CN112353939B

CN112353939B - Gtpbp4蛋白作为免疫抑制剂的应用及敲低或过表达gtpbp4细胞系的构建

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Publication number: CN112353939B
Application number: CN202011232798.4A
Authority: CN
Inventors: 郑海学; 刘会胜; 薛巧; 唐闻达; 朱紫祥; 薛钊宁; 曹伟军; 杨帆; 刘湘涛
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-11-06
Filing date: 2020-11-06
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2040-11-06
Also published as: CN112353939A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及GTPBP4蛋白作为免疫抑制剂的应用及敲低或过表达GTPBP4细胞系的构建。首先本发明意外发现，GTPBP4抑制SeV(仙台病毒)诱导的IFN‑β启动子的激活，以及IFN‑β及其下游基因的mRNA表达，抑制SeV诱导的IFN‑β蛋白表达；靶向IRF3(干扰素反应因子3)抑制天然免疫。其次，在细胞系中过表达GTPBP4蛋白，显著促进塞内卡病毒VP1蛋白的表达，提高了塞内卡病毒滴度，可用于塞内卡病毒及疫苗生产细胞系的构建；最后，在细胞系中敲低GTPBP4蛋白，明显抑制塞内卡病毒VP1蛋白的表达，降低了塞内卡病毒的滴度，可用于抗塞内卡病毒感染的动物育种；并且GTPBP4蛋白抑制剂可用于制备预防或治疗小核糖核酸病毒科病毒感染药物、药物组合物或疫苗组合物。

Description

GTPBP4蛋白作为免疫抑制剂的应用及敲低或过表达GTPBP4细胞系的构建

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及GTPBP4蛋白作为免疫抑制剂的应用及敲低或过表达GTPBP4细胞系的构建。

背景技术

小核糖核酸(RNA)病毒科是由RNA病毒中最小的类群组成的一科，主要包括肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属以及口疮病毒属。其中塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是小RNA病毒科(Picornaviridae)新增的塞内卡病毒属的唯一成员，临床症状与口蹄疫难以区分，主要表现为口鼻部、蹄部等产生水泡和溃疡。

2014年之前，SVA仅在美国和加拿大零星发生，但自2015年以来，巴西、越南、哥伦比亚、泰国、中国等陆续出现SVA疫情，并不断蔓延。2015年SVA传入我国，中国学者首先在广东省发现猪感染SVA的病例。随后，湖北、黑龙江、福建、河南、广西、河北、辽宁、山东、浙江、安徽、四川、江西和陕西等省份发生疫情，不断流行和蔓延、致病性增强，危害加重。由于SVA是新发传染病，其致病和免疫机制仍不完全清楚，且目前尚无商业化疫苗。因此必须深入了解宿主蛋白抑制SVA复制的机制，为SVA防控奠定基础。

GTP结合蛋白4(GTP binding protein 4,GTPBP4)为GTP结合蛋白超家族的一员，具有GTP酶活性。人类GTPBP4蛋白位于细胞核内，可调控细胞的多种生命活动，在细胞信号通路中起信号转换器或分子开关的作用，如核糖体与内质网的结合、细胞通讯、蛋白质合成、小泡运输等。GTPBP4为单体G蛋白，它的GTP蛋白结合区域与部分Ras超家族成员极其相似。GTPBP4在胃癌组织中的异常高表达及其与临床胃癌分期预后呈负相关均提示该基因在胃癌发病中的重要作用。近年来，越来越多的研究发现GTPBP4在肿瘤的发生、发展过程中也发挥着重要作用。然而，GTPBP4与天然免疫的关系仍不清楚。

首先，本发明意外发现，GTPBP4抑制SeV(仙台病毒)诱导的IFN-β启动子的激活，以及IFN-β及其下游基因的mRNA表达，抑制SeV诱导的IFN-β蛋白表达，靶向IRF3(干扰素反应因子3)抑制天然免疫。其次，本发明发现在细胞系中过表达GTPBP4蛋白，显著促进塞内卡病毒VP1蛋白的表达提高塞内卡病毒滴度，可作为塞内卡病毒及疫苗生产增效剂，并用于塞内卡病毒及疫苗生产细胞系的构建；最后，本发明发现在细胞系中敲低GTPBP4蛋白，明显抑制塞内卡病毒VP1蛋白的表达，降低了塞内卡病毒的滴度，可用于抗塞内卡病毒感染的动物育种；并且GTPBP4蛋白抑制剂可用于制备预防或治疗小核糖核酸病毒科病毒感染药物、药物组合物或疫苗组合物。

发明内容

本发明首先发现，通过siRNA技术下调GTPBP4后抑制了SeV诱导的IFN-β启动子的激活，以及IFN-β及其下游基因的mRNA表达，此外GTPBP4还抑制了SeV诱导的IFN-β的蛋白表达，进一步的研究发现GTPBP4靶向IRF3抑制天然免疫。因此，本发明的目的在于：

