CN116970631B

CN116970631B - 一种重组蛋白的编码基因、载体、细胞及制备方法

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Publication number: CN116970631B
Application number: CN202311203251.5A
Authority: CN
Inventors: 徐陈槐; 周延庆; 沈承昊; 胡默然; 熊顺强
Original assignee: Hangzhou Saiji Biotechnology Co ltd; Jiangxi Saiji Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Saiji Biotechnology Co ltd; Jiangxi Saiji Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-09-19
Filing date: 2023-09-19
Publication date: 2024-01-05
Anticipated expiration: 2043-09-19
Also published as: CN116970631A

Abstract

本发明公开了一种重组蛋白的编码基因、载体、细胞及制备方法，属于重组蛋白技术领域。所述重组蛋白为IL‑12 P70重组蛋白，所述编码基因依次包括以下序列：P40亚基的核苷酸序列、Furin识别位点的核苷酸序列、2A肽的核苷酸序列以及P35亚基的核苷酸序列，或者P35亚基的核苷酸序列、Furin识别位点的核苷酸序列、2A肽的核苷酸序列以及P40亚基的核苷酸序列。本发明将2A肽运用于IL‑12 P70重组蛋白的表达上，进一步通过2A肽的选择及与Furin识别位点结合，使得两个亚基切割效率高，表达比例平衡为1:1。利用本发明制备重组蛋白，表达产量高，抗原活性强，能够用于制备抗体，具有非常大的应用价值。

Description

一种重组蛋白的编码基因、载体、细胞及制备方法

技术领域

本发明属于重组蛋白技术领域，具体地，涉及一种重组蛋白的编码基因、载体、细胞及制备方法，更具体地，所述重组蛋白为IL-12 P70重组蛋白。

背景技术

白细胞介素-12（IL-12）最初被确定为由人类EB病毒转化的B细胞系产生的因子。它是一种I型细胞因子，参与先天性和适应性免疫，可刺激T细胞和自然杀伤细胞（NK细胞）活性并诱导干扰素γ的产生。单核细胞/巨噬细胞似乎是IL-12的主要来源。它是由吞噬细胞受到几种细菌/细菌产物和其他微生物的刺激后迅速产生的。IL-12具有广泛的活性，其中包括调节细胞因子合成和T细胞和NK细胞的增殖，促进Th1细胞的发育，CD8⁺T细胞的分化以及对造血的影响。当在体内应用时，IL-12被证明可以增强对细菌和寄生虫感染的抵抗力，促进抗肿瘤免疫，并影响体内或体外的抗病毒反应，包括HIV。

在过去的二十年中，重组人白细胞介素-12（rhIL-12）已成为各种临床前模型和临床研究中介导抗肿瘤活性的最有效细胞因子之一。此外，IL-12是一种有效的免疫调节细胞因子，在多种传染病中至关重要。在细菌、寄生虫、病毒和真菌感染的几个实验模型中，内源性IL-12是早期控制感染和产生并可能维持获得性保护性免疫所必需的，由辅助T（Th1）细胞指导并由吞噬细胞介导。

IL-12是由P35和P40两个亚基通过二硫键连接组成的异源二聚体，国内外已经利用细菌、酵母、腺病毒、逆转录病毒、EB病毒、腺伴病毒以及杆状病毒等载体表达IL-12，但是由于转染效率、整合效率等的不均一性，导致IL-12的表达水平难以大幅度提高，其生产和应用受到很大的限制。

中国专利CN106381309A提供了一种重组人白介素12的表达载体，所述P35亚基和P40亚基分别由各自带有SV40增强子元件的CMV启动子控制；所述P35亚基的编码序列与启动子之间有表达增强作用的Intron元件。然而，这种在同一载体中加入两个启动子的方法会存在以下不足：首先是质粒上有大段重复序列，可能会在复制时发生重组反应，导致两个相同启动子之间的序列丢失。其次是某些启动子相邻时可能互相竞争互相抑制，干扰基因表达。

