CN111154778B - 禽新城疫病毒新型基因工程亚单位疫苗 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种禽新城疫病毒新型基因工程亚单位疫苗。所述疫苗的制备方法包括：优化禽新城疫病毒(NDV)的HN蛋白、F蛋白的编码基因；分别克隆包含优化后HN、F蛋白编码基因的真核表达载体，再分别转染CHO细胞，并筛选出悬浮稳定高效表达重组HN、F蛋白的CHO细胞株进行培养，之后分离得到重组HN、F蛋白；将重组HN蛋白、重组F蛋白与佐剂充分混匀。本申请通过对NDV的重要抗原蛋白HN蛋白、F蛋白的编码基因进行优化，并使用CHO细胞进行真核表达，蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，安全性高，表达量可达到2‑4g/L，而且重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，工艺可控性好，批次间产品质量稳定，并显著降低了生产成本。

Description

禽新城疫病毒新型基因工程亚单位疫苗

技术领域

本申请涉及动物免疫药物技术领域，具体而言，涉及一种禽新城疫病毒新型基因工程亚单位疫苗。

背景技术

禽新城疫(Newcastle Disease,ND)是由禽新城疫病毒(Newcastle DiseaseVirus,NDV)引起的一种急性高度接触性传染病。本病一年四季均可发生，尤以寒冷和气候多变季节多发。该病主要特征是呼吸困难，神经机能紊乱，粘膜和浆膜出血和坏死。禽新城疫具有很高的发病率和病死率，世界各地多有发生，且一旦爆发将给禽养殖业带来毁灭性打击，是危害养禽业的一种主要传染病。OIE将其列为A类疫病。我国ND的发病率很高，且死亡率高达90％以上，严重危害我国鸡养殖业的健康发展。

禽新城疫病毒(NDV)在分类上是属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒属(Paramyxovirus)。成熟的病毒粒子近圆形，多数呈蝌蚪状，直径为120-300nm，具有囊膜，内含有一长螺旋状核衣壳，直径17-18nm，囊膜外有长约8-12nm的糖蛋白(HN和F)纤突。F和HN蛋白是重要的宿主保护性抗原，能够诱导机体产生中和抗体(Stone-Hulslander J，Morrison TG.Detection of an interaction between the HN and F proteins inNewcastle disease vims-in-fected cells.Jvirol，1997；71：6287～6295.)。F蛋白是NDV感染细胞的必需蛋白，它不仅能促进病毒囊膜与宿主细胞膜融合，而且能促进相邻宿主细胞之间发生融合，是构成致病力的重要成分。HN蛋白识别并吸附于细胞表面的受体，参与病毒粒子感染。螺旋形核衣壳是由一个与蛋白相联结的单股RNA所形成，具有RNA聚合酶活性，它被一个双层脂质膜所包裹，脂质膜内衬有一层特殊的M蛋白，而脂质膜的外层又被具有纤突的糖蛋白所覆盖，使外形呈花穗状。其中M蛋白是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白，在病毒基因复制转录以及子代病毒粒子组装和释放过程中发挥了重要作用(DUAN Z Q，HU S L，LIUX F.Function compare-son of the matrix protein between Newcastle diseasevirus and other paramyxoviruses-a review[J].Acta Microbiologica Sinica，2016，56(7)：1070—1078.(in Chinese).)。

目前已公开专利申请中，禽新城疫病毒的相关疫苗较多为全病毒灭活疫苗，全病毒苗生产过程中使用活病毒，存在散毒的风险。灭活过程可能存在灭活不彻底的风险。如CN106729689A公开了一种禽新城疫病毒灭活疫苗制备方法，它使用鸡胚成纤维细胞悬浮培养生产新城疫病毒灭活苗，鸡胚成纤维细胞属于原代细胞非常难于培养，病毒滴度不高。

发明内容

本申请旨在提供一种免疫组合物、其制备方法及在制备禽新城疫病毒新型基因工程亚单位疫苗中的应用，以解决现有技术中的问题。

为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种免疫组合物的制备方法，包括：将优化的禽新城疫病毒的HN蛋白编码基因、F蛋白编码基因分别克隆到真核表达载体上，得到重组真核表达载体，之后将所述重组真核表达载体转染CHO细胞，再筛选获得能够悬浮稳定高效表达禽新城疫病毒重组HN蛋白、重组F蛋白的CHO细胞株且进行发酵培养，之后分离得到所述重组HN蛋白、重组F蛋白，其后将所述重组HN蛋白和/或重组F蛋白与佐剂充分混匀，即得所述免疫组合物。

进一步的，所述重组HN蛋白的编码基因为SEQ ID NO:1所示核酸序列或其保守性变异序列，但优选为前者。

进一步的，所述重组HN蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO:3所示核酸序列或其保守性变异序列，但优选为前者。

进一步的，所述保守性变异序列为与原始序列95％以上相同的核酸序列。

本申请的另一目的在于提供一种免疫组合物，包含：

采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者其与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的禽新城疫病毒重组HN蛋白；

以及，

采用SEQ ID NO:3的核酸分子或者与SEQ ID NO:3的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子编码的禽新城疫病毒重组F蛋白。

进一步的，所述的禽新城疫病毒重组HN蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列，，但优选为前者。

进一步的，所述的禽新城疫病毒重组F蛋白包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列，但优选为前者。

本申请的另一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对禽新城疫病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本申请的又一目的在于提供一种所述的免疫组合物用于生产用于预防动物受禽新城疫病毒感染的药剂的用途。

本申请的又一目的在于提供一种核酸分子组合物，包含SEQ ID NO:1的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的用于编码禽新城疫病毒NH蛋白的顺序核苷酸序列；以及，

包含SEQ ID NO:3的顺序核苷酸序列或者与SEQ ID NO:3的核苷酸序列95％以上相同的用于编码禽新城疫病毒F蛋白的顺序核苷酸序列。

本申请的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于在受试动物中诱导针对禽新城疫病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

本申请的又一目的在于提供一种所述的核酸分子用于生产用于预防动物受禽新城疫病毒感染的药剂的用途。

本申请的又一目的在于提供所述的免疫组合物在制备禽新城疫病毒基因工程亚单位疫苗中的用途。

进一步的，制备所述疫苗时，可以单独使用所述重组HN蛋白者或者所述重组F蛋白，也可以将两者混合使用，优选将该两种重组蛋白等比例混合使用。

本申请的又一目的在于提供一种蛋白组合物，其选自由以下组成的组：

SEQ ID NO:2的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列；

SEQ ID NO:4的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本申请的又一目的在于提供一种适用于在受试动物体内产生针对禽新城疫病毒的免疫反应的免疫组合物，包含：

所述的蛋白组合物，和，

佐剂。

进一步，所述佐剂选自白油(M52)、硬脂酸铝、司本、吐温的一种或者两种以上的组合，且不限于此，优选为白油。

本申请提供了一种CHO细胞表达的重组禽新城疫病毒HN和F蛋白以及亚单位疫苗的制备方法和应用，并证明该疫苗能够在鸡体内产生较强的体液免疫，免疫后的鸡能够抵御强毒攻毒，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域，其目的在于提供一种可大规模工业化生产的鸡传染性鼻气管炎病毒重组亚单位疫苗的制备方法：先分别克隆包含重组HN以及F蛋白编码基因的真核表达载体，然后分别转染CHO细胞，通过选择，筛选得到悬浮稳定高效表达HN和F蛋白的CHO细胞株；发酵培养上述的细胞株，浓缩纯化后得到重组HN以及F蛋白；最后将重组HN和重组F蛋白充分混合，然后与佐剂充分混匀得到重组表达亚单位疫苗。

特别是，本申请通过对禽新城疫病毒的HN蛋白编码基因、F蛋白编码基因进行优化，使得最终被表达的重组HN蛋白、重组F蛋白的C端添加有NDV M蛋白的C端序列(参见SeqID:NO:13)，进而使得所述重组HN蛋白和重组F蛋白能够通过这个片段相互作用，从而能够组装成“圆球”样多聚体的结构，亦即形成重组HN蛋白和重组F蛋白的聚合物，使其免疫原性得到显著提升，免疫效果不仅远远优于将现有HN蛋白及F蛋白混合使用的免疫效果，也远远优于将重组HN蛋白及重组F蛋白单独使用或者HN蛋白与F蛋白的融合蛋白的免疫效果。

进一步的，本申请的重组HN蛋白、重组F蛋白中还添加有N蛋白T细胞表位，并且串联重复两次(参见Seq ID:NO:11)，可以增加HI抗体激发能力，从更显著的增加免疫原性。

更进一步的，本申请的重组HN蛋白还针对血凝相关的关键表位做了一次串联重复(参见Seq ID:NO:12)，可以显著增加血凝抑制抗体，增加HI抗体激发能力，增加免疫原性。