提供一种GTPBP4蛋白或GTPBP4蛋白表达促进剂作为免疫抑制剂的应用。

优选地，所述免疫抑制剂为天然免疫抑制剂。

提供一种GTPBP4蛋白或GTPBP4蛋白表达促进剂作为IFN-β抑制剂，或ISG54抑制剂，或ISG56抑制剂，或RIG-I抑制剂，或MDA5抑制剂，或TBK1抑制剂，或VISA抑制剂，或IRF3抑制剂的应用。

优选地，所述GTPBP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述编码GTPBP4蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

其次，本发明发现过表达GTPBP4蛋白后，能够显著促进塞内卡病毒VP1蛋白的表达，提高病毒滴度，可以显著促进塞内卡病毒的复制。本发明虽然以塞内卡病毒为例，但是由于塞内卡病毒属于小RNA病毒科，且小RNA病毒科四个属(肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属、口疮病毒属)病毒的结构蛋白具有高度同源性，因此，本发明的另一目的在于：

提供一种GTPBP4蛋白或GTPBP4蛋白表达促进剂作为小核糖核酸病毒科病毒，或病毒样颗粒，或疫苗表达增效剂的应用。

提供一种GTPBP4蛋白或GTPBP4蛋白表达促进剂作为小核糖核酸病毒科病毒，或病毒样颗粒，或疫苗生产增效剂的应用。

提供一种GTPBP4蛋白或GTPBP4蛋白表达促进剂在制备用于促进小核糖核酸病毒科病毒生产的细胞系中的应用。

优选地，所述GTPBP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述编码GTPBP4蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选地，所述小核糖核酸病毒科病毒为塞内卡病毒。

提供一种促进GTPBP4蛋白表达的重组慢病毒，所述重组慢病毒包括编码GTPBP4蛋白的基因和慢病毒载体。

提供一种制备促进小核糖核酸病毒科病毒复制的生产细胞系的方法，所述方法为：通过基因工程手段使宿主细胞中GTPBP4蛋白表达或过表达。

优选地，所述方法为：用GTPBP4蛋白重组表达载体或所述的促进GTPBP4蛋白表达的重组慢病毒感染宿主细胞，筛选获得促进小核糖核酸病毒科病毒复制的生产细胞系。

优选地，所述小核糖核酸病毒科病毒为塞内卡病毒。

提供一种通过上述方法制备获得的促进小核糖核酸病毒科病毒复制的生产细胞系。

最后，本发明发现下调表达GTPBP4蛋白后，明显抑制塞内卡病毒VP1蛋白的表达及其滴度。本发明虽然以塞内卡病毒为例，但是由于塞内卡病毒属于小RNA病毒科，且小RNA病毒科四个属(肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属、口疮病毒属)病毒的结构蛋白具有高度同源性，因此，本发明的另一目的在于：

提供一种GTPBP4蛋白表达抑制剂在制备预防或治疗小核糖核酸病毒科病毒感染药物、药物组合物或疫苗组合物中的应用，所述GTPBP4蛋白表达抑制剂包括如下所示的siRNA序列：

F：5’-GGAUGUGCACAGUGAUCAATT-3’；

R：5’-UUGAUCACUGUGCACAUCCTT-3’。

优选地，所述小核糖核酸病毒科病毒为塞内卡病毒。

提供一种抑制GTPBP4蛋白表达的重组慢病毒，所述重组慢病毒包括sgRNA序列和慢病毒载体；其中，所述sgRNA序列包括：

sgRNA1：GTGCCGTCCGCCAAGGTAGG；

sgRNA2：GTGGTGCCGTCCGCCAAGGT。

提供一种制备抗小核糖核酸病毒科病毒感染的动物育种细胞的方法，所述方法为：通过基因工程手段使细胞GTPBP4蛋白的功能敲低或丧失。

优选地，所述使GTPBP4蛋白功能丧失的方法为基因沉默技术。

优选地，所述方法为：待宿主细胞细胞长至70％-80％融合度时，利用脂质体试剂转染GTPBP4 siRNA。

优选地，所述GTPBP4 siRNA的序列包括：

F：5’-GGAUGUGCACAGUGAUCAATT-3’，

R：5’-UUGAUCACUGUGCACAUCCTT-3’。

优选地，所述使GTPBP4蛋白功能敲低或丧失的方法为CRISPR/Cas9慢病毒敲除技术，所述方法为：用所述的抑制GTPBP4蛋白表达的重组慢病毒感染宿主细胞，筛选获得抗小核糖核酸病毒科病毒感染的多克隆细胞系。

优选地，所述小核糖核酸病毒科病毒为塞内卡病毒。

优选地，所述细胞来源于猪科(Suidae)动物。

本发明的另一目的在于提供一种通过上述方法制备获得的抗小核糖核酸病毒科病毒动物育种细胞系。

优选地，所述小核糖核酸病毒科病毒为塞内卡病毒。

本发明的有益效果是：

①本发明首先发现GTPBP4抑制了SeV诱导的IFN-β启动子的激活，以及IFN-β及其下游基因的mRNA表达，此外GTPBP4还抑制了SeV诱导的IFN-β的蛋白表达。进一步的研究发现GTPBP4靶向IRF3抑制天然免疫；具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用；