中国专利CN109486828A将编码P40亚基的核苷酸序列克隆至真核表达载体pcDNA3.4-TOPO®，将编码P35亚基的核苷酸序列克隆至真核表达载体UCOE®-Mu-H，再共同转染至CHO细胞，分选得到稳定表达的细胞株，发酵表达。这种方法把两个亚基分别克隆至两个载体，在克隆以及后续的提取质粒等过程中相比于一个质粒要花费更多的成本，并且在转染的过程中两个亚基的表达量可能存在差异，需要优化转染质粒的比例，此外，转染的效率并不是100%的，会降低同时表达两个亚基的细胞比例。

中国专利CN101638657A采用10个疏水的柔性氨基酸接头连接的方法获取rIL-12P40、P35融合基因，该方法不仅可保证P40、P35两亚基以1：1比率表达，而且柔性氨基酸接头可使两个亚基充分延展、正确折叠，从而获得最大的生物学活性。融合基因插入真核表达质粒（pcDNA6/v5-hisp），构建pcDNA6-IL12；通过酶切、测序鉴定重组克隆。将pcDNA6-IL-12导入HEK293细胞。然而，在融合基因中加入柔性氨基酸接头连接可能会降低融合蛋白产量，影响蛋白结构的折叠，造成互相干扰，导致蛋白功能丧失。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明采取的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种重组蛋白的编码基因，所述重组蛋白为IL-12 P70重组蛋白，所述编码基因依次包括以下序列：P40亚基的核苷酸序列、Furin识别位点的核苷酸序列、2A肽的核苷酸序列以及P35亚基的核苷酸序列，或者P35亚基的核苷酸序列、Furin识别位点的核苷酸序列、2A肽的核苷酸序列以及P40亚基的核苷酸序列，所述Furin识别位点的核苷酸序列和所述2A肽的核苷酸序列之间，还包括标签蛋白的核苷酸序列。

Interleukin 12（IL-12），又名自然杀伤细胞刺激因子（NKSF）、细胞毒性淋巴细胞成熟因子（CLMF），是白细胞介素家族的新成员，主要由树突状细胞（DC）、巨噬细胞、B淋巴细胞以及其他抗原递呈细胞（APC）产生。IL-12是由P35和P40两个亚基组成的70-75KDa异源二聚体糖蛋白。重链P40由306个氨基酸组成，包含10个半胱氨酸残基和4个潜在的糖基化位点；轻链P35由197个氨基酸组成，包含7个半胱氨酸残基和3个潜在的糖基化位点。本发明将两个亚基克隆至同一个载体上，共用同一套表达元件，使得两个亚基的表达比例为1:1，最终获得异源二聚体，即P70重组蛋白，大大提升表达效率。

在本发明的一些实施方案中，所述P35亚基的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述P40亚基的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。

在本发明中，2A肽会在最后两个氨基酸甘氨酸（G）和脯氨酸（P）之间发生“自裂”，使重组蛋白断裂成P35亚基和P40亚基，但是上游蛋白（P35亚基和P40亚基中一个）的C端将会添加一些额外的2A残基，而下游蛋白（P35亚基和P40亚基中另一个）的N端将会有额外的脯氨酸。进一步，本发明在第一个基因和2A肽的核苷酸序列之间添加Furin识别位点的核苷酸序列有助于从上游蛋白中去除2A残基，而下游蛋白N端额外的脯氨酸会随着下游信号肽序列一起切除。

目前有四种常用的2A肽，分别来自于四种病毒：猪捷申病毒1型（P2A）、明脉扁刺蛾β四体病毒（T2A）、马鼻炎病毒（E2A）和口蹄疫病毒（F2A）。在本发明的一些实施方案中，所述2A肽选自P2A、T2A、E2A和F2A中的一种。在本发明的一些具体实施方案中，所述2A肽为T2A，氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示。优选地，所述T2A的核苷酸序列如SEQ ID No. 6所示。

在本发明中，所述Furin识别位点是能够被Furin酶特异性识别的位点。Furin酶是真核细胞中高度保守的一种蛋白酶，定位在高尔基体上。在上游蛋白后加入Furin识别位点，这样融合蛋白翻译后在高尔基体处被Furin酶所切割，即将上游蛋白中的2A残基去除。在本发明的一些实施方案中，所述Furin识别位点如SEQ ID No. 3所示，其核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。