更进一步的，本申请的重组F蛋白中，还在F2片段疏水区的后面，将VH氨基酸突变了PP氨基酸，形成一个“柔性”连接，即柔性肽，使得突变的F蛋白表达量显著提高。

此外，本申请提供的方法能够从细胞培养上清中收获目的蛋白，且产量高达2-4g/L，不仅缩短了蛋白纯化时间和简化疫苗生产步骤，也大大降低了疫苗生产成本。

采用上述方案后，本申请与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：

(1)本申请提供一种免疫效果好、工艺更安全的NDV基因工程亚单位疫苗，为达到以上目的，本申请使用CHO细胞表达重组禽新城疫病毒HN和F蛋白。NDV的病毒囊膜含有两个重要抗原蛋白，即融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)，更易激发产生抗体，保护更全面。

(2)本申请生产过程不涉及全病毒，具有天然安全性，通过此方法的表达量非常高，分泌到上清中，易于纯化，哺乳动物细胞真核表达，表达糖基化修饰完善，最接近原始的分子。悬浮培养，易于大规模生产。而全病毒苗生产过程中使用活病毒，存在散毒的风险，灭活过程可能存在灭活不彻底的风险。

(3)本申请使用CHO细胞表达NDV重要抗原蛋白HN和F蛋白，使用真核表达，蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，达到2-4g/L，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，降低了生产成本。免疫组合物可以大规模生产，质控容易；安全性高，免疫原性好；批次间稳定；生产成本低。

附图说明

图1为将HN-MC-NT基因PCR扩增后所获PCR产物进行凝胶电泳的结果；其中1为HN-MC-NT基因；2为阴性对照；M为分子量标记；

图2为多个HN-MC-NT基因转化的菌落样品的PCR扩增后所获PCR产物进行凝胶电泳的结果，其中1～5均为HN-MC-NT基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，6为阴性对照，M为分子量标记；

图3为构建好的真核表达载体PCI-HN-MC-NT-GS的图谱；

图4为将F-MC-NT基因PCR扩增后所获PCR产物进行凝胶电泳的结果；其中1为F-MC-NT基因；2为阴性对照；M为分子量标记；

图5为多个F-MC-NT基因转化的菌落样品的PCR扩增后所获PCR产物进行凝胶电泳的结果，其中1～5均为F-MC-NT基因转化的菌落样品PCR扩增后的产物，6为阴性对照，M为分子量标记；

图6为构建好的真核表达载体PCI-F-MC-NT-GS的图谱；

图7为实施例4中的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果，其中1～4为BSA的四个梯度；5为单独表达优化后HN-MC-NT蛋白的细胞培养物上清；6为优化前HN-ori蛋白的细胞培养物上清；7为阴性对照；M为分子量标记；

图8为实施例4中的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果，其中1～4为BSA的四个梯度；5为F-A蛋白的细胞培养物上清；6为优化前F-ori蛋白的细胞培养物上清；7为优化后F-MC-NT蛋白的细胞培养物上清；M为分子量标记；

图9为实施例5中表达HN-MC-NT蛋白重组CHO上清样品Western Blot检测结果，其中1为单独表达HN-MC-NT蛋白重组CHO上清样品；2为阴性对照；M为分子量标记；

图10为实施例5中表达F-MC-NT蛋白的重组CHO细胞培养物上清Western Blot检测结果；其中1为单独表达F-MC-NT蛋白的重组CHO细胞培养物上清；2为阴性对照；M为分子量标记；

图11为实施例6中的电镜结果图；

图12-图13分别是实施例8中的DLS分析结果。

具体实施方式

鉴于现有技术的不足，本申请人进行了大量研究和实践，并最终得以提出一种免疫效果好、表达量更高以及工艺更安全的禽新城疫基因工程亚单位疫苗。本申请的技术方案主要是使用CHO细胞表达重组禽新城疫病毒HN和F蛋白胞外域。更具体的讲，本申请人于长期研究中发现，M蛋白C端是M蛋白组装及M蛋白相互作用的主要位点，所以分别在HN和F蛋白的C端添加NDV M蛋白的C端序列，发现表达的HN和F蛋白能够通过这个片段相互作用，分别组装成一个“圆球”样多聚体的结构，从而显著提高免疫原性。另外在HN蛋白添加了NDV N蛋白的T包表位以及串联重复了一个血凝相关核心表位，显著提高其免疫原性，增加其血凝抑制(HI)抗体激发的水平，得到优化的重组HN蛋白(其可以被定义为HN-MC-NT蛋白，HN表示NDV HN蛋白的胞外区，MC表示M蛋白C端片段，NT表示N蛋白T细胞表位)。在F蛋白添加了N蛋白的T包表位，同时在F2(F蛋白的裂解产物，一个片段)蛋白的疏水区后面将两个氨基酸VH突变成PP，增加一个柔性连接片段，显著提高F蛋白的表达量，得到优化的重组F蛋白(其可以被定义为F-MC-NT蛋白，F表示NDV F蛋白的胞外区，MC表示M蛋白C端片段，NT表示N蛋白T细胞表位)。将改造后的F-MC-NT和HN-MC-NT蛋白混合在一起，免疫效果远远优于单独将天然蛋白序列的HN和F蛋白胞外域混合在一起或者将两者做成一个融合蛋白的免疫效果。

本申请生产过程中也不涉及全病毒，具有天然安全性，通过此方法的表达量非常高，分泌到上清中，易于纯化，哺乳动物细胞真核表达，表达糖基化修饰完善，最接近原始的分子。悬浮培养，易于大规模生产。

以下将结合具体实施案例对本申请的技术方案进行更为详细的说明。

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本申请提供了一种免疫组合物，包含：

采用SEQ ID NO:1的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子(优选为前者)编码的禽新城疫病毒HN蛋白；

以及，

采用SEQ ID NO:3的核酸分子或者与SEQ ID NO:3的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子(优选为前者)编码的禽新城疫病毒F蛋白。

本申请也涉及一种诱导针对NDV抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本申请的疫苗。

本申请也涉及一种保护受试动物免受NDV感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本申请的疫苗。

本申请还包括适用于诱导针对NDV的免疫反应的疫苗。本申请的疫苗可包含上述核酸分子的质粒。核酸分子可被并入病毒颗粒中。疫苗可还包含佐剂分子。佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方案中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

本文提供一种疫苗，包括选自由以下组成的组的蛋白组合物：包含SEQ ID NO:2和/或4的蛋白；在SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白；SEQ IDNO:2或4的片段；与SEQ ID NO:2或4的片段95％相同的蛋白ID NO，但优选为SEQ ID NO:2和/或4的蛋白。

本文还提供一种疫苗，包括一种选自由以下组成的组的蛋白：(a)SEQ ID NO:2和/或4；(b)在如SEQ ID NO:2或4所述的全长序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的蛋白；(c)SEQ ID NO:2或4的包含SEQ ID NO:2的20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的整个长度上95％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；但优选为组(a)。

还提供一种疫苗，包括包含编码上文所述的一种或多种蛋白分子的序列的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸分子包含选自由以下组成的组的序列：SEQ ID NO:1和/或3；在SEQ ID NO:1或3的核苷酸序列的整个长度上95％相同的核酸序列；SEQ ID NO:1或3的片段；与SEQ ID NO:1或3的片段95％相同的核苷酸序列；但优选为SEQ ID NO:1和/或3。

本申请一些方面提供诱导针对NDV的免疫反应的方法，所述方法包括以下步骤：向个体施用NDV抗原和/或其组合物。

本申请另外的一些方面提供保护个体免受NDV感染的方法。所述方法包括以下步骤：向所述个体施用预防有效量的包含此类核酸序列的核酸分子或组合物；其中所述核酸序列在所述个体的细胞中表达，并且针对由所述核酸序列编码的蛋白诱导保护性免疫反应。

本申请的一些方面提供一种诱导针对NDV抗原的免疫反应的方法，所述方法包括向受试动物施用本申请的核酸分子。

本申请的一些方面提供一种保护受试动物免受NDV感染的方法，所述方法包括向所述受试动物施用本申请的核酸分子。

在另一方面，本申请提供一种选自由以下组成的组的蛋白：(a)SEQ ID NO:2和/或4；(b)在SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的整个长度上98％相同的蛋白；(c)SEQ ID NO:2或4的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；以及(d)在SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列的整个长度上98％相同的蛋白的包含20个或更多个氨基酸的免疫原性片段；但优选为组(a)。

本申请的一些方面提供一种适用于在受试动物中产生针对NDV的免疫反应的疫苗，所述疫苗包含：本申请的核酸分子以及佐剂分子。所述佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、IL-21、IL-31、IL-33或其组合；并且在一些实施方案中，可为IL-12、IL-15、IL-28或RANTES。

本申请的疫苗可还包括一种或多种如上所述的核酸分子和一种或多种由所述核酸分子编码的蛋白。

1.定义.