②其次，过表达GTPBP4蛋白后，明显促进塞内卡病毒VP1蛋白的表达，提高病毒滴度，因此，GTPBP4蛋白或GTPBP4蛋白表达促进剂可作为塞内卡病毒疫苗的生产增效剂，促进疫苗生产；并且也可通过基因工程手段在生产细胞株中过表达GTPBP4蛋白，获得一种比现有生产细胞系生产塞内卡病毒疫苗性能更好的细胞系，用于塞内卡病毒疫苗的生产。

③其次，敲低GTPBP4蛋白能够显著降低塞内卡病毒VP1蛋白及其病毒滴度，可以显著抑制塞内卡病毒的复制，可用于预防塞内卡病毒的感染；因此，可通过基因工程手段使宿主细胞中GTPBP4蛋白敲除可用于构建抗塞内卡病毒的动物育种细胞，并于用抗塞内卡病毒的动物育种。

附图说明

图1GTPBP4对SeV诱导的IFN-β启动子影响的检测结果；

图2GTPBP4对SeV诱导的IFN-β及其下游基因mRNA的检测结果；

图3GTPBP4对SeV诱导的IFN-β蛋白表达的检测结果；

图4GTPBP4对RIG-I、MDA5、TBK1、VISA和IRF3诱导的IFN-β启动子影响的检测结果；

图5下调表达GTPBP4对塞内卡病毒复制的影响结果；

图6过表达GTPBP4对塞内卡病毒复制的影响结果。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。

术语“过表达”是指通过人工构建的方式在目的基因上游加入调控元件，使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，从而实现基因产物的过表达。本发明通过将慢病毒质粒和GTPBP4基因连接，构建了用于过表达GTPBP4的Lenti-GTPBP4-puro慢病毒，并感染细胞获得了过表达GTPBP4基因的多克隆细胞株。但是本发明并不局限于上述方法，通过基因编辑的其他技术手段，也可以实现GTPBP4基因的过表达。

术语“蛋白功能丧失”是指通过对编码蛋白的基因进行敲除、突变或在编码蛋白的基因片段中插入部分基因，使得基因编码蛋白发生移码突变，导致基因编码蛋白的功能丧失。本发明通过基因沉默技术(siRNA)敲低了宿主细胞中的GTPBP4表达，导致GTPBP4基因编码蛋白的功能丧失；并通过CRISPR/Cas9慢病毒敲除技术构建了GTPBP4基因编码蛋白功能丧失的细胞系，并用于小RNA病毒科病毒疫苗的生产。但是本发明并不局限于基因沉默技术和CRISPR/Cas9慢病毒敲除技术，也可通过其他技术手段使GTPBP4基因编码蛋白的功能丧失，并用于构建GTPBP4基因编码蛋白功能丧失的细胞系。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。

FLAG-GTPBP4质粒由兰州瑞博莱生物科技有限公司构建，其中GTPBP4基因根据人源GTPBP4基因序列合成，登陆号为：NM_012341.3。

SVA菌株均由本团队分离，IFN-β启动子荧光素酶质粒，内参TK质粒，RIG-I(视黄酸(维甲酸)诱导基因蛋白I)质粒、MDA5(黑素瘤差异化相关基因5)质粒、TBK1(TANK结合激酶1)质粒、VISA(病毒诱导信号适配蛋白)质粒、IRF3(干扰素反应因子3)质粒和SeV(仙台病毒)菌株均保存于中国农业科学院兰州兽医研究所塞内卡病毒病与新发病流行病学团队与国家塞内卡病毒病参考实验室。

GTPBP4的基因序列、NC siRNA、GTPBP4 siRNA和sgRNA序列均由上海吉玛制药技术有限公司设计并合成，其中：

NC siRNA序列为：

F：UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT；

R：ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT。

GTPBP4 siRNA序列为：

F：GGAUGUGCACAGUGAUCAATT；

R：UUGAUCACUGUGCACAUCCTT；

sgRNA序列包括：

sgRNA1：GTGCCGTCCGCCAAGGTAGG；

sgRNA2：GTGGTGCCGTCCGCCAAGGT。

荧光素酶检测试剂盒和IFN-βELISA检测试剂盒购自兰州瑞博莱生物科技有限公司。

实施例1 GTPBP4的免疫抑制作用

1.GTPBP4抑制SeV诱导的IFN-β启动子的激活

将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔内，待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染NC siRNA(75nm/孔)、GTPBP4 siRNA(75nm/孔)、IFN-β启动子荧光素酶质粒(IFN-β-luc，100ng/孔)和内参TK质粒(10ng/孔)，转染36h，接种适量的SeV，感染12h后，收取细胞，利用荧光素酶检测试剂盒测定IFN-β启动子的活性。

实验结果如图1所示，在转染GTPBP4 siRNA的细胞中，SeV诱导的IFN-β启动子的活性显著增高。结果表明，GTPBP4抑制SeV诱导的IFN-β启动子的活性，而经GTPBP4 siRNA干扰GTPBP4表达后SeV诱导的IFN-β启动子的活性显著增高。说明GTPBP4具有较强的免疫抑制作用，可通过敲低GTPBP4解除免疫抑制。