在本发明的一些所述Furin识别位点的核苷酸序列和所述2A肽的核苷酸序列之间，还包括标签蛋白的核苷酸序列。

一些肽类和蛋白质被广泛地用于大量生产重组蛋白，它们与目的蛋白融合表达，以便于目的蛋白表达、检测、示踪和纯化。这类多肽或蛋白，被称为标签蛋白（ProteinTag）。在本发明中，所述标签蛋白选自6×His标签、FLAG标签、HA标签、c-Myc标签、V5表位标签、AviTag标签、GSG标签、GST标签、SUMO标签、Halo Tag标签、SNAP-Tag、MBP标签、eGFP/eCFP/eYFP/mCherry标签、荧光素酶中的一种或多种。本领域技术人员可以根据需要对标签蛋白进行选择。

6×His标签是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C端或N端。其作为标签，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与镍离子有较强的结合力，可用于固定化金属螯合亲和层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。

FLAG标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），是第一个为用于融合蛋白而设计的表位标签，带有FLAG标签的蛋白可以用特定的抗体M1、M3、M5来识别或回收。3×FLAG可以改善FLAG标签的检测。

HA标签蛋白，标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小，容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗体检测和ELISA检测。

c-Myc标签包含了人类原癌基因Myc中拥有10个氨基酸的片段（EQKLISEEDL）这10个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。由于有高特异性的抗Myc单克隆抗体，它被广泛用于检测体系，很少用于纯化。Myc标签一直被用于蛋白质印迹、免疫荧光和免疫沉淀实验。

V5表位标签，GKPIPNPLLGLDST，来自于副黏液病毒P/V蛋白。哺乳动物和昆虫表达体系通常会用到V5标签。虽然它也用于蛋白质纯化，但该标签对于蛋白质检测往往是很有用的，诸如在蛋白质印迹、免疫荧光和免疫沉淀实验中。

AviTag标签蛋白是一个15个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白质分离纯化，还用于蛋白质相互作用研究。

GSG为融合蛋白接头linker，用于融合蛋白的表达，核苷酸序列为：GGATCCGGT，可以提高2A肽的剪切效率和蛋白质的生成。

GST（谷胱甘肽巯基转移酶）标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。主要应用在原核表达中，将其应用在原核表达的原因大致有两个，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。

SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白（Small ubiquitin-likemodifier），是泛素（ubiquitin）类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，SUMO与泛素只有18%的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。

Halo Tag标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的Halo Tag配基有效地共价结合。这个分子量为33KDa的单体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C端，并在原核和真核系统中表达。

SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中或固态相（如SDS-PAGE）等。

MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。

eGFP/eCFP/eYFP/mCherry分别是增强型绿色荧光蛋白/增强型青色荧光蛋白/增强型黄绿色荧光蛋白/单体红色荧光蛋白，具有不同的激发波长和发射波长，其中，eGFP激发波长为488nm，发射波长为507nm；eYFP激发波长为513nm，发射波长为527nm；eCFP激发波长为433nm或453nm，发射波长为475nm或501nm；mCherry激发波长为587nm，发射波长为610nm。eGFP/eCFP/eYFP/mCherry均由野生型荧光蛋白通过氨基酸突变和密码子优化而来，即为报告基因。

荧光素酶来源于生物体内的荧光素，常见的有萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶和Guassia荧光素酶。这些荧光素酶作为“报告蛋白”被用于分子生物学研究中，这种技术被称为报告基因检测法或荧光素酶检测法（Luciferase Assay）。跟普通融合蛋白标签不同，使用荧光素酶构建的报告基因可用作目的基因的定量分析。

在本发明的一些实施方案中，所述标签蛋白选自GSG、Flag标签和V5表位标签中的一种。本发明意外地发现，不同的标签蛋白对重组蛋白的产量和抗原活性均有非常大的影响。当标签蛋白选择V5表位标签时，P70重组蛋白的产量最高，并且抗原活性最强。

进一步，本发明还证明，P35亚基的核苷酸序列和P40亚基的核苷酸序列的先后也对重组蛋白的产量和抗原活性有显著的影响。具体地，当P40亚基的核苷酸序列在前，即P40亚基作为上游蛋白时，P70重组蛋白的产量较高，并且抗原活性更强。

