10ng/μl的黄瓜花叶病毒(CMV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)以及甜菜黑色焦枯病毒(BBSV)。

(2)western blot检测

待植株发病(约接种病毒后3天)后，取0.1g样品液氮研磨后迅速加入300μl 1×SDS上样缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 6.8，20％甘油，4％SDS，0.2％溴酚蓝，5％β-巯基乙醇)，震荡，沸水浴10min，12000rpm离心10min，取10μl上样电泳，根据条带亮度调整至上样量均匀一致，后取10μl样品再次80V电泳，待样品进入分离胶后，加大电压为120V，电泳至溴酚蓝刚刚跑出，停止电泳。用电转法将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，电流为200mA,时间为80min。将转移后的膜放在10ml封闭液(TBST(1.5M NaCl，20％1M Tris-HCl pH 7.5,0.5％Tween-20)+5％脱脂奶粉)，37℃封闭1h，封闭完成后，将膜转入含有黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV-cp)一抗的TBST中，37℃孵育1h后将膜在TBST缓冲液中漂洗3次，每次10min。将膜加入用TBST稀释的二抗中，37℃孵育45min，再用TBST漂洗3次，每次10min。后再避光条件下，将膜置于含330μg/ml NBT和165μg/ml BCIP的AP缓冲液(100mM Tris-HCl pH 9.5,100mMNaCl,5mM MgCl₂)中显色至条带清晰。检测BSMV与BBSV病毒含量的方法同CMV-cp，使用的一抗分别为大麦条纹花叶病毒外壳蛋白(BSMV-cp)一抗和甜菜黑色焦枯病毒外壳蛋白(BBSV-cp)一抗。western blot检测叶片中的黄瓜花叶病毒外壳蛋白CMV-cp、大麦条纹花叶病毒外壳蛋白BSMV-cp以及甜菜黑色焦枯病毒外壳蛋白BBSV-cp的含量。接种CMV病毒的结果如图5所示，结果表明，接种CMV病毒粒子的浓度为10ng/μl时，与对照相比，在本生烟中瞬间表达AtVISP1基因可以使侵染病毒的外壳蛋白CMV-cp降低64％，病毒粒子浓度为15ng/μl时，表达AtVISP1使得CMV-cp下降29％。农杆菌渗入法接种病毒，将CMV基因组三条链侵染性克隆RNA1,RNA2和RNA3浓度都是OD＝0.1,混合注射，才能建立有活性的病毒侵染，在此基础上，表达AtVISP1基因可以使植物中的病毒积累量分别降低75％和22％。接种BSMV病毒的结果如图6所示，结果表明，接种BSMV病毒粒子的浓度为10ng/μl时，与对照相比，在本生烟中瞬间表达AtVISP1基因可以使侵染病毒的外壳蛋白BSMV-cp下降57％，病毒粒子浓度为15ng/μl时，表达AtVISP1使得BSMV-cp下降了29％。农杆菌渗入法接种病毒，表达AtVISP1基因可以使植物中的病毒积累量降低64％。接种BBSV病毒的结果如图7所示，结果表明，达AtVISP1使得BBSV-cp的积累量降低79％。

实施例3 AtVISP1-M在酵母中的制备

(1)AtVISP1-M基因的密码子偏好性优化

利用http://www.jcat.de/网站的密码子偏好性优化程序，将拟南芥AtVISP1基因成熟肽AtVISP1-M的编码核苷酸序列按照酵母密码子偏好性，进行优化，优化后序列为SEQID NO.21ATGTTGCC AGGTACTCCATATGGTGGTCCAGGTCCATATCCAAGATCTTATCCAGTTTGTTATCCACCATATTGTAGACCA，提交擎科公司(TSINGKE)合成获得AtVSP1-M基因片段。

