CN112126644B

CN112126644B - 一种非依赖帽结构下进行细胞外转录的mRNA、呈递细胞及应用

Info

Publication number: CN112126644B
Application number: CN202011337705.4A
Authority: CN
Inventors: 贾明明; 陈立; 黎小珠; 俞洋洋
Original assignee: Beijing Likang Life Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Likang Life Technology Co ltd
Priority date: 2020-11-25
Filing date: 2020-11-25
Publication date: 2021-03-12
Anticipated expiration: 2040-11-25
Also published as: CN112126644A

Abstract

本发明提供一种非依赖帽结构下进行细胞外转录的mRNA、呈递细胞及应用，涉及生物技术领域，本发明提供的外源mRNA能够在非依赖帽结构下使真核细胞中的核糖体启动的翻译表达；本发明提供的应用可以转录上述mRNA，且至少具有SEQ ID NO.1‑3任一所示的核苷酸序列；本发明提供的mRNA、核苷酸序列可以用于制备蛋白表达异常相关的mRNA疫苗，还可以用于筛选和/或评估抗原表位。本发明提供的mRNA可以不依赖帽结构直接进行翻译，稳定性好，持续翻译时间增长，打破了通过“加帽”来提高mRNA稳定性、起始翻译的方式，极大地降低了成本，普适性广，社会效益显著。

Description

一种非依赖帽结构下进行细胞外转录的mRNA、呈递细胞及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种非依赖帽结构下进行细胞外转录的mRNA、呈递细胞及应用。

背景技术

mRNA作为一种非病毒基因载体，通过外源合成的mRNA进行修饰、表达，可形成高活性的表达蛋白，并且通过细胞或其它给药载体可产生蛋白表达。目前常用于基因治疗和细胞治疗的病毒载体方案具有生产难度大、成本高、基因整合风险较高，而mRNA生产方便、半衰期短、无整合风险、安全性高，具有广阔的应用前景。

常规mRNA体外制备方案，常使用5’帽结构来提高mRNA的稳定性并起始翻译。常用的加帽方案有牛痘加帽酶处理、帽子结构（m7GpppG）和抗反转帽结构类似物（3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G ）等方案。其中，添加帽结构类似物的mRNA生产方案加帽效率低，无法完全满足目前mRNA制备及生产的实际需求；而使用牛痘加帽酶处理方案制备和纯化较为繁琐，杂质残留的风险升高。因此，开发能够产生较为稳定的低成本的mRNA体外转录替代方案，对于拓展体外转录mRNA的应用场景、促进mRNA药物的开发具有十分重要的意义。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明提供一种转入细胞后能够稳定转录翻译的外源mRNA，本发明提供的mRNA可以在不依赖帽结构的情况下，使真核细胞的核糖体稳定地启动翻译，替代了目前的需要通过“加帽”方式来提高mRNA稳定性的技术，打破了现有技术的垄断，也为促进我国，乃至国际上肿瘤疫苗及其他蛋白表达异常疫苗的制备、筛选及药效评估提供一个快速、经济渠道，为新型治疗手段的研发及临床试验提供一个新的途径。

为实现本发明的技术目的，本发明一方面提供一种非依赖帽结构下进行细胞外转录的mRNA，至少具有SEQ ID NO.1-3任一所示的核苷酸序列。

为实现本发明的技术目的，本发明另一方面提供一种呈递细胞，其为负载有上述的非依赖帽结构下进行细胞外转录的mRNA的树突状细胞。

为实现本发明的技术目的，本发明还提供一种将上述的mRNA用于制备蛋白异常表达相关疾病mRNA疫苗的用途。

其中，所述将上述mRNA用于制备蛋白异常表达相关疾病mRNA疫苗是用抗原表位序列信息将上述mRNA的编码区替换即可。

其中，所述蛋白异常表达相关疾病包括但不限于感染性疾病、自身免疫缺陷病、肿瘤或其相关疾病。

为实现本发明的技术目的，本发明再提供一种将上述的mRNA用于筛选或/和评估抗原表位/mRNA疫苗的用途。

其中，所述将上述mRNA用于筛选或/和评估抗原表位是将待筛选或/和评估的抗原表位插入到上述mRNA的编码区，进行细胞外转录，细胞内翻译，最后检测免疫反应结果，根据免疫反应结果筛选或/和评估抗原表位。