本发明第二方面提供一种载体，包括本发明第一方面任一所述的一种IL-12 P70重组蛋白的编码基因。

载体按功能可分为克隆载体和表达载体。克隆载体是最简单的载体，主要用来克隆和扩增DNA片段。主要有质粒载体、噬菌体载体、噬菌粒载体、病毒载体。表达载体除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，如启动子和终止子。为了实现外源基因在不同表达载体中进行复制和表达，基因工程操作中常使用穿梭载体（shuttlevector）。穿梭载体含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的细胞中复制，如既能在原核细胞中复制也能在真核细胞中复制的载体，不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列（ARS）以及选择标记性状，具有多克隆位点。

在本发明的一些实施方案中，所述载体即为一种穿梭载体，既能够用于在真核细胞中表达重组蛋白也能够用于在原核细胞中扩增，产生大量质粒。

在本发明的一些具体实施方案中，所述表达载体为pcDNA3.1(+)。PCDN3.1（+）是来自PCDN3的5.4kb载体，被设计用于哺乳动物宿主中高稳定和瞬时表达，可在大多数哺乳动物细胞中高稳定性和非复制性瞬时表达。

在本发明中，无论表达的载体的种类及形式如何，均包括至少一个启动子，在上游蛋白的核苷酸序列之前。

在本发明的一些优选实施方案中，上游蛋白和下游蛋白之前均进一步包括信号肽序列，用于将所述上游蛋白和下游蛋白分泌至细胞外。

本发明第三方面提供一种宿主细胞，包括本发明第二方面所述的一种载体。

当所述宿主细胞为真核细胞时，例如哺乳动物细胞，优选人HEK 293F细胞。

当所述宿主细胞为原核细胞时，例如大肠杆菌，优选DH5α细胞。

本发明第四方面提供本发明第三方面所述的宿主细胞的制备方法，包括将本发明第二方面所述的载体转入受体细胞中的步骤。

在本发明的一些实施方案中，所述受体细胞为原核细胞，所述转入采用热激转化的方法进行。

在本发明的一些具体实施方案中，所述热激转化的方法具体如下：

（1）感受态细胞从-80℃取出，冰上融化。

（2）将质粒转入感受态细胞，冰上孵育5min，42℃水浴50s，冰上孵育5min；

（3）涂布分离，并挑单菌落扩大培养。

在本发明的另一些实施方案中，所述受体细胞为真核细胞，所述转入采用脂质体转染的方法进行。

脂质体转染法是指阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，形成DNA—脂复合体，被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合作用，偶尔也通过直接渗透作用，DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体。其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达。

在本发明的一些具体实施方案中，脂质体转染方法具体如下：

（1）准备以下预混液：

脂质体预混液：总体积1/30的Opti-MEM^TM培养基，0.004倍总体积的Lipofactemine2000^TM转染试剂，

质粒预混液：总体积1/30的Opti-MEM^TM培养基，总体积2倍的质粒质量（μg）；

（2）脂质体预混液和质粒预混液分别孵育5min；

（3）脂质体预混液和质粒预混液混合孵育25min；

（4）加入细胞培养基中，培养4天。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明首次将2A肽运用于IL-12 P70重组蛋白的表达上，并进一步通过2A肽的选择以及与Furin识别位点结合，使得两个亚基的切割效率高，表达比例平衡为1:1。

本发明通过对载体等的优化，最终使得重组蛋白表达产量高，并且抗原活性强，能够用于制备抗体，具有非常大的应用价值。

附图说明

图1示出了本发明重组蛋白P40-Furin-GSG-T2A-P35的核苷酸序列排列示意图。

图2示出了利用不同的连接序列预测的重组蛋白的结构示意图。A：利用本发明的连接子获得的重组蛋白预测结构示意图；B：利用柔性氨基酸接头连接获得的重组蛋白预测结构示意图。

具体实施方式

除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的分数和百分比都基于质量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的相关术语的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。

本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数（例如1.1，1.5等）的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10（例如1到5）的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申请中。

术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，除了对操作性能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1 重组人IL-12 P70蛋白表达载体的构建

白细胞介素-12（IL-12）是由两个独立基因IL-12A（P35）和IL-12B（P40）编码的一种多效能细胞因子，它们以一种活性异源二聚体（P70）或P40的同型二聚体（P80）形式存在。