本文所用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的而并不旨在限制。如在说明书和所述权利要求中所使用，除上下文另外明确规定之外，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式。

对于本文所列举的数值范围，明确涵盖了在有相同精密度之间的每个插入的数字。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还涵盖数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。

如本文所用的“佐剂”意指被添加到本文所述的基因工程亚单位疫苗中来增强由编码核酸序列的所编码的抗原免疫原性的任何分子。

如本文所用的“抗体”意指类型IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗体，或片段、其片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd以及单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能抗体及其衍生物。所述抗体可以是从动物的血清样本中分离出的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物，所述混合物对所需的表位或从其衍生的序列表现足够的结合特异性。

如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。所述编码序列可以进一步包括可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸的个体或动物的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。

如本文所用的“互补体”或“互补”意指核酸可以指在核苷酸或核酸分子的核苷酸类似物之间的Watson-Crick(例如，A-T/U和C-G)或者Hoogsteen碱基配对。

如本文所用的“共有”或“共有序列”意指基于分析特定NDV抗原的一队列的多个亚型的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含蛋白的疫苗可以被用来诱导针对特定NDV抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫，所述疫苗包含编码这些蛋白的共有序列和/或核酸分子。

如本文可互换使用的“电穿孔”、“电-透化作用”或“电动增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲来诱导在生物膜中的微观途径(孔隙)；它们的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子以及水从细胞膜的一侧流动到另一侧。

如本文所用的相对于核酸序列的“片段”意指编码能够在与全长野生型病毒株NDV抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽的核酸序列或其一部分。所述片段可以是选自编码下文所述的蛋白片段的各种核苷酸序列的至少一种的DNA片段。

就多肽序列来说，“片段”或“免疫原性片段”意指能够在与全长野生型病毒株NDV抗原交叉反应的动物中引发免疫反应的多肽。蛋白的片段可以包含蛋白的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。在一些实施方案中，蛋白的片段可以包含蛋白的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多。

如本文所用的术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白的核苷酸序列的DNA或RNA分子。所述编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多聚腺苷酸化信号。如本文所用的术语“表达形式”是指基因构建体，所述基因构建体含有可操作地连接至编码蛋白的编码序列的必须的调控元件，以使得当存在于所述个体的细胞中时，编码序列将表达。

如本文所用的术语“同源性”是指互补性程度。可存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。至少部分抑制完全互补序列杂交于靶标核酸的部分互补序列是使用功能术语“基本上同源”来提及。当关于如cDNA或基因组克隆的双链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于双链核酸序列的链。当关于单链核酸序列使用时，如本文所用的术语“基本上同源”是指探针可在低严格性条件下杂交于单链核酸模板序列(即，是单链核酸模板序列的互补序列)。

在两种或更多种核酸或多肽序列的情况下，如本文所用的“相同”或“同一性”意指在指定区域中序列具有相同残基的指定百分比。可以通过以下来计算所述百分比：最佳地比对两个序列、在指定区域比较两个序列、确定在两个序列中相同的残基的位置的数量以产生匹配位置的数量、以匹配位置的数量除以在指定区域内的位置的总数量，并且将结果乘以100以产生序列同一性的百分比。在两个序列具有不同的长度或者比对产生一个或多个交错的末端并且比较的指定区域仅包括单一序列的情况下，单一序列的残基被包括在计算的分母中而不是分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可以被认为是等同的。同一性可以手动地或者通过使用计算机序列算法如BLAST或者BLAST 2.0来执行。

如本文所用的“免疫反应”意指响应于抗原如NDV共有抗原的引入，宿主的免疫系统(例如动物的免疫系统)的活化。所述免疫反应可以是细胞反应或体液反应或两者的形式。

如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描述还定义了互补链的序列。因此，核酸还涵盖了所描述的单链的互补链。核酸的很多变体可以被用于与给定的核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖了基本上相同的核酸和其互补体。单链提供可以与靶序列在严格的杂交条件下杂交的探针。因此，核酸还涵盖了在严格杂交条件下杂交的探针。

核酸可以是单链的或者双链的或可以含有双链或者单链序列两者的部分。所述核酸可以是DNA、基因组和cDNA两者、RNA或杂合体，其中所述核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌啉、肌苷、黄嘌呤次黄嘌呤、异胞嘧啶以及异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可以通过化学合成方法或者通过重组方法来获得。

如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达是在空间上与之连接的启动子的控制下进行的。在其控制下，启动子可以被定位在基因的5'(上游)或者3'(下游)。所述启动子和基因之间的距离可以大约与所述启动子和其在启动子从中衍化的基因中所控制的基因之间的距离相同。如本领域所已知，这个距离的变化可以在没有失去启动子功能的情况下进行调整。

如本文所用的“启动子”意指合成的或自然来源的分子，所述分子能够赋予、活化或增强细胞中的核酸的表达。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列以便进一步增强表达和/或改变其空间的表达和/或时间的表达。启动子还可以包含远端增强子或阻遏元件，它们可以位于从转录的起始点开始的差不多几千对碱基对处。启动子可以从包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫以及动物的来源中获得。启动子可以相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达的发育阶段或响应于外部刺激如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂而基本地或区别地调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、乳糖操纵子-启动子、tac启动子、SV40后期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMVIE启动子、SV40早期启动子或者SV40后期启动子以及CMVIE启动子。

“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用并且是指可以被连接在本文所述的NDV蛋白的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指示蛋白的位置。本文所用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白从产生其的细胞中分泌。信号肽/前导序列常常从蛋白的剩余部分裂解，所述蛋白在从细胞分泌后经常被称为成熟蛋白。信号肽/前导序列连接在所述蛋白的N端。

如本文所用的“严格的杂交条件”意指这样的条件，即在所述条件下如在核酸的复杂混合物中第一核酸序列(例如，探针)将与第二核酸序列(例如，靶标)进行杂交。严格的条件是序列依赖性的并且在不同的环境中将是不同的。严格的条件在限定的离子强度pH下可以被选择为比特定序列的热力学熔点(Tm)低约5-10℃。所述Tm可以是这样的温度(在限定的离子强度、pH以及核酸浓度下)，在所述温度下与靶标互补的50％的探针与靶序列在平衡状态下进行杂交(因为靶序列过量存在，在Tm下，50％的探针在平衡状态下被占用)。严格条件可以是那些条件，即其中盐浓度小于约1.0M的钠离子，如在pH7.0至8.3下约0.01-1.0M的钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短的探针(例如，约10-50个核苷酸)为至少约30℃且对于长的探针(例如，大于约50个核苷酸)为至少约60℃。严格的条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。对于选择的或特定的杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2至10倍。示例性的严格的杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5x SSC以及1％SDS、在42℃下孵育，或者5x SSC、1％SDS、在65℃下孵育、在65℃下用0.2x SSC和0.1％SDS洗涤。

如本文所用的“基本上互补”意指第一序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸的区域内与第二序列的互补体至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或者意指两个序列在严格的杂交条件下进行杂交。

如本文所用的“基本上相同”意指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540或更多个核苷酸或氨基酸区域内是至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同的，或者就核酸而言，如果第一序列与第二序列的互补体基本上互补，则第一序列和第二序列也这样相同。

“亚型”或“血清型”：如本文交换使用的并且关于NDV，意指NDV的基因变体，以使得一个亚型被免疫系统识别而从不同的亚型中分离。

本文就核酸而言所用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补体；(iii)与参考核酸或其互补体基本上相同的核酸；或者(iv)在严格的条件下与参考核酸、其互补体或与其基本上相同的序列杂交的核酸。

就肽或多肽而言的“变体”通过氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列上不同，但是保留至少一种生物活性。变体还意指具有与参考蛋白基本上相同的氨基酸序列的蛋白，所述参考蛋白具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列。氨基酸的保守性取代，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化可以部分通过考虑氨基酸的亲疏水性指数来识别。凯特(Kyte)等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)157:105-132(1982)。所述氨基酸的亲疏水性指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲疏水性指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白功能。在一个方面，亲疏水性指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。如本领域所了解的，具有相似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可用具有彼此在±2内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的亲疏水性指数和亲水性值两者都受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其它特性所揭示的。

如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并优选地是DNA质粒。

2.疫苗

本申请涉及一种禽新城疫病毒疫苗。禽新城疫病毒疫苗(NDV)可包含编码NDV抗原的核酸。本申请的疫苗可被设计来控制受试动物中针对一种或多种NDV血清型的免疫反应的程度或强度。

疫苗可包含抑制它整合至染色体中的元件或试剂。疫苗可包含编码NDV HN蛋白以及F蛋白的RNA。可将RNA疫苗引入细胞中。本申请的疫苗可包含NDV HN蛋白以及F蛋白。NDVHN蛋白以及F蛋白是通过诱导1)细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应、2)T辅助细胞反应以及/或3)B细胞反应，或优选所有以上提及的反应，以达成交叉递呈来进行的免疫介导的病毒清除的靶标。