2.GTPBP4抑制SeV诱导的IFN-β及其下游因子的mRNA表达

将HEK-293T细胞铺置于12孔板的单个孔内，待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染NC siRNA(150nm/孔)和GTPBP4 siRNA(150nm/孔)，转染36h，接种适量的SeV，感染12h后，利用PBS清洗一次，收取细胞，提取RNA，检测IFN-β及其下游因子的mRNA表达。

RNA提取过程如下：

(1)加入1mL Trizol试剂，剧烈吹打使细胞完全裂解5-15min，液体移至无RNA酶的1.5mL离心管；

(2)加入250μL氯仿，剧烈震荡使液体成浅红色，4℃静置10min；

(3)4℃，12000r/min离心15min，吸取200μL上清至新的无RNA酶的1.5mL离心管，并加入200μL的异丙醇，上下轻轻颠倒8次，-20℃静置30min，然后4℃，12000r/min离心15min；

(4)弃去上清，加入1mL 75％乙醇，上下颠倒5次，4℃，10000r/min离心5min；

(5)弃去上清，吸净残留液体，晾干离心管，然后加入25μL DEPC水溶解RNA。

制备好的总RNA(病毒RNA和细胞RNA)，进行反转录后，进行实时定量PCR检测。

反转录体系：5×First Buffer，4μL；0.1M dTT，2μL；10mM each dNTPs，1μL；6ntRandom Primers，1μL；oligo-dT Primers，0.5μL；M-MLV transcriptase，1μL；RRI，0.5μL；H₂O，6μL；RNA，4μL；

反应程序：25℃，10min；37℃，60min；75℃，10min。

实时定量PCR反应体系：2×SYBR Premix Ex Taq，5μL；上游引物CACTGGTGACAGGCTAAGG，10μM，0.2μL；下游引物CCCTTCTCAGATTCCGAGT，10μM，0.2μL；H₂O，4.1μL；cDNA模板，0.5μL。

反应程序：95℃，2min；95℃，10s，60℃，34s，40个循环；Melt Curve；4℃保存。

实验结果如图2所示，在转染GTPBP4 siRNA的细胞中，SeV诱导的IFN-β、ISG54和ISG56的mRNA水平均显著增高。结果表明，GTPBP4抑制SeV诱导的IFN-β、ISG54和ISG56的mRNA水平，而经GTPBP4 siRNA干扰GTPBP4表达后，SeV诱导的IFN-β、ISG54和ISG56的mRNA水平显著增高。说明GTPBP4具有较强的免疫抑制作用，可通过敲低GTPBP4解除免疫抑制。

3.GTPBP4抑制SeV诱导的IFN-β的蛋白表达

细胞转染和感染方法如上述2所述，感染SeV 12h后，收取细胞上清，利用IFN-βELISA检测试剂盒测定IFN-β的蛋白表达情况。

实验结果如图3所示，在转染GTPBP4 siRNA的细胞中，SeV诱导的IFN-β的蛋白水平显著增高。结果表明，GTPBP4抑制SeV诱导的IFN-β蛋白水平，而经GTPBP4 siRNA干扰GTPBP4表达后SeV诱导的IFN-β蛋白水平显著增高。说明GTPBP4具有较强的免疫抑制作用，可通过敲低GTPBP4解除免疫抑制。

4.GTPBP4靶向IRF3抑制天然免疫

将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔内，待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂转染100ng/孔的RIG-I、MDA5、TBK1、VISA、IRF3和GTPBP4质粒，及IFN-β-luc(100ng/孔)和TK质粒(10ng/孔)，转染24h，收取细胞，利用荧光素酶检测试剂盒测定IFN-β启动子的活性。

实验结果如图4所示，GTPBP4抑制了RIG-I、MDA5、TBK1、VISA和IRF3诱导的IFN-β启动子的活性，说明GTPBP4靶向IRF3抑制IFN-β的激活，具有免疫抑制作用。

综上所述，GTPBP4抑制了SeV诱导的IFN-β启动子的激活，以及IFN-β及其下游基因的mRNA表达，此外GTPBP4还抑制了SeV诱导的IFN-β的蛋白表达。进一步的研究发现GTPBP4靶向IRF3抑制天然免疫。说明GTPBP4具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用。

实施例2下调表达GTPBP4蛋白抑制塞内卡病毒复制的效果评价

1.感染塞内卡病毒的HEK-293T细胞样品的制备

将HEK-293T细胞铺置于6孔板的单个孔内。待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染NC siRNA和GTPBP4 siRNA，转染36h，接种1MOI的塞内卡病毒，接种1h后换为维持液培养。感染12h后收取细胞。

2.病毒蛋白含量的检测

蛋白样品的制备：将感染塞内卡病毒12h后的细胞培养上清液弃去，用PBS清洗一次细胞样品，利用细胞铲刮下细胞，移入1.5mL离心管中，2000rpm离心5min，弃上清，保留细胞沉淀，即为收获的细胞样品(均在冰上操作)；根据收集细胞沉淀的多少加入适量的细胞裂解液，并快速反复吹打重悬细胞样品，冰上裂解5min，超声波瞬时破碎(冰上操作，超声2-3次)；4℃，13000rpm离心10min，弃去底部沉淀，取上清于另一预冷离心管中保存；取样品蛋白上清加入5×蛋白上样缓冲液，沸水煮沸变性10min，4℃，12000rpm离心5min，取适量上清进行蛋白质电泳。