(2)AtVISP1-M基因的扩增及酵母表达载体的构建

以合成片段SEQ ID NO.21为模板，以SEQ ID NO.22(5’-ATAAGAATGCGGCCGCATGTTGCCAGGTACTCCATATGG-3’，含Not I位点)与SEQ ID NO.23(5’-CTAGTCTAGATGGTCTACAATA TGGTGGATAACAAAC-3’，含Xba I位点)为引物，以PrimeSTAR HSDNA polymerase(TaKaRa)PCR扩增获得长度为81bp的DNA片段,反应体系为50μl，反应液中含有2.5个单位的PrimeSTAR，20μM引物，0.2mM 4×dNTPs，反应条件为95℃1min，95℃30s,54℃30s，72℃30s，循环30次后72℃延伸10min。后将PCR产物克隆到pYES2/CT/a载体(购自invitrogen公司)，获得一个克隆pYES2CTa-AtVISP1-M，采用引物SEQ ID NO.24(5’-GTCACGCTTACATT CACGCCCTCC-3’)进行序列测定，证明将AtVISP1-M序列连接至pYES2/CT/a载体(图8)，AtVISP1-M的全长序列如SEQ ID NO.13所示。

(3)表达AtVISP1-M的酵母的构建

将上述(2)中构建的pYES2CTa-AtVISP1-M转化于酿酒酵母INVSc1中，获得AtVISP1-M的表达酵母。

取新鲜活化的酿酒酵母INVSc1菌株于5ml YPD培养基中，30℃220rpm过夜震荡。测定OD₆₀₀，将活化的菌液接种于50ml的YPD培养基中，使OD₆₀₀为0.4。继续震荡培养约4个小时，使OD₆₀₀为1.5。室温4000rpm离心3min收集菌体，用等体积的水洗涤菌体，再一次4000rpm离心3min。用1ml 0.1M的LiAc悬浮菌体后转到1.5ml的新离心管中。室温8000rpm离心30s，沉淀用400μl 0.1M LiAc悬浮，得到总体积约为500μl的酿酒酵母感受态。吸取50μl的感受态到新的1.5ml离心管中，8000rpm离心20s，去掉上清，加入240μl 50％PEG3350，36μl 1MLiAc，24μl ssDNA，50μl pYES2CTa-AtVISP179-156质粒，震荡1min，充分混匀，42℃热激20min，12000rpm离心1min，弃上清，取100μl酵母菌液涂布于Ura-培养基中，30℃培养。采用SEQ ID NO.22(5’-ATAAGAATGCGGCCGCATGTT GCCAGGTACTCCATATGG-3’)与SEQ ID NO.23(5’-CTAGTCTAGA TGGTCTACAATATGGTGGATAACAAAC-3’)为引物，2×T5Super PCR Mix对转化菌株进行菌落PCR鉴定，反应体系为20μl，反应液中含1×T5Super PCR Mix，2μM引物，反应条件为95℃1min，95℃30s,54℃30s，72℃30s，循环30次后72℃延伸10min。获得阳性pYES2CTa-AtVISP1-M转化酵母。

(4)酵母表达分泌肽的诱导表达

取新鲜活化的pYES2CTa-AtVISP1-M转化酵母菌株于5ml Ura-培养基中，30℃220rpm过夜震荡。测定OD₆₀₀，将活化的菌液接种于50ml含有20％半乳糖的YP培养基中，使OD₆₀₀为0.4，继续震荡诱导24小时。6000rpm离心15min收集上清，所得上清含有AtVISP1-MAtVISP1-M。

(5)western blot检测检测酵母分泌多肽

取上述步骤(4)中获得的包含AtVISP1-M分泌多肽的酵母培养物上清30μl上样电泳，电泳至溴酚蓝刚刚跑出，停止电泳。western blot方法如实施例2中步骤(2)所述，结果如图9所示，AtVISP1-M目的大小因为7kDa，介于5kDa和10kDa之间，对比蛋白marker可以看到*标注的目的条带，结果表明AtVISP1-M分泌多肽大量表达。

实施例4 AtVISP1-M多肽在植物抗病毒中的应用

(1)酵母AtVISP1-M的植物表面喷施

将酵母表达的AtVISP1-M分别稀释25倍和50倍喷施于拟南芥叶片表面，喷施24小时后分别对拟南芥接种TuMV-GFP(Garcia-Ruiz H,et al.,2015,PLoS Pathog 11:e1004755)和5μl浓度为30ng/μl的CMV-2blm，喷施后每隔3天喷施一次。