本实施例构建P70重组蛋白的载体，在P40和P35亚基的核苷酸序列之间加入连接子（Furin识别位点—GSG—T2A）核苷酸序列，其中，P40在前，P35在后，P35亚基和P40亚基的核苷酸序列之前均包括信号肽序列，如图1所示。

通过基因克隆技术克隆至pcDNA3.1(+)载体中。在载体中，P40亚基的核苷酸序列之前为启动子序列，在P35亚基的核苷酸序列之后为终止密码子序列。

其中：

IL-12A（P35）亚基的核苷酸序列为：

AGAAACCTGCCTGTGGCCACCCCTGACCCTGGAATGTTCCCCTGCCTGCACCACAGCCAGAACCTGCTGAGAGCCGTGTCCAACATGCTGCAGAAGGCCAGACAGACACTGGAGTTTTATCCTTGCACCTCTGAGGAAATCGACCACGAGGATATTACAAAAGACAAGACCTCCACCGTGGAGGCCTGCCTGCCCCTGGAACTGACCAAAAACGAGAGCTGTCTGAATAGCCGGGAAACCTCTTTTATCACCAACGGCAGCTGCCTTGCTTCTAGAAAGACAAGCTTCATGATGGCCCTGTGCCTGAGCAGCATCTACGAGGACCTGAAGATGTACCAGGTGGAATTCAAGACCATGAACGCCAAGCTGCTGATGGACCCAAAGCGGCAAATCTTCCTGGACCAGAATATGCTGGCTGTCATCGATGAGCTGATGCAGGCCCTGAACTTCAACAGCGAGACAGTGCCCCAGAAAAGCTCCCTGGAAGAGCCTGATTTCTACAAGACCAAGATCAAGCTGTGTATCCTGCTCCACGCCTTCCGGATCAGAGCTGTGACAATCGACAGGGTGATGAGCTACCTGAACGCCAGC（SEQ IDNo. 1）

IL-12B（P40）亚基的核苷酸序列为：

ATCTGGGAGCTGAAGAAAGACGTGTACGTGGTGGAACTGGACTGGTATCCTGACGCTCCTGGCGAAATGGTCGTGCTGACCTGCGACACACCTGAGGAAGATGGCATCACATGGACCCTGGATCAGAGCTCTGAGGTGCTGGGCAGCGGAAAAACCCTGACTATTCAGGTGAAGGAATTCGGCGACGCCGGCCAGTACACCTGTCACAAGGGCGGCGAGGTGCTGTCTCACAGCCTTCTGCTGCTGCACAAAAAGGAGGATGGAATCTGGAGCACCGACATCCTGAAAGACCAGAAAGAGCCTAAGAACAAGACCTTCCTGAGATGCGAGGCCAAGAACTACAGCGGCAGATTCACCTGTTGGTGGCTGACCACAATCAGCACCGACCTGACCTTTAGCGTGAAGAGCTCTAGAGGCTCCAGCGACCCCCAGGGCGTGACATGTGGCGCCGCCACCCTGTCTGCTGAAAGAGTGCGGGGAGATAACAAGGAGTACGAGTATTCTGTTGAGTGCCAGGAGGACAGCGCCTGCCCTGCAGCTGAGGAAAGCCTGCCTATCGAGGTGATGGTGGACGCCGTGCACAAGCTCAAGTACGAGAACTACACAAGCAGCTTCTTCATCCGCGACATCATCAAGCCCGATCCACCAAAGAACCTGCAGCTGAAGCCTCTGAAAAATAGCAGACAGGTGGAAGTGTCCTGGGAATATCCTGATACATGGTCCACCCCTCACAGTTACTTCAGCCTCACCTTTTGCGTGCAAGTTCAAGGCAAGTCCAAGCGGGAAAAGAAGGACAGAGTGTTCACAGATAAGACCAGCGCCACAGTGATCTGCAGAAAGAATGCCAGCATCAGCGTGCGGGCCCAGGACCGGTACTACAGCTCCTCCTGGTCTGAGTGGGCCTCTGTCCCCTGCAGC（SEQ ID No. 2）