SDS-PAGE凝胶电泳及其电泳图蛋白转印：SDS-PAGE凝胶及电泳缓冲液均按照分子克隆实验指南配制。每个蛋白样品上样量为40μg，同时单独选孔加入预染蛋白Marker作为指示。蛋白样品在浓缩胶时，调用80V电压；待蛋白样品进入分离胶后，调取电压至120V，直至电泳结束。转印前，根据SDS-PAGE凝胶的大小剪取合适的硝酸纤维素膜(NC膜)，并在转印缓冲液中浸泡10min左右，同时剪取6层滤纸浸泡在转印液中数分钟。按照“膜正胶负”顺序放置蛋白胶：负极-海绵-3层滤纸-凝胶-NC膜-3层滤纸-海绵-正极，安装好“转印夹心三明治”后，将其放置到全湿转印槽内，加入足够转印缓冲液，接通电源(恒流240mA或恒压65V转印2-3h)，转印槽外部用冰袋辅助降温。待转印结束后，5％的TBST-脱脂乳封闭NC膜，室温作用2-3h，弃去封闭液，TBST(pH7.6)缓冲液漂洗3次，洗去残留脱脂乳封闭液，随后进行抗体孵育。抗体反应：加入TBST稀释一抗，4℃轻摇振荡过夜(或室温4-6h)，一抗回收利用。TBST轻轻漂洗3次后，再用TBST洗2-3次，每次漂洗10min。漂洗完毕后，加入HRP标记的二抗，室温作用2h，作用完毕用TBST轻轻漂洗3次，再用TBST漂洗3次，每次10min。漂洗结束后，进行显色反应。暗室中利用ECL显色试剂盒进行显色。取试剂盒中A液与B液等量混合，然后轻轻均匀地淋湿NC膜，作用1-2min后，将作用的膜放置在X光曝光夹内，在上方放置X光胶片进行曝光。曝光完成的胶片首先放入显影液中进行显影，待所需蛋白条带显示后，用自来水轻轻漂洗胶片，然后将胶片放入定影液中进行定影2-3min。定影结束后，将胶片放入自来水漂洗、进一步晾干、待晾干后标记蛋白Marker，扫描胶片保存结果。

实验结果如图5中左图所示，在转染GTPBP4 siRNA的细胞中，塞内卡病毒VP1蛋白的含量显著降低，说明下调表达GTPBP4蛋白抑制塞内卡病毒复制，且GTPBP4蛋白表达抑制剂(例如GTPBP4 siRNA)可用于制备预防或治疗塞内卡病毒感染药物、药物组合物或疫苗组合物。

3.塞内卡病毒滴度测定

感染12小时后收集细胞上清，通过TCID₅₀测定，进行病毒滴度分析。病毒效价的测定：提前16h将IBRS细胞接种96孔板。在细胞形成单层细胞后，用PBS洗3遍IBRS细胞，接种病毒(10^-1-10^-10)，另设两列阴性对照孔。感染孔，每孔加入100ul病毒滤液或倍比稀释病毒稀释液，37℃吸附1h，每20min轻轻摇晃一次，保证病毒吸附均匀。吸附1h后，吸去上清，用PBS轻轻洗板1次。加入病毒维持液。待48h后，每12h观察一次细胞病变情况，72h后记录病变孔数，计算TCID₅₀，平行测定三次，取平均值为最终病毒滴度。

实验结果如图5中右图所示，在转染GTPBP4 siRNA的细胞中，塞内卡病毒的滴度显著降低。说明下调表达GTPBP4蛋白抑制塞内卡病毒滴度，且GTPBP4蛋白表达抑制剂(例如GTPBP4 siRNA)可用于制备预防或治疗塞内卡病毒感染药物、药物组合物或疫苗组合物。

综上，通过敲低GTPBP4蛋白能够显著降低塞内卡病毒VP1蛋白及其滴度，可以显著抑制塞内卡病毒的复制，可用于预防塞内卡病毒的感染。并且可通过基因工程手段使细胞中GTPBP4蛋白敲除，用于构建抗塞内卡病毒的动物育种细胞，并用于抗塞内卡病毒的动物育种。

实施例3 GTPBP4蛋白促进塞内卡病毒复制的效果评价

1.感染塞内卡病毒的HEK-293T细胞样品的制备

将6×10⁵个HEK-293T细胞铺制于6孔板的单个孔内。待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染FLAG-GTPBP4质粒0、1、2μg，转染24h，接种1MOI的塞内卡病毒，接种1h后换为维持液培养。

2.病毒蛋白含量的检测

检测方法同实施例2中2所述。

实验结果如图6中左图所示，随着FLAG-GTPBP4质粒加入量的增加，塞内卡病毒VP1蛋白的表达显著升高，说明相对于正常HEK-293T细胞，外源加入GTPBP4蛋白显著促进了塞内卡病毒VP1蛋白的表达，且存在剂量依赖性。