(2)紫外光照射和western blot检测

待植株发病(约接种病毒后8天)后，通过紫外光照射(图10)和western blot(图11和图12)检验分泌多肽的抗病性。其中western blot方法如上，使用的一抗分别为GFP一抗和CMV-CP一抗。紫外光照射检验结果如图10所示，结果表明随着喷施多肽浓度的增加，植株表达GFP的部分逐渐减少，说明TuMV-GFP的侵染量逐渐减少；Western blot检测TuMV-GFP的结果如图11所示，结果表明AtVISP1-M多肽稀释50倍喷施时，TuMV-GFP的含量降低了76％，稀释25倍喷施时，TuMV-GFP的含量降低了89％，即随着喷施多肽浓度的增加，其抗病毒效果提高；Western blot检测CMV-cp的结果如图12所示，结果表明，喷施不同浓度的AtVISP1-M多肽使植株中CMV-cp的积累量分别降低32％和46％所示。以上结果证明喷施多肽可以增强植株对TuMV-GFP和CMV-2blm的抵抗性。

实施例5 AtVISP1在拟南芥中的同源蛋白在植物抗病毒中的应用

我们通过氨基酸序列同源比对发现拟南芥中AT1G76955(命名为AtVISP2)与AtVISP1在分泌肽和成熟肽的同源性较高(图13)，其全长肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。采用实施例1中的方法，以引物SEQ ID NO.25(5’-TTGGCGCGCCATGGCTAAAACGCCAAGTAGTTCATC-3’)和SEQ ID NO.26(5’-GGACTAGTATTAATTTGATAATAGTTTCT TTCATTGTAAACAAATTGAGAC-3’)扩增获得AtVISP2的全长序列234bp(如SEQ ID NO.10所示)。通过氨基酸同源比对，发现在前面信号肽部分和成熟肽的后半部分具有一些保守的氨基酸位点(图13)，因此推测AtVISP2也具有抗病毒功能。

采用实施例2中的方法，将AtVISP2插入到pMDC32-3×Flag载体中获得pMDC32-VISP2,并检测AtVISP2的抗病毒能力，结果表明AtVISP2可以使植物中的病毒外壳蛋白积累量降低61％，AtVISP2具有与AtVISP1相近的抗病毒活性(图14)。

实施例6 AtVISP1在水稻中的同源蛋白在植物抗病毒中的应用

通过氨基酸序列同源比对，发现水稻日本晴(japonica cultivar-group)中也存在AtVISP1的同源蛋白，分别是Os12g0217800和Os12g0221250，在此命名为OsVISP1和OsVISP2。OsVISP1全长肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，成熟肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。OsVISP2全长肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，成熟肽的氨基酸序列如SEQID NO.8所示。利用实施例1中的方法，以日本晴(japonica cultivar)的总RNA为模板，以SEQ ID NO.17(5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)为引物，用M-MLV Reverse Transcriptase进行反转录；进一步，以反转录产物cDNA为模板，用引物SEQ ID NO.27(5′-AGGCGCGCCATGGCAGTGCTCAGGAAC GTCATC-3′)和SEQ ID NO.28(5′-GACTAGTTCGGCGAGCGTGACGCG-3′)扩增片段，插入pMDC32-3×Flag载体进行质粒测序，因为OsVISP1和OsVISP2两端高度同源，所用引物可以将两个片段都能扩增出来，因此根据重组质粒的测序结果，两个基因的序列才能区分开来，分别命名为pMDC32-OsVISP1和pMDC32-OsVISP2，OsVISP1和OsVISP2全长肽编码基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

通过氨基酸序列同源比对，发现OsVISP1和OsVISP2与前面所述的AtVISP1的成熟肽部分具有保守的氨基酸位点(图15)，属于同源基因，推测具有类似的抗病毒功能。

采用实施例2中的方法，将获得pMDC32-OsVISP1和pMDC32-OsVISP2瞬时注射本生烟,并检测抗病毒能力，结果表明OsVISP1和OsVISP2可以使植物中的病毒外壳蛋白积累量降低95％～99％，说明OsVISP1和OsVISP2具有较强的抗病毒活性(图16)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业大学

<120> 一类抗病毒多肽及其制备方法与应用

<130> KHP181112297.2

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 52

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Ser Ser Ser Glu Leu Leu Val Ile Met Ile Phe Leu Phe Leu

