CN112245568B

CN112245568B - E184l基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用

Info

Publication number: CN112245568B
Application number: CN202011121313.4A
Authority: CN
Inventors: 郑海学; 朱紫祥; 李莎莎; 党文; 杨帆; 曹伟军; 杨金平; 刘会胜; 刘华南; �田宏; 张克山; 孙研; 刘湘涛
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-10-20
Filing date: 2020-10-20
Publication date: 2022-05-17
Anticipated expiration: 2040-10-20
Also published as: CN112245568A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及E184L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用。本发明首先发现了非洲猪瘟病毒E184L蛋白能够抑制poly(dA:dT)诱导的IFN‑β、NF‑κB及ISRE启动子的激活，抑制poly(dA:dT)诱导的IFN‑β及其下游因子ISG15、ISG54、IL‑6、MCP1和TNF‑α等细胞因子的产生，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用；其次本发明通过基因工程手段在非洲猪瘟亲本毒株ASFV CN/GS/2018中缺失E184L基因编码蛋白的免疫抑制功能，降低了亲本毒株的免疫抑制活性，获得了一株安全性高的减毒非洲猪瘟候选疫苗株；所述减毒非洲猪瘟候选疫苗株免疫猪后，降低了猪的免疫抑制活性和致病性，其免疫后能够诱导显著的中和抗体产生，可作为安全和有效的防控非洲猪瘟疫情的候选疫苗毒株，具有极大的社会价值。

Description

E184L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种E184L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus， ASFV)引起的猪的一种接触传染性、广泛出血性烈性传染病，患病猪出现体温升高、呼吸困难、黏膜广泛出血等临床症状，具有发病病程短、病死率高等特征，强毒株可导致家猪在感染后5-14天内死亡，死亡率接近100％，是危害世界养猪业健康发展最严重的传染病之一。 ASF疫情在全球呈流行扩大趋势，周边国家疫情逐年增多，存在自然疫病病源地。目前，仍然缺乏有效的疫苗和疾病控制措施，一旦发生非洲猪瘟疫情，要彻底根除，对疫区的隔离和对受感染动物进行扑杀仍然是主要应对方法。因此，研究病毒结构，免疫逃逸机制，以及免疫保护机制的阐明，进而研发出安全有效的疫苗十分重要。

ASFV属于双链DNA病毒，是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)，非洲猪瘟病毒属的唯一成员，也是唯一通过节肢动物，即软蜱传播的DNA病毒。ASFV结构复杂、是一种大型包膜病毒，平均直径约为200nm，病毒基因组庞大，为线性双链DNA，全长170～194kb，编码大约150～200种蛋白，其中许多蛋白对病毒复制非必须的，但在病毒逃逸宿主免疫防御方面有着重要作用，涉及的免疫逃逸机制复杂。

天然免疫(innate immunity)是宿主抵抗外来病原感染的必不可少的第一道防线，主要由生理屏障、化学屏障和免疫细胞、分子构成。天然免疫通过模式识别受体(PRRs)识别侵入宿主机体的病原相关分子模式(PAMPs)。DNA病毒入侵猪体内产生的病原DNA可被受体环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cyclic GMP-AMP synthase，cGAS)识别并通过接头蛋白髓样细胞分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MyD88)和干扰素刺激基因(stimulator of i nterferon genes，STING)，激活转录因子干扰素调节因子3(IFNregulatory factor 3，IRF3) 和NF-κB(nuclear factorκB)，IRF3在此过程中聚合形成二聚体并和NF-κB一起转移至细胞核内诱导产生I型干扰素(type I interferon，IFN-I或IFNα/β)抵御病原入侵。

ASFV主要感染单核-吞噬细胞系统，包括高度分化的组织巨噬细胞和淋巴结、脾、肾、肝等器官的网状细胞的特定亚类，并在其内进行复制，这种感染机制有利于ASFV抑制或控制宿主免疫应答。ASFV成功入侵的重要前提是跨越巨噬细胞自身针对病原体的免疫防线，因此鉴定参与免疫抑制的蛋白及其在病毒复制过程中的作用刻不容缓。大约30％的ASFV基因组编码一系列的旁系同源基因，如多基因家族MGF100、110、300、360、505/530和p22，它们在基因组中都有多个拷贝。MGFs位于基因组左40kb和右20kb的可变区内。已有研究表明，巨噬细胞中，MGF360和MGF530家族的多个基因缺失导致病毒滴度呈100或者1000倍降低，并且上调Ⅰ型干扰素及Ⅰ型干扰素刺激基因的表达。这些结果表明这两个家族中有某些基因参与了免疫抑制。CN106459931A专利公开了缺失多基因家族360基因9L，10L，11L，12L，13L和14L以及多基因家族505基因1R，2R，3R和4R的功能性形式的减毒非洲猪瘟病毒：还提供了缺乏DP148R基因的功能性形式的减毒非洲猪瘟病毒。

通过敲除毒力基因、免疫抑制基因等获得减毒非洲猪瘟疫苗是目前疫苗研究的重点方向。但是不同基因型采用相同的基因缺失策略，致弱效果差别较大；同时，缺失不彻底可能引起免疫副反应及田间散毒；删除有些基因可能导致病毒无法复制；以及多基因缺失造成的过度致弱会使致弱毒株失去保护作用等问题也限制了非洲猪瘟疫苗的研制进度。因此在具体研究过程中需要设计考虑好疫苗的安全性和有效性的平衡。

本发明首先研究鉴定发现非洲猪瘟病毒E184L蛋白能够抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β、 NF-κB及ISRE启动子的激活，抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β及其下游因子ISG15、ISG54、 IL-6、MCP1和TNF-α等细胞因子的产生，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用；其次本发明通过基因工程手段在非洲猪瘟亲本毒株ASFV/CN/GS/2018中缺失了E184L 基因编码蛋白的免疫抑制功能，降低了亲本毒株的免疫抑制活性，获得了一株安全性高的减毒非洲猪瘟候选疫苗株；所述减毒非洲猪瘟候选疫苗株免疫猪后，降低了猪的免疫抑制活性和致病性，其免疫后能够诱导显著的抗体产生，可作为安全和有效的防控非洲猪瘟疫情的候选疫苗，具有极大的社会价值。