所述抗原可以包含使它们特别有效地作为免疫原的蛋白表位，可针对所述免疫原诱导抗NDV免疫反应。NDV抗原可以包括全长翻译产物、其变体、其片段或其组合。

一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有95％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有96％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有97％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有98％同源性的核酸分子。一些实施方案涉及编码免疫原性蛋白的与本文核酸编码序列具有99％同源性的核酸分子。在一些实施方案中，具有与本文所公开的蛋白的编码序列同源的本文所公开的编码序列的核酸分子包含编码IgE前导序列的连接至编码本文所公开的同源蛋白序列的编码序列的5’末端的序列。

在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，所述核酸序列不含编码IgE前导物的编码序列。

一些实施方案涉及SEQ ID NO:1或3的片段。片段可以是至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％的SEQ ID NO:1或3。片段可与SEQ ID NO:1或3的片段至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。片段可与SEQ ID NO:1的片段至少80％、至少85％、至少90％至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同。在一些实施方案中，片段包含编码前导序列的序列，例如免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列的编码序列。在一些实施方案中，片段不含编码前导序列，例如像IgE前导物的编码序列。

一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2或4同源的蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ IDNO:2或4中所述的蛋白序列具有95％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQID NO:2或4中所述的蛋白序列具有96％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2或4中所述的蛋白序列具有97％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2或4中所述的蛋白序列具有98％同源性的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及与如SEQ ID NO:2或4中所述的蛋白序列具有99％同源性的免疫原性蛋白。

一些实施方案涉及与SEQ ID NO:2或4相同的蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上80％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上85％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上90％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上91％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上92％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ IDNO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上93％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上94％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上95％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上96％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上97％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上98％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。一些实施方案涉及具有在如SEQ ID NO:2或4中所述的全长共有氨基酸序列的整个氨基酸序列长度上99％相同的氨基酸序列的免疫原性蛋白。

在一些实施方案中，蛋白不含前导序列。在一些实施方案中，蛋白不含IgE前导物。蛋白的片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的蛋白。可提供SEQ ID NO:2或4的免疫原性片段。免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:2或4。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2或4的免疫原性片段同源的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO:2或495％同源的蛋白。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有96％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有97％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有98％同源性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文蛋白序列的免疫原性片段具有99％同源性的免疫原性片段。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导序列，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

可提供氨基酸序列与SEQ ID NO:2或4的免疫原性片段相同的蛋白的免疫原性片段。所述免疫原性片段可包含至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％或至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的在SEQ ID NO:2或4中所述的氨基酸序列的整个长度上80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同的蛋白。在一些实施方案中，片段包括前导序列，例如像免疫球蛋白前导物，如IgE前导物。在一些实施方案中，片段不含前导序列。在一些实施方案中，片段不含前导序列，例如像IgE前导物。

3.疫苗构建体和质粒

禽新城疫病毒的基因组包括一个表达框，用于编码6种病毒结构蛋白。有3种与病毒的脂质膜有关，即覆盖在病毒囊膜表面的纤突上的血凝素和神经氨酸酶活性的(HN)糖蛋白、融合(F)糖蛋白，以及脂膜内的非糖基化内膜蛋白(M)。疫苗可包括编码NDV HN蛋白以及F蛋白、NDV抗原以及NDV HN蛋白以及F蛋白/抗原的组合的核酸构建体或质粒。本文提供可以包含编码本文所公开的NDV抗原的核酸序列的遗传构建体，所述核心抗原包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列。另外，本文提供可包含编码本文公开的NDV表面抗原(包括蛋白序列、与蛋白序列同源的序列、蛋白序列的片段以及与蛋白序列的片段同源的序列)的核酸序列的遗传构建体。所述遗传构建体可以作为功能性染色体外的分子而存在。所述遗传构建体可以是包括着丝粒、端粒或质粒或粘粒的线性微型染色体。

所述遗传构建体还可以是重组病毒载体的基因组的一部分，所述重组病毒载体包括重组腺病毒、重组腺病毒伴随病毒以及重组牛痘。遗传构建体可以是在减毒的活微生物或活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的部分。

遗传构建体可以包含用于核酸的编码序列的基因表达的调控元件。调控元件可以是启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或多聚腺苷酸化信号。

核酸序列可组成可以是载体的遗传构建体。所述载体能够以在动物中有效引发免疫反应的量在动物的细胞中表达抗原。所+述载体可以是重组体。所述载体可以包含编码抗原的异源核酸。所述载体可以是质粒。所述载体可以适用于用编码抗原的核酸来转染细胞，所述转化的宿主细胞在其中发生抗原表达的条件下培养并维持。

编码序列可以被优化来用于表达的稳定性和高水平。在一些情况下，选择密码子来减少RNA二级结构的形成，如由于分子内键而形成的二级结构。

所述载体可以包含编码抗原的异源核酸，并且可以进一步包含可以在抗原编码序列的上游的起始密码子和可以在抗原编码序列的下游的终止密码子。起始密码子和终止密码子可以与抗原编码序列在框中。所述载体还包含可操作地连接至抗原编码序列的启动子。可操作地连接至抗原编码序列的启动子可以是来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、鸟类白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子如CMV立即早期启动子、爱巴二氏(Epstein Barr)病毒(EBV)启动子或劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子。所述启动子还可以是来自人基因的启动子，所述人基因如人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白。所述启动子还可以是组织特异性启动子，如天然或合成的肌肉或皮肤特异性启动子。

所述载体还可以包含多聚腺苷酸化信号，所述多聚腺苷酸化信号可以在NDV核心蛋白编码序列的下游。所述多聚腺苷酸化信号可以是SV40多聚腺苷酸化信号、LTR多聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)多聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)多聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白多聚腺苷酸化信号。所述SV40多聚腺苷酸化信号可以是来自pCEP4载体(Invitrogen，San Diego，CA)的多聚腺苷酸化信号。

载体也可包含在共有NDV核心蛋白编码序列或共有NDV表面抗原蛋白编码序列的上游的增强子。所述增强子对于DNA表达是必须的。所述增强子可以是人肌动蛋白、人肌凝蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、HA、RSV或者EBV的一种增强子。

载体还可以包含动物的复制起点，以便将载体维持在染色体外并在细胞中产生载体的多个拷贝。所述载体可以是来自Invitrogen(SanDiego，CA)的pVAX1、pCEP4或者pREP4，其可以包含爱巴二氏病毒的复制起点和核抗原EBNA-1编码区域，这可以在没有整合的情况下产生高拷贝附加型复制。所述载体可以是具有变化的pVAX1或者pVax1变体，如本文所述的变体质粒。所述变体pVax1质粒是主链载体质粒pVAX1(Invitrogen，CarlsbadCA)的2998碱基对变体。所述CMV启动子位于碱基137-724处。T7启动子/引发位点位于碱基664-683处。多克隆位点位于碱基696-811处。牛GH多聚腺苷酸化信号是在碱基829-1053处。卡那霉素(Kanamycin)抗性基因是在碱基1226-2020处。pUC起点是在碱基2320-2993处。

所述载体可以是pSE420(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白。所述载体可以是pYES2(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae strain)中产生蛋白。所述载体还可以具有MAXBACTM完整的杆状病毒表达系统(Invitrogen，San Diego，Calif.)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白。所述载体还可以是pcDNAI或者pcDNA3(Invitrogen，SanDiego，Calif.)，其可用于在动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生蛋白。所述载体可以是通过常规技术和容易可得的起始物质来产生蛋白的表达载体或系统，所述技术和物质包括Sambrook等，Molecular Cloning and Laboratory Manual，第2版，ColdSpring Harbor(1989)。

本申请使用CHO细胞表达重组禽新城疫病毒HN和F蛋白胞外域，本申请的发明人研究发现M蛋白C端是M蛋白组装及M蛋白相互作用的主要位点，所以，分别在HN和F蛋白的C端添加NDV M蛋白的C端序列，发现使得表达的HN和F蛋白能够通过这个片段相互作用，分别组装成一个“圆球”样多聚体的结构，从而显著形成一个HN和F蛋白的聚合物，提高免疫原性。

本申请另外在HN蛋白基因序列中添加了NDV N蛋白的T细胞表位以及串联重复了一个血凝相关核心表位，显著提高其免疫原性，增加其血凝抑制(HI)抗体激发的水平，得到优化的HN-MC-NT蛋白(HN表示NDV HN蛋白的胞外区，MC表示M蛋白C端片段，NT表示N蛋白T细胞表位)。

本申请还在F蛋白基因序列中添加了NDV N蛋白的T细胞表位，同时在F2(F蛋白的裂解产物，一个片段)蛋白的疏水区后面将两个氨基酸VH突变成PP，增加一个柔性连接片段，显著提高F蛋白的表达量，得到F-MC-NT蛋白(F表示NDV F蛋白的胞外区，MC表示M蛋白C端片段，NT表示N蛋白T细胞表位)。