1 5 10 15

Ala Leu Leu Ile Ile Ser His Ala Gln Ser Leu Pro Gly Thr Pro Tyr

20 25 30

Gly Gly Pro Gly Pro Tyr Pro Arg Ser Tyr Pro Val Cys Tyr Pro Pro

35 40 45

Tyr Cys Arg Pro

50

<210> 2

<211> 78

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Lys Thr Pro Ser Ser Ser Ser Lys Leu Leu Val Met Met Leu

1 5 10 15

Phe Ser Phe Leu Ala Leu Phe Ile Ile Ser His Ala Arg Val Val Phe

20 25 30

Thr Asp Thr Pro Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Pro Ile Tyr Ala Pro Val

35 40 45

Pro Lys Glu Cys Leu Lys Pro Pro Tyr Cys Arg Gly Pro Pro Gly Glu

50 55 60

Ser Gln Phe Val Tyr Asn Glu Arg Asn Tyr Tyr Gln Ile Asn

65 70 75

<210> 3

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Val Leu Arg Asn Val Ile Thr Gly Val Gly Arg Arg Leu Val

1 5 10 15

Leu Leu Val Leu Thr Leu Leu Val Leu Ala Ala Leu Asp Asp Gln Ala

20 25 30

Pro Pro Met Ile Met Ala Ser Ala Ala Arg Val Leu Leu Gln Gln Tyr

35 40 45

Pro Pro Thr Tyr Gly Pro Pro Arg Cys Tyr Pro Pro Tyr Cys Ala Pro

50 55 60

Arg His Ala Arg Arg

65

<210> 4

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Val Leu Arg Asn Val Ile Thr Gly Val Gly Arg Arg Leu Val

1 5 10 15

Leu Leu Val Leu Thr Leu Leu Val Leu Ala Ala Leu Asp Asp Gln Ala

20 25 30

Pro Pro Met Ile Met Ala Ser Ala Ala Arg Val Leu Leu Gln Gln Tyr

35 40 45

Pro Pro Thr Tyr Gly Pro Pro Ser Cys Ser Met Pro Tyr Cys Ala Pro

50 55 60

Arg His Ala Arg Arg

65

<210> 5

<211> 27

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Leu Pro Gly Thr Pro Tyr Gly Gly Pro Gly Pro Tyr Pro Arg Ser

1 5 10 15

Tyr Pro Val Cys Tyr Pro Pro Tyr Cys Arg Pro

20 25

<210> 6

<211> 51

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Arg Val Val Phe Thr Asp Thr Pro Ser Asn Ser Tyr Ala Pro Pro

1 5 10 15

Ile Tyr Ala Pro Val Pro Lys Glu Cys Leu Lys Pro Pro Tyr Cys Arg

20 25 30

Gly Pro Pro Gly Glu Ser Gln Phe Val Tyr Asn Glu Arg Asn Tyr Tyr

35 40 45

Gln Ile Asn

50

<210> 7

<211> 44

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Leu Asp Asp Gln Ala Pro Pro Met Ile Met Ala Ser Ala Ala

1 5 10 15

Arg Val Leu Leu Gln Gln Tyr Pro Pro Thr Tyr Gly Pro Pro Arg Cys

20 25 30

Tyr Pro Pro Tyr Cys Ala Pro Arg His Ala Arg Arg

35 40

<210> 8

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Met Leu Asp Asp Gln Ala Pro Pro Met Ile Met Ala Ser Ala Ala Arg

1 5 10 15

Val Leu Leu Gln Gln Tyr Pro Pro Thr Tyr Gly Pro Pro Ser Cys Ser

20 25 30

Met Pro Tyr Cys Ala Pro Arg His Ala Arg Arg

35 40

<210> 9

<211> 159

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaaaagtt catcggagct ccttgtaata atgattttct tattcttggc gcttctcata 60

atctcccacg ctcaatcact tccaggtacg ccgtatggcg gccctggtcc gtatccgcgt 120

agttaccctg tgtgttaccc accgtattgc cgtccatga 159

<210> 10

<211> 237

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggctaaaa cgccaagtag ttcatcgaag ctccttgtga tgatgctttt ctcattcttg 60

gctcttttca taatctccca tgctcgagtt gtttttactg atacgccgtc taattcgtac 120

gctccaccta tttacgctcc tgttcctaag gaatgtctca agccacctta ttgccgcggt 180

cctcccggag agtctcaatt tgtttacaat gaaagaaact attatcaaat taattaa 237

<210> 11

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggcagtgc tcaggaacgt catcaccggc gttggccggc gtctggtgct cctcgtcctg 60