发明内容

首先本发明发现，非洲猪瘟病毒E184L蛋白能够抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β、NF-κB 及ISRE启动子的激活，抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β及其下游因子ISG15、ISG54、IL-6、 MCP1和TNF-α等细胞因子的产生，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用。因此，本发明的目的在于：

提供一种非洲猪瘟病毒E184L蛋白作为免疫抑制剂的应用。

优选地，所述免疫抑制剂包括I型干扰素抑制剂、促炎性因子抑制剂、干扰素刺激基因 ISGs抑制剂。

提供一种非洲猪瘟病毒E184L蛋白在制备用于抑制I型干扰素产生的药物或药物组合物中的应用。

提供一种非洲猪瘟病毒E184L蛋白在制备用于抑制促炎性因子产生的药物或药物组合物中的应用。

提供一种非洲猪瘟病毒E184L蛋白在制备用于抑制干扰素刺激基因ISGs表达的药物或药物组合物中的应用。

优选地，所述非洲猪瘟病毒E184L蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述编码非洲猪瘟病毒E184L蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

其次，本发明通过在亲本非洲猪瘟病毒ASFV/CN/GS/2018分离株中缺失了E184L基因编码蛋白的功能，构建获得了一种E184L基因编码蛋白的功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株，所述减毒非洲猪瘟病毒株对天然免疫的抑制能力显著减弱，可作为重组疫苗株应用。因此，本发明的另一目的在于：

提供一种通过缺失非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的功能制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用。所述缺失非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的功能是指通过缺失非洲猪瘟病毒E184L 基因的全部或部分核苷酸序列使非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的功能丧失。

优选地，所述缺非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的功能是指通过缺失非洲猪瘟病毒 E184L基因的全部核苷酸序列使非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的功能丧失。

优选地，所述非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

优选地，所述编码非洲猪瘟病毒E184L基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

提供一种通过缺失非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的功能制备减毒非洲猪瘟疫苗株的应用。所述缺失非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的功能是指通过缺失非洲猪瘟病毒E184L 基因的全部或部分核苷酸序列使非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的功能丧失。

提供一种E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株，所述减毒非洲猪瘟病毒株包括将亲本非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的功能丧失。所述缺失非洲猪瘟病毒E184L 基因编码蛋白的功能是指通过缺失非洲猪瘟病毒E184L基因的全部或部分核苷酸序列使非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的功能丧失。

优选地，所述非洲猪瘟病毒为ASFV/CN/GS/2018分离株。

优选地，所述减毒非洲猪瘟病毒株相较于ASFV/CN/GS/2018分离株全长序列缺失了第 161650-162204位核苷酸。

优选地，所述减毒非洲猪瘟病毒株还包括CD2v基因、MGF-360-12L基因、MGF-360-13L 基因、MGF-360-14L基因、MGF-360-505R基因等中一种或几种基因序列的缺失。

提供一种非洲猪瘟疫苗，所述疫苗包含E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株。

提供一种E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株的制备方法，所述方法为：通过基因工程手段将亲本毒株的E184L基因编码蛋白功能进行丧失。

优选地，所述非洲猪瘟病毒为ASFV/CN/GS/2018分离株。

优选地，所述方法为同源重组技术，所述方法包括以下步骤：

(1)设计ASFV E184L基因上下游序列作为左右同源重组臂，并分别克隆入pUC19载体中，获得重组转移载体；

(2)在步骤(1)所述重组转移载体左、右臂基因序列中插入筛选表达盒基因片段，获得同源重组转移载体；

(3)将步骤(2)所述同源重组转移载体转染至感染了亲本非洲猪瘟毒株的BMDM细胞，纯化筛选获得E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株。

提供一种根据上述方法制备获得的E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株。

本发明的有益效果是：

①本发明首先发现非洲猪瘟E184L蛋白能够抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β、NF-κB及 ISRE启动子的激活，抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β及其下游因子ISG15、ISG54、IL-6、MCP1 和TNF-α等细胞因子的产生，具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂应用；

②其次本发明通过基因工程手段在非洲猪瘟亲本毒株ASFV/CN/GS/2018中缺失了E184L 基因编码蛋白的免疫抑制功能，降低了亲本毒株的免疫抑制活性，获得了一株安全性高的减毒非洲猪瘟候选疫苗株；所述减毒非洲猪瘟候选疫苗株免疫猪后，降低了猪的免疫抑制活性和致病性，其免疫后能够诱导显著的抗体产生，可作为安全和有效的防控非洲猪瘟疫情的候选疫苗，具有极大的社会价值。

附图说明

图1 ASFV E184L蛋白抑制IFN-β、NF-κB及ISRE启动子的激活的结果；其中A为共转染pIFN-β-Luc质粒、pRL-TK质粒和不同剂量的E184L表达质粒(0-Vector、50、100、200ng/孔)的结果；B为共转染pISRE-Luc质粒、pRL-TK质粒和不同剂量的E184L表达质粒(0-Vector、 50、100、200ng/孔)的结果；C为共转染pNF-κB-Luc质粒、pRL-TK质粒和不同剂量的E184L 表达质粒(0-Vector、50、100、200ng/孔)的结果；Control为不转染poly(dA:dT)，Vector为不转染E184L表达质粒，只转染空载体质粒；

图2 ASFV E184L蛋白抑制IFN-β蛋白表达的检测结果；其中Mock为不转染poly(dA:dT)， Vector为不转染E184L表达质粒；

图3 ASFV E184L蛋白抑制IFN-β及下游细胞因子mRNA表达的检测结果；其中A为IFN-βmRNA检测结果；B为ISG15 mRNA检测结果；C为ISG54 mRNA检测结果；D为IL-6 mRNA检测结果；E为MCP1 mRNA检测结果；F为TNF-αmRNA检测结果；