3.塞内卡病毒滴度测定

感染FMDV后收集细胞上清，通过TCID₅₀测定，进行病毒滴度分析。病毒效价的测定方法如实施例2中3所述。

实验结果如图6中右图所示，随着FLAG-GTPBP4质粒加入量的增加，塞内卡病毒的TCID₅₀显著升高，说明GTPBP4蛋白的过表达显著促进了塞内卡病毒的病毒TCID₅₀，且存在剂量依赖性。

综上实验表明，相对于正常HEK-293T细胞，外源加入GTPBP4蛋白显著促进了塞内卡病毒的复制，因此外源加入GTPBP4蛋白或GTPBP4蛋白过表达能够显著促进塞内卡病毒VP1蛋白的表达及提高病毒滴度，因此，可通过基因工程手段在生产细胞株中过表达GTPBP4蛋白，获得一种比现有生产细胞系生产塞内卡病毒疫苗性能更好的细胞系，用于塞内卡病毒疫苗的生产。

实施例4过表达GTPBP4慢病毒以及细胞系的构建

使用限制性内切酶对慢病毒载体质粒进行酶切，酶切2h，然后将慢病毒质粒和GTPBP4基因进行连接反应。连接产物转入感受态细胞，提取出构建成功的慢病毒质粒。

酶切体系(10μL)：HindⅢ酶，1μL；XbaⅠ酶，1μL；Buffer，1μL；载体质粒，5μL；H₂O，2μL。

连接反应体系(10μL)：连接酶，1μL；Buffer，1μL；载体质粒，1μL；GTPBP4基因，5μL；H₂O，2μL。

待宿主细胞生长至80％左右，按照慢病毒包装试剂盒说明书将构建的慢病毒质粒进行慢病毒包装，从而得到Lenti-GTPBP4-puro慢病毒。所述的慢病毒可以促进GTPBP4蛋白过表达。

用Lenti-GTPBP4-puro慢病毒感染细胞，之后加入嘌呤霉素(puromycin,2μg/ml)筛选，即可得到过表达GTPBP4基因的多克隆细胞株。该细胞株在嘌呤霉素存在的情况下，可稳定传代。因此可通过上述技术手段制备出能够促进小RNA病毒科病毒复制和生产的生产细胞系，并用于小RNA病毒科病毒的表达与生产。

实施例5下调GTPBP4表达的慢病毒以及细胞系的构建

合成针对GTPBP4基因序列的sgRNA，其两端加入BbsI酶切位点；所述sgRNA的序列包括：

sgRNA1：GTGCCGTCCGCCAAGGTAGG；

sgRNA2：GTGGTGCCGTCCGCCAAGGT。

使用BbsI核酸内切酶对慢病毒载体质粒和双链DNA进行酶切，然后连接反应。转入感受态细胞，提取出构建成功的慢病毒质粒；

待宿主细胞生长至80％左右，将构建的慢病毒质粒进行慢病毒包装，从而得到Lenti-sgRNA-Cas9-puro慢病毒；

将Lenti-sgRNA-Cas9-puro慢病毒感染细胞，之后加入嘌呤霉素筛选，即可得到敲低GTPBP4基因的多克隆细胞株，该细胞株在嘌呤霉素存在的情况下，可稳定传代。因此可通过上述技术手段获得抗小RNA病毒科病毒感染的动物育种细胞，实现抗小RNA病毒科病毒感染的动物育种。

综上所述，本发明虽然以塞内卡病毒为例，但是由于塞内卡病毒属于小RNA病毒科，且小RNA病毒科四个属(肠道病毒属、鼻病毒属、心病毒属、口疮病毒属)病毒的结构蛋白具有高度同源性，因此外源加入GTPBP4蛋白或GTPBP4蛋白表达促进剂，以及诱导GTPBP4蛋白过表达均能够显著促进其他小RNA病毒科病毒的复制。

以上所述的实施例仅表述了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可做出其它改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> GTPBP4蛋白作为免疫抑制剂的应用及敲低或过表达GTPBP4细胞系的构建

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 634

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala His Tyr Asn Phe Lys Lys Ile Thr Val Val Pro Ser Ala Lys

1 5 10 15

Asp Phe Ile Asp Leu Thr Leu Ser Lys Thr Gln Arg Lys Thr Pro Thr

20 25 30

Val Ile His Lys His Tyr Gln Ile His Arg Ile Arg His Phe Tyr Met

35 40 45

Arg Lys Val Lys Phe Thr Gln Gln Asn Tyr His Asp Arg Leu Ser Gln

50 55 60

Ile Leu Thr Asp Phe Pro Lys Leu Asp Asp Ile His Pro Phe Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Leu Met Asn Ile Leu Tyr Asp Lys Asp His Tyr Lys Leu Ala Leu

