CN112891527B - 非洲猪瘟病毒i226r基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒蛋白的功能鉴定及其在制备非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗中的应用。本发明提供的应用具体为非洲猪瘟病毒I226R在开发新型非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗中的应用。试验证明，非洲猪瘟病毒I226R基因所编码的蛋白能够抑制病毒感染诱导的干扰素表达。而且，表达I226R的细胞在病毒刺激后，细胞Ⅰ型干扰素IFNβ和III型干扰素IL28、IL29及干扰素刺激因子ISGs的表达均显著下降，表明I226R是非洲猪瘟病毒抑制宿主抗病毒天然免疫应答的重要成分。

Description

非洲猪瘟病毒I226R基因的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种病毒蛋白的功能鉴定及其在制备基因缺失疫苗中的应用，主要涉及非洲猪瘟病毒I226R蛋白的功能鉴定及其在制备非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗中的应用。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine Fever)是一种猪的烈性传染性疾病，致死率能够达到100％。作为全球消费猪肉最多的国家，猪肉是中国人蛋白质的主要来源，有效防控和消灭非洲猪瘟有利于保障我国人民群众“菜篮子”的安全。目前非洲猪瘟在我国的疫情虽然有所缓解，但是市面上还未有有效的非洲猪瘟疫苗，仍存在大爆发的风险。因此加强非洲猪瘟疫病的防控迫在眉睫。

非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，是一种大型DNA病毒，也是目前唯一已知的虫媒DNA病毒。根据其主要的衣壳蛋白p72，可将其分为24个基因型。我国流行的毒株为基因Ⅱ型，属于高致病性毒株。非洲猪瘟病毒由外向内可分为外囊膜、衣壳、内囊膜、核衣壳以及核。该病毒的基因组长度取决于两端高度可变区编码的多基因家族数目，能够编码超过150种蛋白。非洲猪瘟结构上的复杂性给疫苗的研制带来了一定的阻碍。不仅如此，目前的研究来说灭活苗和亚单位疫苗在具体实施的过程出现了许多问题，这使得基因缺失疫苗成为唯一可行的实施方式。而非洲猪瘟病毒编码多个能够抑制天然免疫信号通路的蛋白，这些蛋白正是研究非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗的重要研究对象。例如：多基因家族MGF505和多基因家族MGF360，有多项研究表明从非洲猪瘟病毒的基因组中敲除这两个家族的某些成员能够使机体分泌干扰素的能力得到恢复，但是这些基因缺失疫苗的安全性仍旧没有保证。因此，继续深入研究非洲猪瘟病毒编码的能够抑制天然免疫的蛋白，无疑是成功研制基因缺失疫苗的突破口。

干扰素是机体天然免疫的重要组成部分，尤其是在病毒感染过程中，干扰素在机体抗病毒过程中起着关键性的作用。宿主能够通过不同的模式识别受体识别病原微生物的不同组分，当这些组分被识别时，机体立即启动一系列的信号级联反应，以促进干扰素的合成与分泌，进而诱导相关抗病毒基因ISGs的表达。相关研究表明，在非洲猪瘟病毒感染的初期能够抑制宿主分泌干扰素的能力，从而成功感染宿主细胞。综上说明，探究非洲猪瘟病毒抑制天然免疫的机制有助于了解非洲猪瘟病毒的致病机制和疫苗的研发。我们成功筛选到了一个可以显著抑制干扰素表达的非洲猪瘟病毒蛋白，即I226R基因。I226R蛋白具有抑制宿主细胞抗病毒天然免疫应答的功能，能显著抑制干扰素刺激基因ISG15、ISG20和OASL的表达水平，可作为构建非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗的候选缺失基因，具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种病毒蛋白的功能鉴定及其在制备基因缺失疫苗中的应用。

非洲猪瘟病毒I226R基因在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的应用，非洲猪瘟病毒I226R基因核酸序列如SEQ ID No.1所示。

非洲猪瘟病毒I226R基因在抑制宿主细胞抗病毒天然免疫应答中的应用。

非洲猪瘟病毒I226R基因翻译成的蛋白质在制备非洲猪瘟病毒疫苗中的应用，其中非洲猪瘟病毒I226R基因翻译成蛋白质的氨基酸序列为：

mkmetflvclfhnadglhqqiqeilyllrmhiyetnlylkqelsrliypnrqlsfvllmplsllrnwddieyltdvvddkqtlhyaanlltnyvlhlsmfqkltkpyfllavkrvseklnkkqrhsfyevlvtsetlnnyenlsknilntlmfavryvfkptpnyseilaelekknkihhiifnmvitdfaqireqqmdkhlcetnnelrqecketifdlkvvgnv

试验证明，非洲猪瘟病毒I226R基因能够显著抑制病毒感染诱导的干扰素表达，并抑制干扰素刺激基因ISGs的表达。通过双荧光素酶报告基因系统检测发现，与对照组相比，表达I226R基因能够抑制仙台病毒诱导的干扰素启动子的活性。通过荧光定量PCR试验，发现I226R基因的表达能够显著抑制仙台病毒感染诱导的Ⅰ型干扰素IFNβ和III型干扰素IL28、IL29的mRNA表达水平，以及抑制发挥抗病毒功能的干扰素刺激基因ISG15、ISG20和OASL的表达水平。综上，本发现鉴定了一种具有抑制宿主细胞抗病毒天然免疫应答功能的非洲猪瘟病毒蛋白，为制备非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗提供了新的选择。