本申请将改造后的F-MC-NT蛋白和HN-MC-NT蛋白混合在一起，免疫效果远远优于单独将天然蛋白序列的HN和F蛋白胞外域单边混合在一起或者将两者做成一个融合蛋白的免疫效果。

本申请中使用的真核表达载体可以选自但不限于pSV2-GS、pCI-GS或pcDNA4-GS，优选为pCI-GS。

本申请中使用的CHO细胞系可以选自但不限于DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株，优选为CHO-S。

本申请中使用的佐剂可以选自但不限于白油(M52)、硬脂酸铝、司本、吐温中的任意一种或者两种以上的组合，优选为白油。

本申请使用CHO细胞表达优化后的NDV重要抗原蛋白即F-MC-NT蛋白和HN-MC-NT蛋白，使用真核表达，蛋白糖基化充分，抗原蛋白免疫原性好，并且表达量非常高，达到20-40g/L，重组细胞能够大规模悬浮培养，大大降低了疫苗制备的复杂程度，降低了生产成本。

本申请中使用的真核表达载体、CHO细胞、佐剂等可以通过多种已知途径获取，例如佐剂可以采购自苏州世诺生物技术有限公司，其还可进一步提高疫苗效果。

较之现有技术，本申请提供的禽新城疫基因工程亚单位疫苗免疫效果更好、表达量更高、工艺更安全。

实施例1：重组真核表达载体pCI-HN-MC-NT-GS的构建

1.HN-MC-NT基因扩增与纯化 密码子优化改造的HN蛋白编码基因(可以定义为HN-MC-NT基因，HN表示NDV HN蛋白的胞外区，MC表示M蛋白C端片段，NT表示N蛋白T细胞表位)来自南京金斯瑞生物科技有限公司，并克隆到pUC-57载体上，构建了pUC-HN-MC-NT质粒载体。优化后的HN-MC-NT基因序列如SEQ ID NO:1所示。以pUC-HN-MC-NT作为模板，HN-F、HN-R作为引物进行PCR扩增(HN-F、HN-R的基因序列如SEQ ID NO.5、6所示)，扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

表1 HN-MC-NT基因扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图1所示，在2.0kbp的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2.酶切 将pCI-GS质粒和纯化后的HN-MC-NT基因PCR产物分别使用XhoⅠ、KpnⅠ37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表2 HN-MC-NT基因酶切反应体系

表3 pCI-GS质粒酶切反应体系

3.连接 将酶切过的pCI-GS质粒和HN-MC-NT基因酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。

表4 HN-MC-NT基因与pCI-GS质粒连接体系

4.转化 取10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5.菌落PCR和测序鉴定 挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，HN-F和HN-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现2.0kbp条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。得到真核表达载体pCI-HN-MC-NT-GS。构建好的载体图谱如图3所示。

实施例2：重组真核表达载体pCI-F-MC-NT-GS的构建

1.F-MC-NT基因扩增与纯化 南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子改造优化的F蛋白编码基因(可以定义为F-MC-NT基因，F表示NDV F蛋白的胞外区，MC表示M蛋白C端片段，NT表示N蛋白T细胞表位)，并克隆到pUC-57载体上，构建了pUC-F-MC-NT质粒载体。优化后的F-MC-NT基因序列如SEQ ID NO:3所示。以pUC-F-MC-NT作为模板，F-F、F-R作为引物进行PCR扩增(F-F、F-R的基因序列如SEQ ID NO.7、8所示)，扩增体系见表5。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

表5 F-MC-NT基因扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳鉴定目的基因大小，如图4所示，在1.6kbp的位置出现条带，目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。

2.酶切 将pCI-GS质粒和纯化后的F-MC-NT基因PCR产物分别使用XhoⅠ、KpnⅠ37℃酶切3小时，反应体系见表6、表7。酶切产物凝胶电泳后分别回收，用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表6 F-MC-NT基因酶切反应体系

表7 pCI-GS质粒酶切反应体系

3.连接 将酶切过的pCI-GS质粒和F-MC-NT基因酶切产物使用T4 DNA连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表8。

表8 F-MC-NT基因与pCI-GS质粒连接体系

4.转化 取10μl连接产物加入100μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900μl不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0ml菌液离心浓缩成100μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5.菌落PCR和测序鉴定 挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，F-F和F-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图5所示，出现1.6kbp条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。得到真核表达载体pCI-F-MC-NT-GS。构建好的载体图谱如图6所示。

实施例3：表达HN-MC-NT蛋白和F-MC-NT蛋白的重组CHO细胞的构建与筛选

1.细胞转染

1.1准备细胞 取对数生长期的CHO细胞，取样计数，以1×10⁶cells/ml的细胞密度继续传代，维持种子，剩余细胞离心，1000rpm离心4分钟后，弃上清，用20ml左右的新鲜CHO-WM培养基重悬，再次离心，1000rpm离心4分钟，弃上清后用少量培养基重悬计数，最终将细胞密度调整为1.43×10⁷cells/ml。

1.2质粒与细胞混合 取实施例1中pCI-HN-MC-NT-GS质粒载体5μg，加入至EP管中，添加0.7ml细胞，混合均匀后，静置15分钟。

1.3电转 280V20ms电击2个脉冲，电击完成后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培养，48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6×10⁶cells/ml时，添加50μM MSX加压筛选。

2.单克隆筛选

2.1用苏州沃美生物技术有限公司的CHO细胞无血清无蛋白培养基CHO-WM细胞培养基+50μMMSX重新悬浮细胞，计数。

2.2铺板 稀释细胞至5个/mL，取200μl混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5％CO₂细胞培养箱中孵育4-6h。记录单个细胞的孔。

2.3待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，100μl0.25％trypsin-EDTA，室温消化2min左右，加入2mL CHO-WM培养基(含10％FBS+50μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，Elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养，冻存。

3.细胞摇瓶发酵

3.1传代培养基的配置：使用CHO-WM培养基添加50μMMSX作为传代培养基，置于37℃水浴锅总预热至37℃。

3.2从CO₂恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

3.3稀释细胞至2.5-3.5×10⁵个细胞/mL接种30mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5％CO₂恒温摇床中100rpm/min孵育过夜。

3.4每隔24h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

以同样的操作方法构建并筛选表达F-MC-NT蛋白的重组CHO细胞。

另外按照上面的实施例方法构建如下表达NDV HN蛋白的细胞株：

表9

另外按照上面的实施例方法构建如下表达NDV F蛋白的细胞株：

表10

实施例4：SDS-PAGE检测

分别将实施例3中收获的重组HN-MC-NT蛋白和重组F-MC-NT蛋白细胞培养物上清进行SDS-PAGE检测，同时使用HN-ori蛋白、F-ori蛋白以及F-A蛋白细胞培养物作为对照，并且使用空的CHO细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40μl稀释10倍的细胞培养物，加入10μl的5×loading buffer，沸水浴5分钟，12000r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶(12％浓度凝胶)电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。

检测结果如图7和图8所示，优化后HN-MC-NT蛋白在78kDa附近出现目的条带，HN-ori蛋白在67kDa附近出现目的条带；优化后的F-MC-NT蛋白在69kDa附近出现目的条带，F-ori蛋白在54kDa附近出现目的条带，F-A蛋白在69kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

根据电泳结果，通过灰度扫描的方法，使用标准梯度浓度BSA蛋白作为对照品，计算目的蛋白的表达量。根据计算，HN-MC-NT蛋白的表达为3.5mg/mL，F-MC-NT蛋白的表达量为2.02mg/mL，F-A的表达量为0.041mg/mL，结果显示F-MC-NT蛋白比F-A蛋白在表达量上有显著的提高。

实施例5：Western Blot检测

将实施例4中SDS-PAGE电泳后的产物分别转印到NC(硝酸纤维素)膜上，用5％脱脂牛奶封闭2小时，鸡源抗NDV多抗血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗鸡多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。结果如图9和图10所示，图中重组CHO上清样品有细胞条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达，同时优化后的蛋白表达量更高。

实施例6：电镜检测

分别将实施例3中重组HN-MC-NT蛋白和重组F-MC-NT蛋白细胞培养物超声破碎，12000r/min离心30分钟，取上清，0.22μm滤膜过滤，去除杂质，使用截留分子量为3kDa的超滤管浓缩10倍。每个离心管加入浓度为40％的蔗糖溶液10ml，然后加入2.0ml超滤浓缩样品，29000r/min超速离心2小时，弃上清，沉淀用2.0ml PBS重悬。然后将悬液经过浓度分别为50％、60％、70％、80％的梯度浓度蔗糖离心，29000r/min超速离心2小时，然后收集位于50％～60％浓度交界处的条带。使用磷钨酸负染观察收集的产物，电镜下观察到“圆球状的多聚体的结构”，直径约10-20nm，电镜结果见图11。