85 90 95

Gly Gln Ile Asn Ile Ala Lys Asn Leu Val Asp Asn Val Ala Lys Asp

100 105 110

Tyr Val Arg Leu Met Lys Tyr Gly Asp Ser Leu Tyr Arg Cys Lys Gln

115 120 125

Leu Lys Arg Ala Ala Leu Gly Arg Met Cys Thr Val Ile Lys Arg Gln

130 135 140

Lys Gln Ser Leu Glu Tyr Leu Glu Gln Val Arg Gln His Leu Ser Arg

145 150 155 160

Leu Pro Thr Ile Asp Pro Asn Thr Arg Thr Leu Leu Leu Cys Gly Tyr

165 170 175

Pro Asn Val Gly Lys Ser Ser Phe Ile Asn Lys Val Thr Arg Ala Asp

180 185 190

Val Asp Val Gln Pro Tyr Ala Phe Thr Thr Lys Ser Leu Phe Val Gly

195 200 205

His Met Asp Tyr Lys Tyr Leu Arg Trp Gln Val Val Asp Thr Pro Gly

210 215 220

Ile Leu Asp His Pro Leu Glu Asp Arg Asn Thr Ile Glu Met Gln Ala

225 230 235 240

Ile Thr Ala Leu Ala His Leu Arg Ala Ala Val Leu Tyr Val Met Asp

245 250 255

Leu Ser Glu Gln Cys Gly His Gly Leu Arg Glu Gln Leu Glu Leu Phe

260 265 270

Gln Asn Ile Arg Pro Leu Phe Ile Asn Lys Pro Leu Ile Val Val Ala

275 280 285

Asn Lys Cys Asp Val Lys Arg Ile Ala Glu Leu Ser Glu Asp Asp Gln

290 295 300

Lys Ile Phe Thr Asp Leu Gln Ser Glu Gly Phe Pro Val Ile Glu Thr

305 310 315 320

Ser Thr Leu Thr Glu Glu Gly Val Ile Lys Val Lys Thr Glu Ala Cys

325 330 335

Asp Arg Leu Leu Ala His Arg Val Glu Thr Lys Met Lys Gly Asn Lys

340 345 350

Val Asn Glu Val Leu Asn Arg Leu His Leu Ala Ile Pro Thr Arg Arg

355 360 365

Asp Asp Lys Glu Arg Pro Pro Phe Ile Pro Glu Gly Val Val Ala Arg

370 375 380

Arg Lys Arg Met Glu Thr Glu Glu Ser Arg Lys Lys Arg Glu Arg Asp

385 390 395 400

Leu Glu Leu Glu Met Gly Asp Asp Tyr Ile Leu Asp Leu Gln Lys Tyr

405 410 415

Trp Asp Leu Met Asn Leu Ser Glu Lys His Asp Lys Ile Pro Glu Ile

420 425 430

Trp Glu Gly His Asn Ile Ala Asp Tyr Ile Asp Pro Ala Ile Met Lys

435 440 445

Lys Leu Glu Glu Leu Glu Lys Glu Glu Glu Leu Arg Thr Ala Ala Gly

450 455 460

Glu Tyr Asp Ser Val Ser Glu Ser Glu Asp Glu Glu Met Leu Glu Ile

465 470 475 480

Arg Gln Leu Ala Lys Gln Ile Arg Glu Lys Lys Lys Leu Lys Ile Leu

485 490 495

Glu Ser Lys Glu Lys Asn Thr Gln Gly Pro Arg Met Pro Arg Thr Ala

500 505 510

Lys Lys Val Gln Arg Thr Val Leu Glu Lys Glu Met Arg Ser Leu Gly

515 520 525

Val Asp Met Asp Asp Lys Asp Asp Ala His Tyr Ala Val Gln Ala Arg

530 535 540

Arg Ser Arg Ser Ile Thr Arg Lys Arg Lys Arg Glu Asp Ser Ala Pro

545 550 555 560

Pro Ser Ser Val Ala Arg Ser Gly Ser Cys Ser Arg Thr Pro Arg Asp

565 570 575

Val Ser Gly Leu Arg Asp Val Lys Met Val Lys Lys Ala Lys Thr Met

580 585 590

Met Lys Asn Ala Gln Lys Lys Met Asn Arg Leu Gly Lys Lys Gly Glu

595 600 605

Ala Asp Arg His Val Phe Asp Met Lys Pro Lys His Leu Leu Ser Gly

610 615 620

Lys Arg Lys Ala Gly Lys Lys Asp Arg Arg

625 630

<210> 2

<211> 1905

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcacatt acaacttcaa gaaaattacg gtggtgccgt ccgccaagga cttcatagac 60