有益效果

1、本发明提供的非依赖帽结构下进行细胞外转录的mRNA可以稳定的进行翻译，而且可以使真核细胞中的核糖体直接启动mRNA的翻译，解决了目前需要使用加帽的方式才能启动mRNA的翻译的技术问题，同时也降低体外转录过程中的风险引入和成本。

2、本发明提供的mRNA是通过引入来源于蟋蟀麻痹病毒、脑心肌炎病毒或禾谷缢管蚜病毒的IRES（internal ribosomal entry site ,IRES）实现，因此可以直接通过人工直接合成，或分子克隆的方式获得，方法简单，成本低，解决了目前对mRNA加帽过程复杂，且mRNA容易损失的技术问题。经统计，采用人工合成或分子克隆的方式获得的本申请的mRNA相比于现有技术，mRNA损失减少了50%以上。

3、本发明提供的mRNA的细胞外转录和表达能力与现有的稳定mRNA效果相当，没有显著性差异，完全可以替代目前的稳定的mRNA。

4、本发明相对于现有技术的如帽结构类似物或牛痘加帽酶的使用而言，操作更加简单方便、经济、安全，利用本发明的应用推广。

附图说明

图1为本发明流式细胞仪检测DC细胞转染的效率图；

图2为本发明荧光定量PCR检测含有重组CEF表位的抗原经转染DC后细胞负载情况图；

图3为本发明含有重组CEF表位的抗原经转染DC后，抗原提呈后对于特异性T细胞分泌INF-γ的影响。

具体实施方式

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

实施例1 非依赖帽结构下进行细胞外转录的mRNA

本申请提供的mRNA具有来源于蟋蟀麻痹病毒(cricket paralysis virus，CrPV)的IGR-IRES的核苷酸序列SEQ ID NO.1，该核苷酸序列SEQ ID NO.1设置在mRNA分子结构的5’UTR区域，本申请提供的mRNA还包括mRNA的常规结构，例如信号肽元件、MITD元件和串联表位的表达元件和3’UTR中的一种或多种。

作为示例性的，本发明使用了源于人I类MHC的N端信号肽和I类MHC转运信号序列的编码区，CEF表位的编码区，人β-globin基因的3’UTR分别作为信号肽元件、MITD元件和串联表位的表达元件和3’UTR进行mRNA的构建，当然，本领域技术人员根据实际操作需要和试验要求，选用或不选用上述结构，又或是选用其他来源的作为上述结构。以下为本发明其中一个实施例的操作步骤。

本领域技术人员可以通过人工合成的方式将上述组件连接成一个本申请的非依赖帽结构下进行细胞外转录的mRNA分子。

当然，本领域技术人员还可以采用生物学方法利用上述物种的IRES序列、MHCclass I的N端信号肽和转运序列，CEF表位、人β-globin的5’UTR获得本申请的非依赖帽结构下进行体外转录的mRNA分子，具体步骤如下：

1、CrPV的IGR-IRES序列、MHC class I的N端信号肽和I类MHC转运信号序列，CEF表位、人β-globin的3’UTR的获取

利用密码子优化软件和网站对已公开的人I类MHC的N端信号肽和I类MHC转运信号序列的编码区，CEF表位的编码区，获得优化后的MHC class I的N端信号肽和I类MHC转运信号序列的核苷酸序列，CEF表位。

其中，所述码子优化软件和网站可以是本领域技术人员常用的，例如DNAWorks(Hoover and Lubkowski 2002)、Codon Optimizer(Fuglsang 2003)、.UpGene(Gao,Rzewski et al. 2004)、Synthetic Gene Designer等。

具体的，密码子优化标准为：将野生型人I类MHC的N端信号肽和人I类MHC转运信号序列编码区，CEF表位编码区的GC含量优化到50%~65%之间；将在人源细胞中表达频率较低的密码子更改为人源细胞中使用频率较高的密码子；去除人I类MHC的N端信号肽和I类MHC转运信号序列编码区，CEF表位编码区中可能进行二级结构的核酸序列进行优化；避免人I类MHC的N端信号肽和I类MHC转运信号序列编码区，CEF表位编码区中容易产生后续需要酶切的相同序列。