Furin识别位点的氨基酸序列为：

RRKR（SEQ ID No. 3）

Furin识别位点的核苷酸序列为：

AGAAGAAAACGC（SEQ ID No. 4）

GSG的核苷酸序列为：

GGATCCGGT

T2A的氨基酸序列为：

EGRGSLLTCGDVEENPGP（SEQ ID No. 5）

T2A的核苷酸序列为：

GAAGGCAGAGGATCTTTGCTGACATGTGGTGATGTGGAGGAGAACCCCGGACCT（SEQ ID No. 6）

由此，连接子（Furin识别位点—GSG—T2A）的氨基酸序列为：

RRKRGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（SEQ ID No. 7）

连接子的核苷酸序列为：

AGAAGAAAACGCGGATCCGGTGAAGGCAGAGGATCTTTGCTGACATGTGGTGATGTGGAGGAGAACCCCGGACCT（SEQ ID No. 8）

进一步地，P40亚基核苷酸序列之前添加第一信号肽的核苷酸序列：

ATGTACAGAATGCAGCTGCTGAGCTGCATCGCCCTGAGCCTGGCCCTGGTGACCAACAGC（SEQ IDNo. 9）

P35亚基核苷酸序列之前添加第二信号肽的核苷酸序列：

ATGCCTCTGCTGCTCCTGCTGCCACTGCTGTGGGCCGGCGCCCTGGCCATG（SEQ ID No. 10）

P70质粒由金斯瑞生物科技有限公司合成，质粒中SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 2、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 10和SEQ ID No. 1按顺序连接，即按第一信号肽-P40-连接子-第二信号肽-P35的顺序连接，得到的重组蛋白标记为：P40-Furin-GSG-T2A-P35。

实施例2 改变P35和P40亚基顺序构建质粒

按照实施例1的方法构建质粒，与实施例1的区别是，构建的质粒中SEQ ID No.10、SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 8、SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 2按顺序连接，即改变P35和P40亚基的前后位置，即按第二信号肽-P35-连接子-第一信号肽-P40的顺序连接，得到的重组蛋白标记为：P35-Furin-GSG-T2A-P40。

实施例3 柔性氨基酸的核苷酸序列替换连接子的核苷酸序列的质粒构建

按照实施例1的方法构建质粒，与实施例1的区别是，利用10个柔性氨基酸（SGGG）的核苷酸序列替换连接子的核苷酸序列，得到的重组蛋白标记为：P40-10×柔性氨基酸-P35。

10个柔性氨基酸序列如下：

SGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGG（SEQ ID No. 11）

其核苷酸序列如下：

TCCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGATCTGGTGGCGGATCAGGAGGCGGGAGCGGCGGCGGTAGTGGAGGAGGCTCTGGTGGTGGAAGCGGCGGCGGATCTGGAGGAGGTTCAGGAGGCGGC（SEQ ID No. 12）

利用蛋白质模型在线预测工具（https://swissmodel.expasy.org/interactive/）分别预测利用连接子连接的重组蛋白的结构和利用柔性氨基酸连接的重组蛋白的结构，结果如图2所示。

从图2中可知，两种重组蛋白的结构没有任何相似性。进一步分析发现，柔性氨基酸的连接会导致蛋白质结构改变，极大影响其效用。相反，连接子的引入不改变蛋白质的结构，也就不会影响重组蛋白的功能。

实施例4 没有功能标签核苷酸序列的质粒构建

按照实施例1的方法构建质粒，与实施例1不同的是，没有功能标签核苷酸序列，即直接将Furin识别位点的核苷酸序列与T2A的核苷酸序列连接，得到的重组蛋白标记为：P40-Furin-T2A-P35。