图4制备E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株使用的同源重组转移载体构建示意图；

图5 E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L的P11代重组病毒荧光检测结果；

图6 E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L基因缺失PCR 鉴定图；

图7 E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L与亲本毒株在细胞中的复制比较结果；

图8 E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L与亲本毒株在动物中诱导干扰素表达的比较结果；

图9 E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L与亲本毒株在动物中的致病能力比较结果；

图10 E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L与亲本毒株感染动物后体内带毒水平比较结果。

图11 E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L与亲本毒株感染动物后体内中和抗体水平比较结果。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。但本发明的保护范围并不局限于以下实施例所述。

以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和非洲猪瘟实验室活动许可：

中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和非洲猪瘟相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业农村部关于开展高致病性ASFV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。

以下实施例中所述的实验细胞、病毒以及质粒来源：

原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)及原代骨髓巨噬细胞(BMDM)取自2-4月龄健康长白猪，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液(购自Biosharp公司)，去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞沉淀重悬于含有10％FBS(购自PAN公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco 公司)中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。BMDM细胞培养需在RPMI 1640完全培养基中额外添加10ng/mL终浓度的GM-CSF(购自R&D Systems公司)，置于37℃、5％CO₂培养箱中诱导，每2-3天洗涤一次，将未贴壁细胞离心后重新加入新的细胞皿中，换液继续诱导，经3-7天后冻存或使用。利用PAM细胞扩增ASFV，并进行病毒含量的滴定，BMDM细胞用于质粒转染和病毒重组实验。

ASFV/CN/GS/2018分离株为中国农业科学院兰州兽医研究所非洲猪瘟区域实验室分离株，属于基因II型，病毒效价为5×10⁷TCID₅₀/mL，为PAM细胞扩繁后的第4代种毒，分装保存于-80℃备用。

peGFP-N1载体、pUC57载体均购买于兰州瑞博莱生物科技有限公司；无内毒素的质粒提取试剂盒，购于OMEGA公司。

HEK-293T细胞，购于ATCC公司；pIFN-β-Luc质粒、pISRE-Luc质粒、pNF-κB-Luc质粒、pRL-TK质粒、poly(dA:dT)由兰州瑞博莱生物科技有限公司构建。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域知晓的操作方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买获得。

定义

术语“蛋白功能丧失”是指通过对编码蛋白的基因进行敲除、突变或在编码蛋白的基因片段中插入部分基因，使得基因编码蛋白发生移码突变，导致基因编码蛋白的功能丧失。本发明的目的在于通过对非洲猪瘟病毒中ASFV E184L基因的部分或全部核苷酸序列进行敲除，导致ASFV E184L基因编码蛋白的功能丧失，进而构建了ASFV E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒，并用于非洲猪瘟疫苗的生产。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使ASFV E184L基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、移码缺失、插入核苷酸序列等。

术语“基因缺失”是指缺失是指染色体上某一区段及其带有的基因一起丢失，从而引起变异的现象，本发明的目的在于通过缺失ASFV E184L基因的部分或全部核苷酸序列获得减毒非洲猪瘟重组病毒，降低亲本毒株的毒性。根据本领域技术人员的公知常识，除了上述基因编辑手段，还可以采用其它基因编辑手段使ASFV E184L基因编码的蛋白功能同时丧失，例如：移码突变、点突变、移码缺失、插入核苷酸序列等。

术语“基因突变”是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，就是在一个位点上，突然出现了一个新基因，代替了原有基因，这个基因叫做突变基因，基因突变导致后代的表现中也就突然地出现从未有的新性状。在本发明中通过缺失ASFV E184L基因的部分或全部核苷酸序列，使ASFV E184L基因编码的蛋白无法正常表达，导致ASFV E184L基因编码蛋白的功能缺失，获得减毒非洲猪瘟重组病毒，降低了亲本毒株的毒性的基础上，本领域技术人员通过将ASFV E184L基因突变，或基因片段插入，导致基因编码的蛋白发生移码突变使得ASFV E184L基因编码蛋白的原有的性能消失，实现减毒非洲猪瘟重组病毒的构建。

基因缺失的方法一般是指基因敲除，是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。基因敲除的方法一般包括：同源重组技术、随机插入突变技术以及RNA 干扰技术；其中，同源重组技术又叫基因打靶，是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合到预定的位置上，从而改变某些遗传特性的方法，重组的目的是为了敲除某个基因；随机插入突变技术是指利用某些能随机插入基因序列的病毒、细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞；RNA干扰技术是指由与生物体内源靶基因mRNA同源的双链RNA特异性引发的靶mRNA降解，导致目的基因表达沉默的一种反向遗传学技术。

本发明虽然仅通过同源重组技术对ASFV E184L基因进行敲除，但是通过上述随机插入突变技术以及RNA干扰技术也能够对ASFV E184L基因进行敲除。

本发明以ASFV/CN/GS/2018分离株为例，所述的ASFV E184L基因位于ASFV/CN/GS/2018分离株全基因序列的第161650-162204位，本发明通过同源重组技术在 ASFV/CN/GS/2018分离株中敲除ASFV E184L基因全部核苷酸序列，使ASFV E184L基因编码的蛋白无法正常表达，成功构建了ASFV E184L基因缺失的减毒非洲猪瘟病毒株，并作为疫苗侯选株。由于不同非洲猪瘟病毒中ASFV E184L基因基因编码蛋白的序列具有高度同源性，因此，在其它非洲猪瘟病毒中丧失ASFV E184L基因编码蛋白的功能也能够成功构建出减毒非洲猪瘟病毒株。