实施例7：琼扩检测

使用琼扩方法检测表达的重组F-MC-NT蛋白和重组HN-MC-NT蛋白效价，在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入NDV琼扩检测标准血清，周围分别加入稀释了2的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次方的表达抗原。倒置孵育72h后观察沉淀线。出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价。琼扩效价检测结果如下：NDV-HN-MC-NT蛋白琼扩效价为1:512，NDV-F-MC-NT蛋白琼扩效价为1:256。

实施例8：动态光散射(DLS)

打开DLS电源及电脑，运行软件Dynamics程序，将温度设定在20℃，并待其温度稳定。用纯水作对照，检查比色杯的清洁度，点击软件左侧Start框，若极限大于20需重新清洗比色杯。将50μL纯化后的蛋白(用蛋白缓冲液进行1/10稀释)溶液于4℃，13000rpm离心10min。选择Tools菜单中的Connect选项，用移液器吸取10μL重组HN蛋白上层样品，沿壁缓慢注入比色杯，避免产生气泡。点击右侧Start框，待计数(横坐标)20次后停止。点击Regulation Histogram选项，Results Summary选项，评价样品质量，保存文件。以同样方式操作重组F蛋白。检测平均粒径和分散性指数PdI(表明蛋白质的均一性)。

粒径分布结果如图12、图13所示，HN-MC-NT蛋白平均粒径为10-20nm，PdI<0.1。同样的方法检测F-MC-NT蛋白平均粒径为12-20nm，PdI<0.1。

实施例9：亚单位疫苗制备

分别将实施例3中收获的细胞培养物上清使用使用生理盐水进行稀释，使HN-MC-NT蛋白、HN-ori蛋白、HN-A蛋白、HN-B蛋白和HN-C蛋白的浓度达到100μg/mL，使F-MC-NT蛋白、F-ori蛋白、F-A蛋白、F-B蛋白和F-C蛋白的浓度达到80μg/mL。然后分别将上述稀释蛋白等比例混合或者单独加入到白油佐剂中，使用高速剪切乳化机乳化混匀，质检合格后置于4℃保存。

实施例10：免疫原性

试验一：

按照实施例9中的浓度和方法制备成含有单一抗原或者混合抗原的疫苗进行免疫原性试验。用30-60日龄SPF鸡，每组10只，然后注射由不同抗原蛋白制备的疫苗。接种后21日，分别采血检测血凝抑制效价，然后每只鸡分别肌肉注射禽新城疫病毒北京株强毒1ml(含10⁴ELD₅₀)，观察14日，记录存活比例，结果如下表11。

表11

从表11可以看出，通过比较A和C组实验，在HN蛋白胞外域的C端添加MC片段从而形成“圆球状”聚体结构，能够显著提高HN蛋白的免疫原性。HI抗体效价提高了快4个滴度。通过比较比较A和B组实验，对HN蛋白胞外域进行改造，串联重复了一个跟血凝相关的抗原表位，抗原激发的HI抗体水平有了明显的提高。

表12

从表12可以看出，通过比较A和C组实验，F蛋白的胞外域较HN蛋白胞外域激发的HI抗体水平整体偏低，这个跟F蛋白在血凝中起到的作用小于HN蛋白有关，但是F蛋白也是病毒稀释侵染过程中非常重要的一个蛋白，针对F蛋白的中和抗体能够显著的抑制病毒的侵染复制。从上面结果可以看出，在F蛋白胞外域的C端添加MC片段从而形成“圆球状”聚体结构，能够显著提高F蛋白的免疫原性。HI抗体效价提高了快3个滴度。

试验二：

按照实施例9中制备方法，使用HN-MC-NT蛋白和F-MC-NT蛋白以及HN-B蛋白和F-B蛋白制备的含有单一抗原的疫苗进行免疫原性试验。用30-60日龄SPF鸡，每组10只，然后注射由不同抗原蛋白制备的疫苗。接种后21日，分别采血检测鸡血液中细胞因子。

使用ELISA方法检测IL-6、IL-1β分泌，按照说明书要求，取100μl上清加入已包被抗体的96孔板，每组各设立3个复孔；37℃反应90min，加入生物素标记的一抗37℃反应60min，洗涤后加入ABC工作液37℃反应30min，洗涤后TMB显色液37℃30min，用酶标仪在450nm波长检测吸光度。结果见表13。从结果可以看出，HN-MC-NT较HN-B，F-MC-NT较F-B实验组，鸡血清中IL-6以及IL-1β的浓度显著提高，说明前者激发更强的T细胞免疫。

表13细胞培养介质中IL-6、IL-1β蛋白浓度

试验三：

按照实施例9中的制备方法，使用HN-MC-NT蛋白和F-MC-NT蛋白单一抗原疫苗以及HN-MC-NT蛋白和F-MC-NT蛋白等比例混合物疫苗进行免疫原性试验。用30-60日龄SPF鸡，每组10只，然后注射由不同抗原蛋白制备的疫苗。接种后21日，分别采血检测血凝抑制效价，然后每只鸡分别肌肉注射禽新城疫病毒北京株强毒1ml(含10⁴ELD₅₀)，观察14日，记录存活比例，结果见表14。

表14

通过上面实验可以看出，HN-MC-NT蛋白和F-MC-NT蛋白具有相互促进作用，两者混合使用后，HI抗体得到显著提高，攻毒的保护率达到了100％。所以配置疫苗时，优选将两者混合使用。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 禽新城疫病毒新型基因工程亚单位疫苗

<150> 2019101456480

<151> 2019-02-27

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1956

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

atggaaacag atacactcct cctctgggtg ctgctcctct gggtgccagg atctacagga 60

caccatcatc accaccatca tgacagggcc gtgtcccagg tggctctgga gaacgatgag 120

cgggaggcta agaatacctg gagactgatc ttccgcatcg ccatcctgtt tctgaccgtg 180

gtgacactgg ccatcagcgt ggcttctctg ctgtattcta tgggagcttc cacccctagc 240

gacctggtgg gcatcccaac aagaatctcc cgcgccgagg agaagatcac ctctacactg 300

ggctccaacc aggacgtggt ggatagaatc tacaagcagg tggccctgga gtctcctctg 360

gctctgctga agaccgagac cacaatcatg aacgctatca catctctgtc ctaccagatc 420

aatggagctg ctaacaattc cggatgggga gctcctatcc acgacccaga ttatatcggc 480

ggcatcggca aggagctgat cgtggacgat gccagcgatg tgacctcttt ctacccagat 540

tatatcggcg gcatcggcaa ggagctgatc gtggacgatg ccagcgatgt gacctctttc 600

tacccatccg cttttcagga gcatctgaac ttcatcccag ctccaaccac aggcagcgga 660

tgcacaagaa tcccctcctt cgacatgtct gctacccact actgctatac acataatgtg 720

atcctgagcg gctgtcggga tcacagccat tcttaccagt atctggccct gggcgtgctg 780

agaacctctg ctacaggccg cgtgttcttt tccaccctga ggagcatcaa cctggacgat 840

acacagaatc ggaagtcctg tagcgtgtct gctacccctc tgggctgcga catgctgtgc 900

tccaaggtga ccgagacaga ggaggaggat tacaactctg ccgtgccaac caggatggtg 960

cacggccggc tgggattcga cggacagtat catgagaagg acctggatgt gaccacactg 1020

tttggcgact gggtggccaa ttacccagga gtgggaggag gctctttcat cgattcccgc 1080

gtgtggttta gcgtgtatgg cggcctgaag ccaaactccc ccagcgacac cgtgcaggag 1140

ggcaagtacg tgatctataa gaggtacaat gatacatgcc ccgacgagca ggattatcag 1200

atccggatgg ctaagtccag ctacaagcct ggcagattcg gcggcaagcg catccagcag 1260

gccatcctgt ctatcaaggt gtctacctcc ctgggagagg accccgtgct gacagtgccc 1320

cctaacaccg tgacactgat gggcgctgag ggcagaatcc tgaccgtggg cacatcccac 1380

ttcctgtatc agcgcggctc ttcctacttt agcccagccc tgctgtatcc catgaccgtg 1440

tctaacaaga ccgctacact gcattcccct tacaccttca atgcctttac aagaccaggc 1500

tccatccctt gtcaggcctc cgccaggtgc cctaacccat gcgtgaccgg cgtggaatat 1560

gcgcagctgt atagctttgc ggaatatgcg cagctgtata gctttgcgct ggaaaagaaa 1620

ataaggagcc ttgatctatc tgtcgggctc agtgatgtgc tcgggccttc cgtgttggta 1680

aaagcaagag gtgcacggac taagcttttg gcacctttct tctctagcag tgggacagcc 1740

tgctatccca tagcaaatgc ttctcctcag gtggccaaga tactctggag tcaaaccgcg 1800

tgcctgcgga gcgttaaaat cattatccaa gcaggtaccc aacgcgctgt cgcagtgacc 1860

gccgaccacg aggttacctc tactaagctg gagaaggggc acacccttgc caaatacaat 1920

ccttttaaga aacatcatca ccaccaccat tgatga 1956

<210> 2

<211> 650

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly His His His His His His His Asp Arg Ala Val Ser