本发明所用的CEF表位为Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus and InﬂuenzaVirus Control Peptide阳性表位，每个表位长度为8-12个氨基酸，来源于巨细胞病毒、EB病毒或流感病毒。由于其在人群中的感染频率较高，因此正常志愿者亦有较高概率针对于CEF产生特异性应答。本发明利用CEF中12个已被验证的表位，可以应用ELISPOT方法检测淋巴细胞分泌IFN-γ功能来作为检测和评价能否引起免疫反应的方法，进而实现高通量的蛋白异常表达相关疾病的疫苗筛选和评估。

其中，由于本发明所用的CEF表位具有十二个（当然本领域技术人员也可以采用其他抗原表位），为了使多个表位能够作为一个整体的串联表位表达元件，本发明在不同表位直接使用了弗林蛋白酶（furin）识别位点Arg-Glu-Lys-Arg，不仅实现了多个表位的串联，而且还能增加各个表位的切割效率，提升各个抗原被各自呈递的效果。

需要指出的是，上述优化后的核苷酸序列仅为本发明示例性的，本领域技术人员还可以根据本领域的其他密码子优化方法或生物学方法对野生型的上述元件进行处理。

2、体外转录表达获得mRNA

2.1 构建重组质粒，形成重组载体

将CrPV的IGR-IRES序列、人β-globin的3’UTR和优化后的MHC class I的N端信号肽、人I类MHC转运信号序列和CEF表位经同源重组后，克隆至pSP73载体上，形成重组载体pSP73-IRES-CEF。

具体的，所述同源重组的步骤和克隆方法均按照本领域常规步骤进行，所用试剂均从市售获得。

2.2、线性化重组载体pSP73-IRES-CEF

为了使重组载体产物能够体外转录翻译形成正确的mRNA长度，将形成的重组载体pSP73-IRES-CEF进行线性化处理，降低mRNA过度转录的概率。具体为：

a）扩增重组载体pSP73-IRES-CEF

使用Phi29酶对重组载体进行pSP73-IRES-CEF进行滚环扩增，得到扩增产物。

b）酶切处理

利用SpeI-HF限制性内切酶对扩增得到的产物进行酶切处理，酶切步骤按照按SpeI-HF限制性内切酶说明书进行，即将产物与SpeI-HF混匀后置于37℃酶切2h，得到酶切产物。

c）酶切产物的回收和纯化

将酶切产物使用2倍体积的乙醇，混匀后置于-20℃沉淀30分钟，然后在12000rpm，4℃条件下离心处理15min，沉淀DNA，弃去上清后使用1mL 70%乙醇洗涤一次。

洗涤后加入20μL无DNA酶、RNA酶的纯净水进行重悬，使用紫外分光光度计进行核酸浓度测定，将DNA重悬至1μg/μL，获得线性化后的重组质粒。

d）含帽子结构mRNA的获得

将得到的线性化重组质粒为模板进行体外转录（以20μL反应体系为例）：2xNTP（含ARCA），10μL；质粒模板（1μg/μL），1μL；无DNA酶、RNA酶的纯净水，5μL；T7体外转录酶，2μL；10x Buffer，2μL。混匀后置于37℃反应2小时，作为对照。

e）不含帽子结构mRNA的获得

将得到的线性化重组质粒为模板进行体外转录（以20μL反应体系为例）：2xNTP（不含ARCA），10μL；质粒模板（1μg/μL），1μL；无DNA酶、RNA酶的纯净水，5μL；T7体外转录酶，2μL；10x Buffer，2μL。混匀后置于37℃反应2小时。

然后加入30μL LiCl，混匀后置于-20℃沉淀核酸，然后在12000rpm，4℃条件下离心15min，沉淀核酸，弃去上清后使用1mL 70%乙醇洗涤一次。

最后向洗涤后的核酸中加入20μL无DNA酶、RNA酶的纯净水进行重悬，使用紫外分光光度计进行核酸浓度测定，将mRNA重悬至1μg/μL，得到未加帽体外转录的mRNA。