实施例5 3×FLAG标签的核苷酸序列替换GSG的核苷酸序列的质粒构建

按照实施例1的方法构建质粒，与实施例1不同的是，利用3×FLAG标签的核苷酸序列替换GSG的核苷酸序列。

3×FLAG标签氨基酸序列：

DYKDDDDKGDYKDDDDKIDYKDDDDK（SEQ ID No. 13）

3×FLAG标签的核苷酸序列：

GATTACAAAGATGATGACGACAAGGGCGACTACAAGGACGATGACGACAAGATCGACTACAAGGACGACGACGATAAG（SEQ ID No. 14）

得到的重组蛋白标记为：P40-Furin-3×FLAG-T2A-P35。

实施例6 V5表位标签的核苷酸序列替换GSG的核苷酸序列的质粒构建

按照实施例1的方法构建质粒，与实施例1不同的是，利用V5表位标签的核苷酸序列替换GSG的核苷酸序列。

V5表位标签氨基酸序列：

GKPIPNPLLGLDST（SEQ ID No. 15）

V5表位标签的核苷酸序列：

GGCAAGCCTATCCCTAACCCCCTGCTGGGCCTGGACAGCACC（SEQ ID No. 16）

得到的重组蛋白标记为：P40-Furin-V5表位-T2A-P35。

实施例7 P2A的核苷酸序列替换T2A的核苷酸序列的质粒构建

按照实施例1的方法构建质粒，与实施例1不同的是，利用P2A的核苷酸序列替换T2A的核苷酸序列。

P2A氨基酸序列：

ATNFSLLKQAGDVEENPGP（SEQ ID No. 17）

P2A的核苷酸序列：

GCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGCCCT（SEQ ID No.18）

得到的重组蛋白标记为：P40-Furin-GSG-P2A-P35。

实施例8 E2A的核苷酸序列替换T2A的核苷酸序列的质粒构建

按照实施例1的方法构建质粒，与实施例1不同的是，利用E2A的核苷酸序列替换T2A的核苷酸序列。

E2A氨基酸序列：

QCTNYALLKLAGDVESNPGP（SEQ ID No. 19）

E2A的核苷酸序列：

CAGTGCACCAACTACGCCCTGCTGAAGCTGGCCGGCGACGTGGAGAGCAACCCCGGCCCT（SEQ IDNo. 20）

得到的重组蛋白标记为：P40-Furin-GSG-E2A-P35。

实施例9 F2A的核苷酸序列替换T2A的核苷酸序列的质粒构建

按照实施例1的方法构建质粒，与实施例1不同的是，利用F2A的核苷酸序列替换T2A的核苷酸序列。

F2A氨基酸序列：

APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（SEQ ID No. 21）

F2A的核苷酸序列：

GCCCCTGTGAAGCAGACCCTGAACTTCGACCTGCTGAAGCTGGCCGGCGATGTGGAGAGCAACCCCGGCCCT（SEQ ID No. 22）

得到的重组蛋白标记为：P40-Furin-GSG-F2A-P35。

实施例10 重组人IL-12 P70蛋白的表达

1. 质粒转化

（1）DH5α感受态细胞从-80℃取出，冰上融化。

（2）取5μL质粒（实施例1-9质粒）加入感受态细胞，冰上孵育5min，42℃水浴50s，冰上孵育5min；

（3）取4μL溶液加入5mL LB液体培养基，37℃ 200rpm摇床摇晃15~20min，取50μL液体，在75μg/mL羧苄青霉素的LB平板上涂布分离，37℃培养箱倒置培养，12h后挑单菌落扩大培养。

2. 质粒提取

按照过滤法无内毒素快速质粒大量提取试剂盒（杭州倍沃医学科技有限公司，BW-PD1522-02）说明书提取质粒。

3. 转染

采用HEK 293F细胞（Expi293F™）作为表达细胞。

转染前一天将细胞接种到新培养基，密度调整到2.0×10⁶个/mL，转染前使用预热的培养基，将细胞密度调整到2.5×10⁶个/mL，按加入转染试剂前的总体积计算。脂质体预混液为：总体积1/30的Opti-MEM^TM培养基，0.004倍总体积的Lipofactemine2000^TM转染试剂；质粒预混液：总体积1/30的Opti-MEM^TM培养基，总体积2倍的质粒质量（μg）。脂质体预混液和质粒预混液分别孵育5min，之后将脂质体预混液和质粒预混液混合孵育25min。加入细胞培养基中，培养4天收集培养基上清，高速离心取上清，0.45μm滤膜过滤，10K超滤管浓缩后利用细胞因子联合检测试剂盒测浓度，结果如表1所示：

表1 重组蛋白的产量

从实施例1和实施例2分别制备的质粒表达的重组蛋白的产量来看，P35和P40亚基的顺序对P70的产量也有影响，具体地，P40在P35之前的连接方式更有利于提高表达产量，达到140.69μg/mL，显著高于P35在P40之前的连接方式获得的重组蛋白的产量（87.37μg/mL）。