附图说明

图1为I226R基因对仙台病毒诱导的干扰素启动子活性的影响。**表示差异极显著(P<0.01)。

图2为I226R基因对仙台病毒诱导的IFNβ、IL28和IL29的mRNA表达量的影响。**表示差异极显著(P<0.01)。

图3为I226R基因对干扰素刺激基因ISGs表达的影响。**表示差异极显著(P<0.01)。

具体实施方法

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法及装置，如无特殊说明，均为常规方法及装置。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购得。以下实施例中对突变体突变位点的确定，均由常规测序公司测序确定。为使本发明专利的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例对本发明专利的具体实施方式进行详细说明。这些优选实施方式的示例在具体实施例中进行了例示。

在此，还需要说明的是，为了避免因不必要的细节而模糊了本发明专利的技术方案，在实施例中仅仅示出了与根据本发明专利的方案密切相关的技术方案和/或处理步骤，而省略了关系不大的其他细节。

293T细胞(人胚肾细胞系)：美国标准生物品收藏中心(American Type CultureCollection，ATCC)，编号为CRL-3216。

实施例1.非洲猪瘟病毒I226R基因可显著抑制病毒感染诱导的干扰素表达

1.非洲猪瘟病毒I226R基因片段的获取

本发明以非洲猪瘟病毒China/2018/AnhuiXCGQ(GenBank登录号：MK128995.1)I226R基因的核苷酸序列为模板，由苏州金唯智生物科技有限公司合成，并成功构建到pCMV5a载体上，命名为pCMV5a-I226R，质粒扩增后，送铂尚生物技术(上海)有限公司进行测序，验证无误后，进行后续的细胞试验。

2.非洲猪瘟病毒I226R基因能够抑制干扰素启动子的活性

293T细胞培养于DMEM(Gibco)培养基中，培养基中添加终浓度100units/mL青霉素、100units/mL链霉素和10％的胎牛血清(Gibco)，置于37℃，5％CO₂浓度的细胞培养箱中，待细胞在24孔板中的汇和度达到80-90％时，按照VigoFect(威格拉斯)说明书，将双荧光素酶系统IFNβ-Luc 500ng、pTK-RL 50ng(作为内参使用)及pCMV5a(空载体对照)500ng或pCMV5a-A238L(阳性对照组)500ng或pCMV5a-I226R 500ng共转染293T细胞，转染6h后将转染液更换为完全培养基。培养24h后，用仙台病毒(100HAU/ml)感染细胞，病毒吸附1h，期间每15min倾斜摇晃细胞板一次。吸附1h后，吸去上清，用PBS清洗细胞3次，加入2ml病毒维持液(无血清DMEM中含2μg/ml的胰酶)。病毒感染16h后，按照Promega双荧光素酶报告基因检测试剂盒

Report提供的说明书添加裂解液，冰上裂解15min，离心取上清，进行双荧光素酶检测。如图1所示I226R基因能够抑制仙台病毒诱导的干扰素启动子的活性，而且其抑制效果优于已知的具有拮抗宿主天然免疫应答的非洲猪瘟病毒基因A238L。

3.非洲猪瘟病毒I226R基因能够抑制仙台病毒诱导的干扰素表达

待293T细胞在6孔板中的汇和度达到80-90％时，按照VigoFect(威格拉斯)说明书，将4μg pCMV5a(空载体对照)、4μg pCMV5a-I226R分别转染293T细胞，转染6h后将转染液更换为完全培养基。培养24h后，用仙台病毒(100HAU/ml)感染细胞1h，期间每15min倾斜摇晃细胞板一次，之后去除病毒液，用PBS清洗细胞三次后加入2ml维持液。病毒感染12h后，每孔加入1ml的NucleoZOL(品牌：MNG，货号：740404.200)。按照NucleoZOL的说明书提取细胞总RNA，将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行荧光定量PCR(北京全式金生物技术有限公司，

Green qPCR SuperMix)，检测Ⅰ型干扰素IFNβ和III型干扰素IL28、IL29的mRNA表达水平，如图2所示，表达I226R基因后，IFNβ、IL28和IL29的mRNA表达量均明显发生下降。

实施例2.非洲猪瘟病毒I226R基因能抑制干扰素刺激基因ISGs的表达

将293T细胞在6孔板中培养，当细胞汇和度达到80-90％时，按照VigoFect(威格拉斯)说明书，将4μg pCMV5a(空载体对照)或4μg pCMV5a-I226R转染293T细胞。转染6h后更换转染液为完全培养基。转染24h后用仙台病毒(100HAU/ml)感染细胞1h，之后用PBS清洗细胞三次后加入病毒维持液。病毒感染12h后，每孔加入1ml的NucleoZOL。按照NucleoZOL的说明书提取细胞总RNA，将总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板进行荧光定量PCR，检测干扰素刺激基因ISG15、ISG20和OASL的表达水平，如图3所示，表达I226R基因后，ISG15、ISG20和OASL的mRNA表达量明显发生下降。干扰素刺激基因ISGs作为由干扰素诱导表达的基因，能够靶向病毒复制的不同阶段进而抵抗病毒感染，在宿主抵抗病毒感染的过程中发挥着至关重要的作用。而I226R基因能够显著抑制ISGs的表达，确定是一种与免疫抑制相关的基因，该发现为制备非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗提供了新的选择。

综合上述2个实施例的结果，可证明非洲猪瘟病毒I226R蛋白具有抑制宿主细胞抗病毒天然免疫应答的功能，而且可作为构建非洲猪瘟病毒基因缺失疫苗的候选缺失基因。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

<110> 福建农林大学

<120> 非洲猪瘟病毒I226R基因的应用

<160> 1

<210> 1

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

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Claims (1)

1.非治疗目的非洲猪瘟病毒I226R基因在抑制宿主细胞IFNβ、IL28、IL29、ISG15、ISG20或OASL的转录中的应用。

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