20 25 30

Gln Val Ala Leu Glu Asn Asp Glu Arg Glu Ala Lys Asn Thr Trp Arg

35 40 45

Leu Ile Phe Arg Ile Ala Ile Leu Phe Leu Thr Val Val Thr Leu Ala

50 55 60

Ile Ser Val Ala Ser Leu Leu Tyr Ser Met Gly Ala Ser Thr Pro Ser

65 70 75 80

Asp Leu Val Gly Ile Pro Thr Arg Ile Ser Arg Ala Glu Glu Lys Ile

85 90 95

Thr Ser Thr Leu Gly Ser Asn Gln Asp Val Val Asp Arg Ile Tyr Lys

100 105 110

Gln Val Ala Leu Glu Ser Pro Leu Ala Leu Leu Lys Thr Glu Thr Thr

115 120 125

Ile Met Asn Ala Ile Thr Ser Leu Ser Tyr Gln Ile Asn Gly Ala Ala

130 135 140

Asn Asn Ser Gly Trp Gly Ala Pro Ile His Asp Pro Asp Tyr Ile Gly

145 150 155 160

Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp Asp Ala Ser Asp Val Thr Ser

165 170 175

Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Gly Gly Ile Gly Lys Glu Leu Ile Val Asp

180 185 190

Asp Ala Ser Asp Val Thr Ser Phe Tyr Pro Ser Ala Phe Gln Glu His

195 200 205

Leu Asn Phe Ile Pro Ala Pro Thr Thr Gly Ser Gly Cys Thr Arg Ile

210 215 220

Pro Ser Phe Asp Met Ser Ala Thr His Tyr Cys Tyr Thr His Asn Val

225 230 235 240

Ile Leu Ser Gly Cys Arg Asp His Ser His Ser Tyr Gln Tyr Leu Ala

245 250 255

Leu Gly Val Leu Arg Thr Ser Ala Thr Gly Arg Val Phe Phe Ser Thr

260 265 270

Leu Arg Ser Ile Asn Leu Asp Asp Thr Gln Asn Arg Lys Ser Cys Ser

275 280 285

Val Ser Ala Thr Pro Leu Gly Cys Asp Met Leu Cys Ser Lys Val Thr

290 295 300

Glu Thr Glu Glu Glu Asp Tyr Asn Ser Ala Val Pro Thr Arg Met Val

305 310 315 320

His Gly Arg Leu Gly Phe Asp Gly Gln Tyr His Glu Lys Asp Leu Asp

325 330 335

Val Thr Thr Leu Phe Gly Asp Trp Val Ala Asn Tyr Pro Gly Val Gly

340 345 350

Gly Gly Ser Phe Ile Asp Ser Arg Val Trp Phe Ser Val Tyr Gly Gly

355 360 365

Leu Lys Pro Asn Ser Pro Ser Asp Thr Val Gln Glu Gly Lys Tyr Val

370 375 380

Ile Tyr Lys Arg Tyr Asn Asp Thr Cys Pro Asp Glu Gln Asp Tyr Gln

385 390 395 400

Ile Arg Met Ala Lys Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Arg Phe Gly Gly Lys

405 410 415

Arg Ile Gln Gln Ala Ile Leu Ser Ile Lys Val Ser Thr Ser Leu Gly

420 425 430

Glu Asp Pro Val Leu Thr Val Pro Pro Asn Thr Val Thr Leu Met Gly

435 440 445

Ala Glu Gly Arg Ile Leu Thr Val Gly Thr Ser His Phe Leu Tyr Gln

450 455 460

Arg Gly Ser Ser Tyr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Tyr Pro Met Thr Val

465 470 475 480

Ser Asn Lys Thr Ala Thr Leu His Ser Pro Tyr Thr Phe Asn Ala Phe

485 490 495

Thr Arg Pro Gly Ser Ile Pro Cys Gln Ala Ser Ala Arg Cys Pro Asn

500 505 510

Pro Cys Val Thr Gly Val Glu Tyr Ala Gln Leu Tyr Ser Phe Ala Glu

515 520 525

Tyr Ala Gln Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Glu Lys Lys Ile Arg Ser Leu

530 535 540

Asp Leu Ser Val Gly Leu Ser Asp Val Leu Gly Pro Ser Val Leu Val

545 550 555 560

Lys Ala Arg Gly Ala Arg Thr Lys Leu Leu Ala Pro Phe Phe Ser Ser

565 570 575

Ser Gly Thr Ala Cys Tyr Pro Ile Ala Asn Ala Ser Pro Gln Val Ala

580 585 590

Lys Ile Leu Trp Ser Gln Thr Ala Cys Leu Arg Ser Val Lys Ile Ile

595 600 605

Ile Gln Ala Gly Thr Gln Arg Ala Val Ala Val Thr Ala Asp His Glu

610 615 620

Val Thr Ser Thr Lys Leu Glu Lys Gly His Thr Leu Ala Lys Tyr Asn

625 630 635 640

Pro Phe Lys Lys His His His His His His

645 650

<210> 3

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

atggaaacag atacactcct cctctgggtg ctgctcctct gggtgccagg atctacagga 60

caccatcatc accaccatca ctcgcgaatc gacggcaggc cactggccgc tgccggaatc 120

gtggtgaccg gcgataaggc cgtgaacatc tacacctcca gccagacagg cagcatcatc 180

gtgaagctgc tgccaaatct gcccaaggac aaggaggctt gcgccaaggc tccactggat 240

gcttataacc ggaccctgac cacactgctg acacccctgg gcgactctat caggagaatc 300

caggagtccg tgaccacaag cggaggcggc agacagggcc gcctgatcgg cgccatcatc 360

ggaggagtgg ccctgggagt ggctaccgct gctcagatca cagctgccgc tgccctgatc 420

caggccaagc agaacgctgc caatatcctg aggctgaagg agtctatcgc tgccaccaac 480

gaggctcccc cagaggtgac agatggactg tcccagctgg ctgtggctgt gggcaagatg 540

cagcagttcg tgaacgacca gtttaataag accgcccagg agctggattg tatcaagatc 600

gctcagcaag tgggcgtgga gctgaatctg tacctgaccg agctgaccac agtgttcggc 660

ccccagatca cctcccctgc cctgaacaag ctgacaatcc aggccctgta caacctggct 720

ggcggcaata tggactatct gctgaccaag ctgggcatcg gcaacaatca gctgtcttcc 780

ctgatcggct ccggcctgat cacaggcaat cctatcctgt acgatagcca gacccagctg 840

ctgggcatcc aggtgacact gccatccgtg ggcaacctga acaatatgag ggctacctat 900

ctggagacac tgagcgtgtc taccacacgg ggcttcgcct ccgccctggt gcccaaggtg 960

gtgacccaag tgggctctgt gatggaggag ctggacacct cctactgcat cgagacagac 1020

ctggatctgt attgtaccag aatcgtgaca tttcctatgt ctccaggcat ctatagctgc 1080

ctgtctggca ataccagcgc ctgtatgtac tctaagacag agggcgctct gaccacacct 1140

tatatgacca tcaagggctc cgtgatcgcc aacgaatatg cgcagctgta tagctttgcg 1200

gaatatgcgc agctgtatag ctttgcgctg gaaaagaaaa taaggagcct tgatctatct 1260

gtcgggctca gtgatgtgct cgggccttcc gtgttggtaa aagcaagagg tgcacggact 1320

aagcttttgg cacctttctt ctctagcagt gggacagcct gctatcccat agcaaatgct 1380

tctcctcagg tggccaagat actctggagt caaaccgcgt gcctgcggag cgttaaaatc 1440

attatccaag caggtaccca acgcgctgtc gcagtgaccg ccgaccacga ggttacctct 1500

actaagctgg agaaggggca cacccttgcc aaatacaatc cttttaagaa acatcaccac 1560

catcaccact gatga 1575

<210> 4

<211> 523

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly His His His His His His His Ser Arg Ile Asp Gly

20 25 30

Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys Ala Val

35 40 45

Asn Ile Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys Leu Leu

50 55 60

Pro Asn Leu Pro Lys Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro Leu Asp

65 70 75 80

Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly Asp Ser

85 90 95

Ile Arg Arg Ile Gln Glu Ser Val Thr Thr Ser Gly Gly Gly Arg Gln

100 105 110

Gly Arg Leu Ile Gly Ala Ile Ile Gly Gly Val Ala Leu Gly Val Ala

115 120 125

Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala Lys Gln

130 135 140

Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala Thr Asn

145 150 155 160

Glu Ala Pro Pro Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ala Val Ala

165 170 175

Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Phe Asn Lys Thr Ala

180 185 190

Gln Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Ala Gln Gln Val Gly Val Glu Leu