术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。本发明的疫苗是遗传工程改造的基因缺失减毒病毒疫苗，其中所述缺失的基因为ASFV E184L基因，应当理解的是所述缺失的基因还可以包括毒力基因(例如 CD2v基因、MGF-360-12L基因、MGF-360-13L基因、MGF-360-14L基因、MGF-360-505R基因等)中的任何一种或几种；突变被理解为在亲本ASFV/CN/GS/2018毒株中野生型或未修饰的ASFV E184L基因的遗传信息中的变化。应当理解的是，由ASFV E184L基因突变获得重组突变体也可以作为减毒病毒疫苗。

本发明的减毒非洲猪瘟病毒疫苗，进一步任选地包含一种或多种佐剂，赋形剂，载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂，化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。

本发明公开的疫苗也可被用于制备联合疫苗，如与猪的其他疫苗联合，但重点在减毒活疫苗上，尤其是病毒基因的整合，如双价苗，三价苗等。联合疫苗可以包含不同基因型的多种减毒非洲猪瘟病毒，如此可以诱导针对多种非洲猪瘟病毒基因型的交叉保护性免疫应答。

本发明的疫苗的施用可以采用方便的途径，例如肌内注射，鼻内，口服，皮下，透皮和阴道等途径。本发明的减毒疫苗优选采用肌肉注射。疫苗可以在初免-加强方案后施用。例如，在第一次接种后，受试者可以在一段时间(例如约7，14，21或28天)之后接受第二次加强施用。通常，加强施用的剂量相同或低于初免使用的剂量。此外，也可以进行第三次加强免疫，例如免疫后2-3个月、6个月或一年。

实施例1 E184L蛋白免疫抑制活性检测

1.E184L蛋白抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β、ISRE及NF-κB启动子活性的检测

E184L表达质粒构建：通过RT-PCR扩增非洲猪瘟病毒E184L蛋白编码序列，构建E184 L表达质粒。其中正向引物为5’-TTTTGCGGCCGCGATGTTGGTGATCTTCTTGGGAATT-3’(S EQID NO：3所示)；反向引物为5’-TTTCGTCGACTTAACTATTATTTTCTTTCCACTCT- 3’(SEQ ID NO：4所示)；通过NotI和SalI分别酶切扩增的片段及FLAG-CMV-7.1载体，纯化回收后利用T4连接酶进行连接，将E184L编码序列构建入FLAG-CMV-7.1载体中，获得E184L表达质粒。用去内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒DNA，测定浓度，-20℃保存备用。通过基因序列测定，显示所述E184L基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1，其核酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述E184L表达质粒中E184L编码序列为非洲猪瘟病毒ASFV/CN /GS/2018分离株全基因序列第161650-162204位的核苷酸序列。

IFN-β、ISRE及NF-κB启动子活性的检测：将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔内。待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂分别转染IFN-β启动子质粒(pIFN-β-Luc 质粒，100ng/孔)、ISRE启动子质粒(pISRE-Luc质粒，100ng/孔)、NF-κB启动子质粒 (pNF-κB-Luc，100ng/孔)和不同剂量的E184L表达质粒(0、50、100、200ng/孔)以及荧光素酶报告质粒pRL-TK(10ng/孔)共转染24小时后，再次转染poly(dA:dT)，刺激12小时后收集细胞，按照试剂盒(购自Promega公司)操作步骤

and

1000Assay Protocols)进行双荧光素酶活性检测。

结果如图1所示，其中A为共转染pIFN-β-Luc质粒、pRL-TK质粒和不同剂量的E184L表达质粒(0-Vector、50、100、200ng/孔)的结果；B为共转染pISRE-Luc质粒、pRL-TK质粒和不同剂量的E184L表达质粒(0-Vector、50、100、200ng/孔)的结果；C为共转染pNF-κB-Luc质粒、pRL-TK质粒和不同剂量的E184L表达质粒(0-Vector、50、100、200ng/孔)的结果；Control为不转染poly(dA:dT)，Vector为不转染E184L表达质粒，只转染空载体质粒；结果表明，在Vector组中，相较于未转染poly(dA:dT)组，转染poly(dA:dT)后，IFN-β、ISRE和NF-κB启动子活性显著增加；而在poly(dA:dT)组中，相较于未转染E184L表达质粒组，共同转染poly(dA:dT)和E184L表达质粒(50、100、200ng/孔)后，IFN-β、ISRE和NF-κB启动子活性显著降低，且转染E184L表达质粒的剂量越高，IFN-β、ISRE和NF-κB启动子活性降低越显著。说明，E184L能够抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β、ISRE和NF-κB启动子的活性，抑制IFN-β、ISRE和NF-κB启动的基因表达，具有免疫抑制作用。

2.E184L蛋白抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β及下游细胞因子活性检测

(1)IFN-β蛋白含量的检测

将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔内。待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂转染E184L表达质粒(200ng/孔)，转染24小时后，再次利用脂质体转染poly(dA:dT)(1000ng/孔)，转染12小时后收取上清，按照IFN-βELISA检测试剂盒(购自欣博盛公司)操作步骤进行IFN-β蛋白含量的检测。具体包括如下步骤：

将试剂盒提前平衡至室温，提前配置所需要的试剂。从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，空白孔加标准品&标本通用稀释液，其余相应孔中加标准本或不同浓度标准品 (100μl/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃温箱孵育90分钟；

提前20分钟准备生物素化抗体工作液；

洗板5次，空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。封住反应孔，37℃温箱孵育60分钟；

提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25℃)放置；

洗板5次，空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱，避光孵育30分钟。打开酶标仪电源，预热仪器，设置好检测程序；

洗板5次，加入显色底物TMB(100μl/孔)，避光37℃孵箱，避光孵育15分钟；

加入反应终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。

结果判断：每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值，以标准品浓度作横坐标， OD值作纵坐标，用软件绘制标准曲线，通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。

结果如图2所示，其中Mock为不转染poly(dA:dT)，Vector为不转染E184L表达质粒；结果表明，在Vector组中，相较于未转染poly(dA:dT)组，转染poly(dA:dT)后，IFN-β含量显著增加；而在poly(dA:dT)组中，相较于未转染E184L表达质粒组，共同转染poly(dA:dT) 和E184L表达质粒(200ng/孔)后，IFN-β含量显著降低；说明E184L能够抑制poly(dA:dT) 诱导的IFN-β蛋白的表达，具有免疫抑制作用。