需要说明的是，本发明的上述mRNA还可以通过人工合成的方式获得。

实施例2

除采用来源于脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)的IGR-IRES的核苷酸序列SEQ ID NO.2替代来源于CrPV的IGR-IRES序列核苷酸序列SEQ ID NO.1外，其他均与实施例1相同。

实施例3

除采用来源于禾谷缢管蚜病毒(Rhopalosiphum padi virus，RhPV 5’)的IGR-IRES的核苷酸序列SEQ ID NO.3替代来源于CrPV的IGR-IRES序列核苷酸序列SEQ ID NO.1外，其他均与实施例1相同。

实施例4 呈递细胞

1.DC的体外诱导培养

1.1 高纯度单核细胞的分离

为了获得更高纯度的单核细胞，首先采用单核细胞采集机分离纯化健康志愿者外周血中的单核细胞，然后在超净台中使用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，最后通过阴选试剂盒纯化单核细胞，得到高纯度的单核细胞。

1.2 DC的培养

将单核细胞加入ImmunoCult™分化培养基中（ImmunoCult™培养基中加入ImmunoCult™ DC Differentiation Medium），置于37℃，5%CO₂培养箱中培养6天，每3天进行半数换液。

在第6天进行DC的成熟培养，更换为ImmunoCult™成熟培养基中（ImmunoCult™培养基中加入ImmunoCult™ DC Maturation Medium），置于37℃，5%CO₂培养箱中培养2天，得到体外诱导的成熟DC。

2、CEF抗原的负载

将成熟的DC收集至15mL离心管中，使用PBS将细胞密度调整到1*10^7 iDC/mL，得到DC细胞悬液。吸取100μL细胞悬液和7.5μg 体外转录的利用上述实施例1或2或3提供的重组CEF mRNA混匀，将细胞-mRNA混合物置于Bio-rad 2mm电转杯中进行电击，电击后将细胞转移至6孔板中继续培养，将6孔板置于37℃，5%CO₂培养箱中培养16h，得到负载有抗原mRNA的树突状细胞DC。

试验例1 DC的转染效率

将实施例4提供的呈递细胞转染GFP mRNA 16h后，收集mDC，使用流式细胞分析术分析DC的转染效率，分析结果如图1所示，图中FSC表示流式前向光，SSC表示流式侧向光，FITC-GFP表示GFP蛋白表达量，根据图1所示的结果可知，负载有抗原mRNA的DC细胞中能成功产生GFP蛋白，而且DC细胞转染后的GFP转染效率大于70%。转染不“加帽”IRES-CEF mRNA16h后，经qPCR检测，不“加帽”IRES-CEF mRNA表达量相比于对照组增加3个数量级以上，可见，将本发明提供的mRNA负载到DC后，可以检测到高浓度的不“加帽”IRES-CEF mRNA。

对负载有实施例1、2、3的mRNA的DC细胞表达的不“加帽”Uncapped-IRES-CEF mRNA进行荧光定量PCR检测，含有重组CEF表位的抗原经转染DC后细胞负载结果如图2所示，可见，利用负载有实施例1的mRNA的DC细胞中的mRNA均具有活性，能够被稳定表达。

试验例2 DC的抗原呈递功能验证

将负载有抗原mRNA的DC进行收集，在96孔板中将负载有抗原mRNA的DC和对应志愿者的T细胞共培养，按1：10的比例进行铺板，经过24h共培养后检测板底IFN-γ的分泌量。如图3所示，图中，Mock DC组表示DC未经负载CEF表位，DC表面的抗原不能激活该志愿者的T细胞，只能产生较弱的IFN-γ； DC pulse CEF(加帽)未使用优化结构组为加入CEF表位，但缺少本专利声明的IRES优化结构，该组能产生较强的IFN-γ；DC pulse IRES-CEF（未加帽）表示该志愿者的T细胞能够识别DC经电转负载本发明提供的IRES-抗原mRNA产生的表位，在不加帽的情况下能够产生较强的IFN-γ；T cell组表示该志愿者的T细胞本底反应，在未收到DC呈递的表位时，T细胞不产生IFN-γ。根据图3所示的结果可知，本发明提供的未“加帽”负载抗原mRNA（即负载CEF表位）的DC细胞可以引起T细胞活化并分泌IFN-γ，可以作为抗原疫苗。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 北京立康生命科技有限公司