acgctgttgg tgttggcggc gctggatgat caggcgccgc ccatgatcat ggcctccgct 120

gccagggttt tgctacaaca atatccaccg acttatgggc ctccgcgctg ttatccgccg 180

tactgtgcac cgcgtcacgc tcgccgatga 210

<210> 12

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggcagtgc tcaggaacgt catcaccggc gttggccggc gtctggtgct cctcgtcctg 60

acgctgttgg tgctggcggc gctggatgat caggcgccgc ccatgatcat ggcctccgct 120

gccagggttt tgctgcaaca atatccaccg acttatgggc ctccaagctg ttctatgccg 180

tactgtgcac cgcgtcacgc tcgccgatga 210

<210> 13

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgcttccag gtacgccgta tggcggccct ggtccgtatc cgcgtagtta ccctgtgtgt 60

tacccaccgt attgccgtcc atga 84

<210> 14

<211> 156

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atgcgagttg tttttactga tacgccgtct aattcgtacg ctccacctat ttacgctcct 60

gttcctaagg aatgtctcaa gccaccttat tgccgcggtc ctcccggaga gtctcaattt 120

gtttacaatg aaagaaacta ttatcaaatt aattaa 156

<210> 15

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atggcgctgg atgatcaggc gccgcccatg atcatggcct ccgctgccag ggttttgcta 60

caacaatatc caccgactta tgggcctccg cgctgttatc cgccgtactg tgcaccgcgt 120

cacgctcgcc gatga 135

<210> 16

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgctggatg atcaggcgcc gcccatgatc atggcctccg ctgccagggt tttgctgcaa 60

caatatccac cgacttatgg gcctccaagc tgttctatgc cgtactgtgc accgcgtcac 120

gctcgccgat ga 132

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tttttttttt tttttttttt t 21

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aggcgcgcca tgaaaagttc atcggagctc c 31

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggactagttg gacggcaata cggtggg 27

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gagctccacc gcggtggcgg ccgc 24

<210> 21

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atgttgccag gtactccata tggtggtcca ggtccatatc caagatctta tccagtttgt 60

tatccaccat attgtagacc a 81

<210> 22

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ataagaatgc ggccgcatgt tgccaggtac tccatatgg 39

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctagtctaga tggtctacaa tatggtggat aacaaac 37

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gtcacgctta cattcacgcc ctcc 24

<210> 25

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ttggcgcgcc atggctaaaa cgccaagtag ttcatc 36

<210> 26

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ggactagtat taatttgata atagtttctt tcattgtaaa caaattgaga c 51

<210> 27

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aggcgcgcca tggcagtgct caggaacgtc atc 33

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gactagttcg gcgagcgtga cgcg 24

Claims

1.一种抗病毒多肽，其特征在于，其含有如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的任意一种氨基酸序列或如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的任意一种氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。

2.一种抗病毒多肽，其特征在于，其含有如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示的任意一种氨基酸序列或如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示的任意一种氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、缺失或插入得到的具有相同功能多肽的氨基酸序列。

3.编码权利要求1或2所述的抗病毒多肽的基因。

4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于，其具有如下任意一种核苷酸序列：

(1)具有如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16所示的任意一种核苷酸序列；

(3)在严格条件下，能够与SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列杂交的编码具有相同功能多肽的核苷酸序列。

5.含有权利要求3或4所述基因的载体。

6.含有权利要求3或4所述基因或含有权利要求5所述载体的宿主细胞。

7.权利要求1或2所述的抗病毒多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)扩增所述抗病毒多肽的基因；

(2)构建携带所述抗病毒多肽的基因的表达载体；

(3)将所述表达载体转化至宿主细胞；

(4)培养所述宿主细胞，获得所述抗病毒多肽。

8.权利要求1或2所述的抗病毒多肽或权利要求3或4所述的基因或权利要求5所述的载体在植物病害防治或制备植物病害防治药剂中的应用。

9.一种植物病害防治药剂，其特征在于，其包含权利要求1或2所述的抗病毒多肽。

10.权利要求1或2所述的抗病毒多肽或权利要求3或4所述的基因或权利要求5所述的载体在制备具有抗病毒能力的转基因植物中的应用。