(2)IFN-β及下游细胞因子mRNA含量检测

将HEK-293T细胞铺置于24孔板的单个孔内。待细胞长至70％-80％融合度的时候，利用脂质体试剂转染E184L表达质粒(200ng/孔)，转染24小时后，再次利用脂质体转染poly(dA:dT)(1000ng/孔)，转染12小时后收取上清，提取总RNA(细胞RNA和组织RNA)；

取制备好的总RNA，进行反转录后，利用Takara公司的TB Green Premix Ex Taq^TMII (TliRNaseH Plus)试剂盒，按照如下体系和程序进行实时定量PCR检测：

反应体系：2×TB Green Premix Ex Taq，5μl；上游引物(10μM)，0.2μl；下游引物(10μM)， 0.2μl；H₂O，4.1μl；cDNA模板，0.5μl。

反应程序：95℃，2分钟；95℃10秒，60℃34秒，40个循环；Melt Curve；25℃保存。

检测结果如图3所示，其中A为IFN-βmRNA检测结果；B为ISG15 mRNA检测结果； C为ISG54 mRNA检测结果；D为IL-6mRNA检测结果；E为MCP1 mRNA检测结果；F为 TNF-αmRNA检测结果；Mock为不转染poly(dA:dT)，Vec为不转染E184L表达质粒。结果表明，在Vec组中，相较于未转染poly(dA:dT)组，转染poly(dA:dT)后，IFN-β及下游细胞因子ISG15、ISG54、IL-6、MCP1和TNF-α的mRNA表达显著增加；而在poly(dA:dT)组中，相较于未转染E184L表达质粒组，共同转染poly(dA:dT)和E184L表达质粒(200ng/孔)后， IFN-β及下游细胞因子ISG15、ISG54、IL-6、MCP1和TNF-α的mRNA表达显著降低；说明E184L能够抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β及下游细胞因子ISG15、ISG54、IL-6、MCP1和 TNF-α的mRNA表达，抑制IFN-β及下游细胞因子ISG15、ISG54、IL-6、MCP1和TNF-α，表明E184L具有免疫抑制作用。

综上所述，非洲猪瘟病毒E184L蛋白能够抑制poly(dA:dT)诱导的IFN-β、ISRE和NF-κB 启动子活性，抑制IFN-β及促炎性因子IL-6和TNF-α及下游抗病毒细胞因子ISG15、ISG54 及MCP1的表达，具有免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂抑制天然免疫反应，并用于制备抑制IFN-β、ISRE和NF-κB启动子活性，以及IFN-β、ISG15、ISG54、IL-6、MCP1和TNF-α等抗病毒细胞因子相关药物或药物组合物。

实施例2 E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株的构建及纯化鉴定

本发明所用原代猪肺泡巨噬细胞(PAM)及原代骨髓巨噬细胞(BMDM)取自2-4月龄健康猪(购自中国农业科学院兰州兽医研究所动物中心)，无菌采集细胞后，用红细胞裂解液 (购自Biosharp公司)去除红细胞，低速离心后，弃上清，将细胞重悬于含有10％FBS(购自PAN公司)的RPMI 1640完全培养基(购自Gibco公司)中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。BMDM细胞培养需在RPMI 1640完全培养基中额外添加10ng/mL终浓度的重组猪 GM-CSF(购自R&D Systems公司)，置于37℃、5％CO₂培养箱中诱导，每2-3天洗涤一次，将未贴壁细胞离心后重新加入新的细胞瓶中，换液继续诱导，经3-7天后冻存或使用。利用P AM细胞扩增ASFV，并进行病毒效价的测定，BMDM细胞用于质粒转染和病毒重组实验。获得的减毒非洲猪瘟病毒ASFVΔE184L的病毒效价为10⁶HAD₅₀。具体构建过程如下：

1.eGFP筛选表达盒构建

为了便于筛选，共构建一套筛选标记基因的表达盒，即增强型绿色荧光蛋白(Enhance Green fluorescent protein，eGFP)基因筛选表达盒构建：

参照文献(O'Donnell V,Holinka LG,Krug PW,Gladue DP,Carlson J,SanfordB,Alfa no M,Kramer E,Lu Z,Arzt J,Reese B,Carrillo C,Risatti GR,BorcaMV.African Swine Fever Virus Georgia 2007 with a Deletion of Virulence-Associated Gene 9GL(B119L),whe n Administered at Low Doses,Leads to VirusAttenuation in Swine and Induces an Effecti ve Protection against HomologousChallenge.JVirol.2015；89(16):8556-66)，通过PCR扩增p 72启动子(从p72基因上游的-196nt到+17之前序列)，备用；扩增引物为：正向引物5’-TT ATAAAACATATGTTCATAAAAAGGGTCGCCGGAGGAAAAGTC-3’(SEQ ID NO：5所示) 和反向引物5’-CTCCTCGCCCTTGCTCACCATATATAATGTTATAAAAATAATT-3’(SEQ ID N O：6所示)；以peGFP-N1载体为模板，扩增eGFP基因，备用，扩增引物为：正向引物5’- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’(SEQ ID NO：7所示)和反向引物5’-ACCACAACTA GAATGCAGTG-3’(SEQ ID NO：8所示)；

参照文献(Borca MV,Holinka LG,Berggren KA,Gladue DP.CRISPR-Cas9,a toolto efficiently increase the development of recombinant African swine feverviruses.Sci Rep.20 18；8(1):3154.)，将上述步骤扩增获得的p72启动子和eGFP两个基因通过融合PCR的方法连接，获得eGFP筛选表达盒基因片段，命名为p72-eGFP-SV40polyA(SEQID NO：9)，该表达盒序列含SV40polyA终止序列。