<120> 一种非依赖帽结构下进行细胞外转录的mRNA、呈递细胞及应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 192

<212> DNA/RNA

<213> CrPV物种的IGR-IRES序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaagcaaaaa tgtgatcttg cttgtaaata caattttgag aggttaataa attacaagta 60

gtgctatttt tgtatttagg ttagctattt agctttacgt tccaggatgc ctagtggcag 120

ccccacaata tccaggaagc cctctctgcg gtttttcaga ttaggtagtc gaaaaaccta 180

agaaatttac ct 192

<210> 2

<211> 562

<212> DNA/RNA

<213> EMCV物种的IRES序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat 60

atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct 120

gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg 180

ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta 240

gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag 300

ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg 360

atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat 420

gcccagaagg taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca 480

tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc 540

ctttgaaaaa cacgatgata at 562

<210> 3

<211> 579

<212> DNA/RNA

<213> RhPV物种的IGR-IRES序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gataaaagaa cctataatcc cttcgcacac cgcgtcacac cgcgctatat gctgctcatt 60

aggaattacg gctccttttt tgtggataca atctcttgta tacgatatac ttattgttaa 120

tttcattgac ctttacgcaa tcctgcgtaa atgctggtat agggtgtact tcggatttcc 180

gagcctatat tggttttgaa aggaccttta agtccctact atactacatt gtactagcgt 240

aggccacgta ggcccgtaag atattataac tattttatta tattttattc accccccaca 300

ttaatcccag ttaaagcttt ataactataa gtaagccgtg ccgaaacgtt aatcggtcgc 360

tagttgcgta acaactgtta gtttaatttt ccaaaattta tttttcacaa tttttagtta 420

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gagcaaagtt cgctttactc gcaatagcta ttttatttat tttaggaata ttatcacctc 540

gtaattattt aattataaca ttagctttat ctatttata 579

序列表

<110> 北京立康生命科技有限公司

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 192

<212> DNA/RNA

<213> CrPV物种的IGR-IRES序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaagcaaaaa tgtgatcttg cttgtaaata caattttgag aggttaataa attacaagta 60

gtgctatttt tgtatttagg ttagctattt agctttacgt tccaggatgc ctagtggcag 120

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<210> 2

<211> 562

<212> DNA/RNA

<213> EMCV物种的IRES序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat 60

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ctttgaaaaa cacgatgata at 562

<210> 3

<211> 579

<212> DNA/RNA

<213> RhPV物种的IGR-IRES序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gataaaagaa cctataatcc cttcgcacac cgcgtcacac cgcgctatat gctgctcatt 60

aggaattacg gctccttttt tgtggataca atctcttgta tacgatatac ttattgttaa 120

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ttaatcccag ttaaagcttt ataactataa gtaagccgtg ccgaaacgtt aatcggtcgc 360

tagttgcgta acaactgtta gtttaatttt ccaaaattta tttttcacaa tttttagtta 420

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gagcaaagtt cgctttactc gcaatagcta ttttatttat tttaggaata ttatcacctc 540

gtaattattt aattataaca ttagctttat ctatttata 579

Claims

1.一种非依赖帽结构下进行细胞外转录的mRNA，包括信号肽元件、MITD元件、串联表位的表达元件和3’UTR，其特征在于，在mRNA分子结构的5’UTR区域至少设有SEQ ID NO.1-3任一所示的核苷酸序列。

2.一种呈递细胞，其特征在于，其为负载有权利要求1所述的非依赖帽结构下进行细胞外转录的mRNA的树突状细胞。

3.一种将权利要求1所述的mRNA用于制备蛋白异常表达相关疾病mRNA疫苗的用途。

4.一种将权利要求1所述的mRNA用于筛选或/和评估抗原表位和/或mRNA疫苗的用途。