从实施例1和实施例3分别制备的质粒表达的重组蛋白的产量来看，利用Furin-GSG-T2A连接子比利用10个柔性氨基酸序列获得的重组蛋白产量更高，后者仅有48.61μg/mL。

从实施例1、实施例4~实施例6分别制备的质粒表达的重组蛋白的产量来看，若去除GSG的核苷酸序列，重组蛋白的产量显著降低（仅有60.31μg/mL）。利用不同功能标签，能够提高重组蛋白产量，其中V5表位标签更有利于提高重组蛋白的产量，达到152.00μg/mL，而3×FLAG标签产量为119.93μg/mL。

本发明首次将2A肽运用于IL-12 P70重组蛋白的表达上，2A肽的剪切效率越高，则重组蛋白的产量越高，从实施例1、实施例7~实施例9分别制备的质粒表达的重组蛋白的产量来看，在IL-12 P70重组蛋白制备过程中，T2A表现出最高的剪切效率，P2A剪切效率显著降低，E2A再次之，F2A效率最低。

实施例11 重组蛋白的抗原活性检测

分别取实施例1~9分别制备的质粒表达的重组蛋白，分别稀释至1×、10×、100×、1000×、10000×和100000×，使用细胞因子联合检测试剂盒（免疫荧光法）（江西赛基生物技术有限公司，赣械注准20192400359），在BD公司的CantoⅡ流式细胞仪上进行活性检测，检测结果如表2所示。

表2 重组蛋白的抗原活性

从实施例1和实施例2分别制备的质粒表达的重组蛋白的抗原活性来看，P35和P40亚基的顺序对重组蛋白P70的抗原活性也有影响，具体地，P40在P35之前的连接方式更有利于提高抗原活性，稀释100000倍仍达到73741.60，显著高于P35在P40之前的连接方式获得的重组蛋白的抗原活性（稀释100000倍为45796.32）。

从实施例1和实施例3分别制备的质粒表达的重组蛋白的抗原活性来看，两个亚基连接在一个质粒上的连接方式对重组蛋白P70的抗原活性也有影响，具体的，插入Furin-GSG-T2A序列更有利于提高抗原活性，稀释100000倍仍达到73741.60，显著高于插入柔性氨基酸来连接获得的重组蛋白的抗原活性（稀释100000倍为25476.25）。

从实施例1、实施例4~6分别制备的质粒表达的重组蛋白的抗原活性来看，若去除GSG的核苷酸序列，重组蛋白的抗原活性显著降低（稀释100000倍只有31609.18）。利用不同功能标签，能够提高重组蛋白的抗原活性。其中，V5表位标签更有利于提高重组蛋白的抗原活性，稀释100000倍仍达到77258.36；其次是3×FLAG标签，稀释100000倍为60963.18。

从实施例1、实施例7~实施例9分别制备的质粒表达的重组蛋白的抗原活性来看，不同的2A肽制备得到的重组蛋白的抗原活性也有显著差异。具体地，利用T2A得到的重组蛋白表现出最高的抗原活性，稀释100000倍仍达到73741.60；其次是利用P2A得到的重组蛋白，稀释100000倍为66819.01；再次为E2A得到的重组蛋白，稀释100000倍为55409.09；利用F2A得到的重组蛋白的抗原活性最低，稀释100000倍为47615.55。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1. 一种重组蛋白的编码基因，其特征在于，所述重组蛋白为IL-12 P70重组蛋白，所述编码基因依次由P40亚基的核苷酸序列、Furin识别位点的核苷酸序列、标签蛋白的核苷酸序列、2A肽的核苷酸序列以及P35亚基的核苷酸序列组成，所述2A肽为T2A，所述标签蛋白为V5表位标签。

2.一种载体，其特征在于，包括权利要求1所述的一种重组蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为pcDNA3.1(+)。

4.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求2所述的一种载体。

5.根据权利要求4所述的一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

6.权利要求4所述的宿主细胞的制备方法，其特征在于，包括将权利要求2或3所述的载体转入受体细胞中的步骤。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述受体细胞为原核细胞，所述转入采用热激转化的方法进行。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述受体细胞为真核细胞，所述转入采用脂质体转染的方法进行。