2.同源重组转移载体的构建

利用pUC57载体作为骨架载体，构建E184L基因敲除用同源重组转移载体。具体步骤为：设计E184L基因上下游序列约1kb作为同源重组臂，左臂(Left arm，SEQ ID NO：10所示) 和右臂(Right arm，SEQ ID NO：11所示)，分别克隆入骨架载体pUC57载体中，在E184 L的重组转移载体的左、右臂基因序列中间插入p72-eGFP-SV40polyA筛选表达盒基因片段。经测序正确后，将该同源重组转移载体命名为pUC-LRΔE184L-eGFP；用去内毒素的质粒提取试剂盒提取质粒DNA，测定浓度，-20℃保存备用。所述E184L基因的氨基酸序列见SEQ IDNO：1，其核酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述缺失的E184L基因序列为非洲猪瘟病毒ASFV/CN/GS/2018分离株全基因序列第161650-162204位的核苷酸序列，构建策略见图4。

3.细胞转染和重组病毒筛选

将同源重组转移质粒pUC-LRΔE184L-eGFP(2μg)用

-Macrophage DNA转染试剂转染至猪BMDM细胞(细胞数约为10⁶个/孔)，转染6h后，直接感染ASFV/CN/GS/2018，不换液，至感染48小时，在荧光显微镜下观察荧光细胞数，消化细胞，挑取所有单孔中的荧光细胞，在新的培养皿中小心吹散，沉降1小时，挑取所有单个荧光细胞，反复冻融后，接种预先铺好的96孔板BMDM细胞，每12小时观察一次，观察出现荧光的细胞孔，标记后，继续观察至72小时；结果如图5所示，在荧光显微镜下可见有零星绿色荧光，即视为可疑重组毒感染的细胞。挑取荧光细胞，在新的培养皿中小心吹散，沉降1小时，挑取单个荧光细胞，收集后反复冻融3次，接种预先铺好的96孔板PAM细胞中，每12小时观察一次，观察出现荧光的细胞孔并标记，继续观察至72小时。荧光细胞数量比例达100％的为全阳性孔，这说明重组毒构建基本成功。

4.重组病毒PCR鉴定

对该全阳性孔进行10次有限稀释扩大培养，挑取第11代重组病毒孔消化成单个细胞，小心吸取10个荧光细胞，分别接种于预先铺好的96孔板PAM细胞中，继续生长72小时。挑取GFP荧光较多的细胞，用病毒基因组提取试剂盒(购自北京天根生物科技公司)提取A SFV和基因缺失ASFV的基因组，用针对E184L-F/R的引物进行PCR鉴定，确认是否缺失成功，其中E184L-F：5’-CATGCACTTCGGTGAAAAACT-3’(SEQ ID NO：12)，E184L-R：5’ -GAGAATACATAAGGGTTTGCGT-3’(SEQ ID NO：13)。

结果如图6所示，当以野生型ASFV基因为模板时，E184L-F/R引物可以扩增出明显的条带(图6，ASFV WT)，当以获得的ASFV E184L的基因缺失的病毒基因为模板时，E184 L-F/R引物扩增不出条带(图6，ASFVΔE184L)，结果表明重组毒中ASFV E184L蛋白的编码基因已缺失并已纯化，并命名其为减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L。为证实ASFVΔE18 4L发生了复制，同时利用MGF505-7R引物对野生型ASFV和ASFVΔE184L毒株提取的核酸进行PCR检测，其中MGF505-7R-F：5’-GGAGAAGAGGGAAACAA-3’(SEQ ID NO：14)， MGF505-7R-R：5’-CCAGCACAAAGGGTAA-3’(SEQ ID NO：15)。结果均扩增到了MGF5 05-7R条带，表明了ASFV和ASFVΔE184L病毒均进行了复制。

实施例3减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L在PAM细胞中的病毒滴度测定

非洲猪瘟病毒的滴定分别采用半数血球吸附量(50％haemadsorption，HAD₅₀)两种方法进行操作。将上述重组病毒进行10倍梯度稀释，取100μl接种预先铺好的96孔中形成单层的猪原代PAM细胞，每孔加25μl的1％红细胞悬液，病毒感染可根据红细胞在感染细胞周围聚集形成的玫瑰花环进行判定，培养12-16h可进行第一次读板，连续观察7天，根据Reedand Muench方法计算半数血球吸附剂量(HAD₅₀)。结果显示：在感染后48小时，减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L的平均滴度为10^4.5/mL，而亲本毒株ASFV/CN/GS/2018亲本毒平均滴度为10⁵/mL。减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L的滴度低于亲本毒株ASFV/CN/GS/2018。

实施例4减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L的细胞感染结果

分别用10HAD₅₀P12代的亲本毒株ASFV/CN/GS/2018及减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L接种感染PAM细胞，分别在接种后0、3、18、36、48、72h后收取细胞样品，提取细胞总RNA，用ASFV P30特异性引物进行Q-PCR实验，检测ASFV P30 mRNA含量。

结果如图7所示，其中，MOCK为空白对照；亲本毒株ASFV/CN/GS/2018(ASFV WT) 接种感染PAM细胞后，ASFV P30 mRNA含量表达随接种时间的延长而逐渐增加；相较于亲本毒株ASFV/CN/GS/2018，虽然减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L接种感染PAM细胞后 ASFV P30mRNA含量表达随接种时间的延长也逐渐增加，但是相对于同一时间对应的亲本毒株ASFV/CN/GS/2018，减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L接种感染PAM细胞后ASFV P 30mRNA含量显著降低。表明，与野生毒株相比，缺失E184L基因后的减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L的复制能力减弱，但并不完全抑制病毒的复制。

实施例5减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L的动物攻毒实验结果

为了检测E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L的致病变能力，在中国农业科学院兰州兽医研究所生物安全三级实验动物房中进行引进8头7周龄健康大三元仔猪。待猪适应2-3天后，分为3组，分别经肌肉注射相同感染剂量的减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L和亲本毒株ASFV/CN/GS/2018进行攻毒，利用PBS注射作为未感染对照。攻毒后，持续观察动物的精神状况、采食情况，监测动物体温，采集抗凝血液和分离血清，观察至20天终止。实验方案如表1所示。