ctcacgttgt cgaagactca acgaaagact ccaaccgtta ttcataaaca ttaccaaata 120

catcgcatta gacattttta catgagaaaa gtcaaattta ctcaacagaa ttaccatgat 180

agactttcac aaattctaac agatttcccc aaattggatg atattcatcc gttctatgct 240

gatttgatga atattctcta cgacaaggat cattacaagt tggctctggg gcaaataaat 300

attgccaaaa atttagtgga caatgttgct aaagattatg tgcgactgat gaagtatggc 360

gactctctct accgctgcaa acagctgaag cgtgcggccc tgggacggat gtgcacagtg 420

atcaagaggc agaagcagag tttggagtat ttggagcaag tgcgtcagca tttatcccgt 480

ttgccaacca ttgatccgaa taccaggacc ctgcttttgt gtgggtaccc aaatgttggg 540

aagtccagct tcatcaacaa ggtgacgaga gcagacgtgg atgtccagcc ctatgcgttc 600

acaaccaagt ctctgtttgt tgggcacatg gattataagt atctacgttg gcaggttgta 660

gacactcctg ggatcctgga ccaccctctg gaggatagga acaccatcga gatgcaggcc 720

atcactgccc tggcccacct ccgtgctgcg gtcctgtatg tgatggattt gtctgagcag 780

tgtgggcatg ggctgaggga gcagctagaa ctcttccaga acatcagacc tctcttcatc 840

aacaagcctc tcatagttgt agccaacaaa tgtgatgtga agagaatagc tgaactttct 900

gaagatgatc agaaaatatt tacagatttg cagtctgaag gattccctgt aatagagacc 960

agcaccctga ctgaggaagg tgttattaaa gttaaaacag aggcttgcga taggcttttg 1020

gctcatcgag tggaaaccaa aatgaaggga aataaagtga atgaggtgct gaatagactg 1080

cacctggcta tcccaaccag gagggacgat aaggagaggc cccctttcat ccctgaagga 1140

gtggtggctc gcaggaagag gatggaaact gaggagtcca ggaagaagag ggaacgagat 1200

cttgagctgg aaatgggaga tgattatatt ttggatcttc agaagtactg ggatttaatg 1260

aatttgtctg aaaaacatga taagatacca gaaatctggg aaggccataa tatagctgat 1320

tatattgatc cagccatcat gaagaaattg gaagaattag aaaaagaaga agagctgaga 1380

acagctgctg gagagtatga cagtgtatct gagagtgaag acgaagagat gctggaaatc 1440

cgacagctgg caaagcaaat tcgagagaaa aagaagttga aaattctgga gtccaaagaa 1500

aagaatacac agggacccag gatgccgcga actgctaaga aggttcagag gacagttttg 1560

gagaaggaga tgcgtagtct tggtgttgac atggacgata aagacgatgc ccattacgca 1620

gtccaggcaa gaagatcccg gagcatcact aggaaaagaa agcgggaaga ctctgctccc 1680

ccgtcctctg tggcccggag tgggagttgc tctcgaactc cacgtgacgt ttctggtctt 1740

agggatgtca agatggtgaa gaaagccaag actatgatga agaatgctca gaagaagatg 1800

aatcggttgg ggaagaaagg ggaggcggat agacacgtgt ttgatatgaa gcccaagcac 1860

ttgctgtctg ggaagaggaa agctggtaaa aaggacagga gatag 1905

Claims

1.GTPBP4蛋白作为IFN-β抑制剂的应用；所述GTPBP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2. GTPBP4蛋白作为小核糖核酸病毒科病毒表达增效剂或生产增效剂的应用；所述GTPBP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3. GTPBP4蛋白表达抑制剂在制备预防或治疗塞内卡病毒感染药物、药物组合物或疫苗组合物中的应用，所述GTPBP4蛋白表达抑制剂包括如下所示的siRNA序列：

F：5’-GGAUGUGCACAGUGAUCAATT-3’；

R：5’-UUGAUCACUGUGCACAUCCTT-3’；

所述GTPBP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种抑制GTPBP4蛋白表达的重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒包括慢病毒载体和如下任一所示的sgRNA序列：

sgRNA1：GTGCCGTCCGCCAAGGTAGG；

sgRNA2：GTGGTGCCGTCCGCCAAGGT。

5.一种促进塞内卡病毒复制的细胞系的制备方法，其特征在于，所述方法为：

（1）使用限制性内切酶对慢病毒载体质粒进行酶切，将慢病毒质粒和GTPBP4基因进行连接反应；连接产物转入感受态细胞，构建慢病毒质粒；

（2）待宿主细胞生长至80%左右，将构建的慢病毒质粒进行慢病毒包装，从而得到Lenti-GTPBP4-puro慢病毒；

（3）用Lenti-GTPBP4-puro慢病毒感染细胞，加入嘌呤霉素筛选得到促进塞内卡病毒复制的细胞系。

6.一种抗塞内卡病毒感染的动物育种细胞系的制备方法，其特征在于，所述方法为：

（1）合成针对GTPBP4基因序列的sgRNA，其两端加入BbsI酶切位点；使用BbsI核酸内切酶对慢病毒载体质粒和sgRNA进行酶切连接，转入感受态细胞，构建慢病毒质粒；所述sgRNA的序列包括：

sgRNA1：GTGCCGTCCGCCAAGGTAGG；

sgRNA2：GTGGTGCCGTCCGCCAAGGT；

（2）待宿主细胞生长至80%左右，将慢病毒质粒进行慢病毒包装，从而得到Lenti-sgRNA-Cas9-puro慢病毒；

（3）用Lenti-sgRNA-Cas9-puro慢病毒感染细胞，加入嘌呤霉素筛选得到抗塞内卡病毒感染的动物育种细胞系。