表1动物攻毒实验方案

实验结果：通过致病性评价发现，接种亲本毒株ASFV/CN/GS/2018后的所有仔猪均出现体温升高，精神沉郁，7天左右开始死亡，并在9天内全部死亡；血清中干扰素应答非常弱 (图8)，其剖检可见淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏等部位严重出血(图9)，心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、膀胱、淋巴结等脏器均带毒(图10)。而接种减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L 后，三头猪体温均在正常范围内且未见任何异常临床表现，剖检存活猪只病理变化不显著(图9)，组织器官病毒含量与亲本毒株接种猪相比显著降低(图10)。此外，ASFVΔE184L接种猪血清中干扰素含量与亲本毒株ASFV/CN/GS/2018感染猪的血清中干扰素IFN-β含量相比显著升高(图8)，其免疫后能够诱导显著的p30中和抗体产生(图11)，表明ASFVΔE184L免疫应答能力显著提升。

上述结果表明，减毒非洲猪瘟病毒株ASFVΔE184L对猪的免疫抑制作用充分减弱，对猪的致病性显著下降，能够诱导高效中和抗体产生，所述ΔE184L可以作为构建基因缺失疫苗的靶标。

以上所述的实施例仅表述了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可做出其它改进，这些都属于本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> E184L基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 184

<212> PRT

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 1

Met Leu Thr Pro Ile Thr Cys Thr Ser Val Leu Ala Thr Pro Ala Gly

1 5 10 15

His Leu Leu Thr Ala Gly Ala Ile Ser Ser Gly Leu Ile Ser Thr Val

20 25 30

Cys Thr Ile Leu Ala His Ile Cys His Gly Thr Leu Gly Ala Pro Gly

35 40 45

Ala Gly Gly Gly Gly Thr Pro Ala Leu Ile Leu Gly Leu Pro Ile Ile

50 55 60

Leu Ala Gly Leu Ser Leu Gly Gly Ala Pro Pro Ser Ser Gly Val Leu

65 70 75 80

His Pro Leu His Gly Thr Leu Ile Thr Pro Gly Ala Gly Gly Leu Pro

85 90 95

Gly Leu Met Leu Ala Ala Ile Thr Gly Gly Leu Met Ser Ala Leu Cys

100 105 110

Leu Val Pro Ser Ile Met Ile Gly Ala Gly Gly Pro Leu Leu Thr Gly

115 120 125

Thr Leu Met Thr Ser His Leu Pro Thr Ile Leu Ser Ile Leu Met Val

130 135 140

Ala Ala Ala Leu Thr Gly Gly Gly Ala Pro Thr Gly Pro Pro Ser Leu

145 150 155 160

Ile Ile Gly Gly Thr Leu Thr Ile Leu Leu Leu Leu Leu Ser Gly Ser

165 170 175

Gly Gly Gly Gly Ser His Gly Gly

180

<210> 2

<211> 555

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 2

atgaagacgt ttattacatg cacttcggtg aaaaactact ttcgccaaca tttgaaaacc 60

aaccaaagaa tcagctcaga gcttattagc tacgtgtgca ccattctaaa ccatatctgc 120

catcagtatc ttcagaatcc gcaagcccaa gaggaggaat ggtttgccct gatcaaggaa 180

cttcccatca tcaaagatgg gctctcgaag gaggaaagat tcttctcctc aggtgtgaaa 240

cactttctac atgaatataa aatcacaccc gaaaaccaag aaaaattcca gaaaatgctt 300

aacgccatta cagaacaact gatgagtcgg ctttgcaagg tgttttcaat tatgattcaa 360

cgtcagggtt ttcttaaaac gcaaaccctt atgtattctc acctgtttac cattctaagc 420

atccttatgg tcgcagataa cctgtacggg gaacaagatc ccacggagtt cttttccctt 480

attatagaac aaacaaaaac gattaagaaa aagaagaaga gtggctcgga ggaggaagag 540

agccacgagg agtga 555

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttttgcggcc gcgatgttgg tgatcttctt gggaatt 37

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tttcgtcgac ttaactatta ttttctttcc actct 35

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ttataaaaca tatgttcata aaaagggtcg ccggaggaaa agtc 44

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ctcctcgccc ttgctcacca tatataatgt tataaaaata att 43

<210> 7

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctcctcgccc ttgctcacca tatataatgt tataaaaata att 43

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accacaacta gaatgcagtg 20

<210> 9

<211> 213

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcagctgcag aagacagcaa cttcctgcat gacacccgcg aattcaccag cctagtgcca 60

gatgaggccg ataacaagcc agaggacgac gaggagtccg gggccaagcc aaagaagaag 120

aagcacctct tccccaagct gagcagccac aagagcaagt aaaaattgaa gcgaaaaaaa 180

gtagaaaaaa aaccggtctc ttggcccgga tcc 213

<210> 10

<211> 1200

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 10

cccgcgccgt aacggtgagc gccttaagaa cgcgcccgaa atcatgttgt aatttacttt 60

gtagcttctt ataatttatt cctattccag caaaggatat aatggcctcc attctcacgc 120

tggacgggtt atatgcagag gttccaaaat tcttaccaga ggcgttacga gagggctgtg 180

ctggcaagaa tcctctaagc ttttatattc aacaaatttt aaatttaatg ggatgtgacg 240

gtaacgagta ccatgttctt tttaccagca gctccgagga agcaaatact catatgatca 300

tggccgccgt gcgtcgccat ttgctgcgga cgcagcaaag gcctcatgtc attatcggag 360

cagccgagcc ccctagcgtc accgaatgtg tgaaggcatt ggcgcaggaa aaacgctgcg 420

tatacaccat catcccccta aaaaattttg aaatagatcc tgttgcggta tacgatgcca 480

tacaaagcaa tacctgctta gcgtgcattt caggcactaa tgctgttgtc aaaacgttca 540

acaaactcca ggacatcagc aacgtgttaa aaggtattcc cctgcactca gaagtgagtg 600

atcttgttta tcaaggatgt attcaacaaa atccgcccgc tgatagtttt tcaataaata 660

gtctctacgg cttcctggga gtcggtgttt tgggaatgaa gaaaaaggtc atgcaaggat 720

tggggccgct catttttgga ggagggctga gaggcggaag ccctaatata cccggaattc 780

atgccatgta taaaacgcta acccagcaaa ggccttctat gaaaaaaata aatacaatac 840

atacgctgtt catgaaaact ttaaaaaaac atcagcatgt atatctaccc atagggggcg 900

tgtctgcaga ggacacgtct gcagaaaaca tatctacaaa agacatgcct gttgaaggcc 960

cgaagggact cccgggctat attttattta gcgttggccg tcgcgccgag gagctacaaa 1020

aaaaaatttt cactaaattt aatataaagg ttggccgtgt tgttgactta caagagatac 1080

tgtttcgtat caaaataccc caaaaatact gggagacatt attgttcatc caattaagag 1140

ataatttgac caaagaggac ataaaaagag ttatggttgt tttgatgcat ttagatacca 1200

<210> 11

<211> 1200

<212> DNA

<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)

<400> 11

acagtatgtt gagtctttaa tttaaaatta caaggagttt tctaggtctt tatgcgtata 60

ggtgtttctt tgtcgtaaat tttcaatagc cgacattgtt tgtgaagcag tgttctgagt 120

agtgactgtc gtgtaaggct cagccggatg agcaggagca ctcgcggccg caggtgcggc 180

cgccggcccg ccagttgcca tgactagtct gtccgtaact gggttgtccg taactggttt 240

gtttgttgct ggtctgtttg ttgccggtct gcccgtgact ggcttgccta cacttgctgt 300

agtcgctcca gctggtttag aggtacctgg ttgtggagtg acttctaccc actgctgatc 360

ttgataagga tttataaact gtatatcttc ctcctcaata gcagcagctt ttttctttct 420

tgaagagaat agatagatta gaacgatgat aatgatgact aagaccacga tagcaatgag 480

aatagtatac atatgtgtgg agaagaagct tggtgtagtg actggtgaca aacactcacc 540

ataatgccgc ggataaaccg gttgaaaaaa ttcagaatcc atttaagata ctattataaa 600

taatatataa aaatgttgtg gcgcaatgaa attacagaat ttatggacca actttccaag 660

tattctcaag aaatcttaaa aacgtttaag caattgcgtc ctagtgaata taaacaatac 720

aatgaatttt taacacaagt tacaccgttg ctgcaaaaaa cccctgaaaa aattccagag 780

ttggttgacc atatattcaa ttacctagac aacgttgaaa aaatttgtga gctcctcgtg 840

aatgctagct caattattat tagttcaaaa atacgagaac aagtaaaaca cggaatgagc 900

ttcagctata aagccgacct cgactccttg gcggacattc tctctcaaaa acagtacgtg 960

cttatgcatc tttcaaaaaa tattgcggcc gagtatttta atacgtgttt aaaccaaggg 1020

aaatccaagt tagatctcaa agctgcctct gtattttata gtagtcgttc ccgaacggca 1080

agctcagcag aactctatag aaaaatgcta tacgcctatg gttcaccgca ggaaattaat 1140

tattatactg aaaaagcccg aaataagacg ttggatgtgg aggagagcga cagcatggcc 1200

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

catgcacttc ggtgaaaaac t 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gagaatacat aagggtttgc gt 22

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggagaagagg gaaacaa 17

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ccagcacaaa gggtaa 16

Claims

1.非洲猪瘟病毒E184L蛋白在制备免疫抑制剂中的应用。

2.非洲猪瘟病毒E184L蛋白在制备抑制I型干扰素，和/或促炎性细胞因子，和/或干扰素刺激基因ISGs产生的药物或药物组合物中的应用。

3.通过缺失非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的功能制备减毒非洲猪瘟病毒株的应用，所述缺失非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的功能是指通过缺失非洲猪瘟病毒E184L基因的全部或部分核苷酸序列使非洲猪瘟病毒E184L基因编码蛋白的功能丧失。

4.一种E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述减毒非洲猪瘟病毒株包括将亲本非洲猪瘟病毒株E184L基因编码蛋白的功能丧失，所述将亲本非洲猪瘟病毒株E184L基因编码蛋白的功能丧失是指将非洲猪瘟病毒E184L基因的全部或部分核苷酸序列缺失。

5. 如权利要求4所述的E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株，其特征在于，所述亲本非洲猪瘟病毒株为ASFV/CN/GS/2018分离株；所述E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株相较于ASFV/CN/GS/2018分离株全长序列缺失了如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

6.一种非洲猪瘟疫苗，其特征在于，所述非洲猪瘟疫苗包含权利要求4-5任一所述的E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株。

7.如权利要求4-5任一所述E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株的制备方法，其特征在于，所述方法为：通过基因工程手段将亲本非洲猪瘟病毒株E184L基因的全部或部分核苷酸序列缺失使E184L基因编码蛋白的功能丧失。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法为同源重组技术，所述方法包括以下步骤：

（1）设计ASFV E184L基因上下游序列作为左右同源重组臂，并分别克隆入pUC19载体中，获得重组转移载体；

（2）在步骤（1）所述重组转移载体左、右臂基因序列中插入筛选表达盒基因片段，获得同源重组转移载体；

（3）将步骤（2）所述同源重组转移载体转染至感染了亲本非洲猪瘟毒株的 BMDM细胞，纯化筛选获得E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株。

9.如权利要求7或8所述方法制备获得的E184L基因编码蛋白功能丧失的减毒非洲猪瘟病毒株。