195 200 205

Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln Ile Thr

210 215 220

Ser Pro Ala Leu Asn Lys Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn Leu Ala

225 230 235 240

Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Ile Gly Asn Asn

245 250 255

Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Asn Pro Ile

260 265 270

Leu Tyr Asp Ser Gln Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Thr Leu Pro

275 280 285

Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu Thr Leu

290 295 300

Ser Val Ser Thr Thr Arg Gly Phe Ala Ser Ala Leu Val Pro Lys Val

305 310 315 320

Val Thr Gln Val Gly Ser Val Met Glu Glu Leu Asp Thr Ser Tyr Cys

325 330 335

Ile Glu Thr Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr Phe Pro

340 345 350

Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser Ala Cys

355 360 365

Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met Thr Ile

370 375 380

Lys Gly Ser Val Ile Ala Asn Glu Tyr Ala Gln Leu Tyr Ser Phe Ala

385 390 395 400

Glu Tyr Ala Gln Leu Tyr Ser Phe Ala Leu Glu Lys Lys Ile Arg Ser

405 410 415

Leu Asp Leu Ser Val Gly Leu Ser Asp Val Leu Gly Pro Ser Val Leu

420 425 430

Val Lys Ala Arg Gly Ala Arg Thr Lys Leu Leu Ala Pro Phe Phe Ser

435 440 445

Ser Ser Gly Thr Ala Cys Tyr Pro Ile Ala Asn Ala Ser Pro Gln Val

450 455 460

Ala Lys Ile Leu Trp Ser Gln Thr Ala Cys Leu Arg Ser Val Lys Ile

465 470 475 480

Ile Ile Gln Ala Gly Thr Gln Arg Ala Val Ala Val Thr Ala Asp His

485 490 495

Glu Val Thr Ser Thr Lys Leu Glu Lys Gly His Thr Leu Ala Lys Tyr

500 505 510

Asn Pro Phe Lys Lys His His His His His His

515 520

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

atactcgagg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct g 41

<210> 6

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

ataggtacct catcaatggt ggtggtgatg atgtttctta aaag 44

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

atactcgagg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct 40

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

ataggtacct catcagtggt gatggtggtg atgtttctta aaag 44

<210> 9

<211> 1854

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 9

aagcttgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

ccaggatcta caggacacca tcatcaccac catcatgaca gggccgtgtc ccaggtggct 120

ctggagaacg atgagcggga ggctaagaat acctggagac tgatcttccg catcgccatc 180

ctgtttctga ccgtggtgac actggccatc agcgtggctt ctctgctgta ttctatggga 240

gcttccaccc ctagcgacct ggtgggcatc ccaacaagaa tctcccgcgc cgaggagaag 300

atcacctcta cactgggctc caaccaggac gtggtggata gaatctacaa gcaggtggcc 360

ctggagtctc ctctggctct gctgaagacc gagaccacaa tcatgaacgc tatcacatct 420

ctgtcctacc agatcaatgg agctgctaac aattccggat ggggagctcc tatccacgac 480

ccagattata tcggcggcat cggcaaggag ctgatcgtgg acgatgccag cgatgtgacc 540

tctttctacc catccgcttt tcaggagcat ctgaacttca tcccagctcc aaccacaggc 600

agcggatgca caagaatccc ctccttcgac atgtctgcta cccactactg ctatacacat 660

aatgtgatcc tgagcggctg tcgggatcac agccattctt accagtatct ggccctgggc 720

gtgctgagaa cctctgctac aggccgcgtg ttcttttcca ccctgaggag catcaacctg 780

gacgatacac agaatcggaa gtcctgtagc gtgtctgcta cccctctggg ctgcgacatg 840

ctgtgctcca aggtgaccga gacagaggag gaggattaca actctgccgt gccaaccagg 900

atggtgcacg gccggctggg attcgacgga cagtatcatg agaaggacct ggatgtgacc 960

acactgtttg gcgactgggt ggccaattac ccaggagtgg gaggaggctc tttcatcgat 1020

tcccgcgtgt ggtttagcgt gtatggcggc ctgaagccaa actcccccag cgacaccgtg 1080

caggagggca agtacgtgat ctataagagg tacaatgata catgccccga cgagcaggat 1140

tatcagatcc ggatggctaa gtccagctac aagcctggca gattcggcgg caagcgcatc 1200

cagcaggcca tcctgtctat caaggtgtct acctccctgg gagaggaccc cgtgctgaca 1260

gtgcccccta acaccgtgac actgatgggc gctgagggca gaatcctgac cgtgggcaca 1320

tcccacttcc tgtatcagcg cggctcttcc tactttagcc cagccctgct gtatcccatg 1380

accgtgtcta acaagaccgc tacactgcat tccccttaca ccttcaatgc ctttacaaga 1440

ccaggctcca tcccttgtca ggcctccgcc aggtgcccta acccatgcgt gaccggcgtg 1500

tatacagatc cctaccctct gatcttctac aggaatcaca ccctgcgggg cgtgtttggc 1560

acaatgctgg acggcgtgca ggccagactg aatccagcct ccgccgtgtt cgatagcacc 1620

tctaggtccc ggatcacacg cgtgagctct tccagcacca aggccgctta taccacaagc 1680

acatgcttta aggtggtgaa gaccaacaag acatactgtc tgagcatcgc tgagatctct 1740

aataccctgt tcggcgagtt tagaatcgtg cccctgctgg tggagatcct gaaggacgat 1800

ggcgtgaggg aggcccggtc tggccatcat caccaccacc attgatgaga attc 1854

<210> 10

<211> 1542

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 10

aagcttgccg ccaccatgga aacagataca ctcctcctct gggtgctgct cctctgggtg 60

ccaggatcta caggacacca tcatcaccac catcactcgc gaatcgacgg caggccactg 120

gccgctgccg gaatcgtggt gaccggcgat aaggccgtga acatctacac ctccagccag 180

acaggcagca tcatcgtgaa gctgctgcca aatctgccca aggacaagga ggcttgcgcc 240

aaggctccac tggatgctta taaccggacc ctgaccacac tgctgacacc cctgggcgac 300

tctatcagga gaatccagga gtccgtgacc acaagcggag gcggcagaca gggccgcctg 360

atcggcgcca tcatcggagg agtggccctg ggagtggcta ccgctgctca gatcacagct 420

gccgctgccc tgatccaggc caagcagaac gctgccaata tcctgaggct gaaggagtct 480

atcgctgcca ccaacgaggc tgtgcacgag gtgacagatg gactgtccca gctggctgtg 540

gctgtgggca agatgcagca gttcgtgaac gaccagttta ataagaccgc ccaggagctg 600

gattgtatca agatcgctca gcaagtgggc gtggagctga atctgtacct gaccgagctg 660

accacagtgt tcggccccca gatcacctcc cctgccctga acaagctgac aatccaggcc 720

ctgtacaacc tggctggcgg caatatggac tatctgctga ccaagctggg catcggcaac 780

aatcagctgt cttccctgat cggctccggc ctgatcacag gcaatcctat cctgtacgat 840

agccagaccc agctgctggg catccaggtg acactgccat ccgtgggcaa cctgaacaat 900

atgagggcta cctatctgga gacactgagc gtgtctacca cacggggctt cgcctccgcc 960

ctggtgccca aggtggtgac ccaagtgggc tctgtgatgg aggagctgga cacctcctac 1020

tgcatcgaga cagacctgga tctgtattgt accagaatcg tgacatttcc tatgtctcca 1080

ggcatctata gctgcctgtc tggcaatacc agcgcctgta tgtactctaa gacagagggc 1140

gctctgacca caccttatat gaccatcaag ggctccgtga tcgccaactg caagatgacc 1200

acatgcagat gcgtgaaccc ccctggcatc atcagccaga attacggcga ggccgtgtcc 1260

ctgatcgaca agcagtcctg taatgtgctg agcctgggag gaatcaccct gaggctgagc 1320

ggcgagtttg atgtgacata tcagaagaac atctctatcc aggactccca ggtcatcatc 1380

accggcaacc tggatatcag cacagagctg ggcaatgtga acaattccat cagcaacgcc 1440

ctgaataagc tggaggagtc taaccgcaag ctggataaag tgaatgtgaa gctgacctct 1500

acatccttcg aacatcacca ccatcaccac tgatgagaat tc 1542

<210> 11

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 11

gaatatgcgc agctgtatag ctttgcggaa tatgcgcagc tgtatagctt tgcg 54

<210> 12

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 12

gattatatcg gcggcatcgg caaggagctg atcgtggacg atgccagcga tgtgacctct 60

ttctaccca 69

<210> 13

<211> 324

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 13

ctggaaaaga aaataaggag ccttgatcta tctgtcgggc tcagtgatgt gctcgggcct 60

tccgtgttgg taaaagcaag aggtgcacgg actaagcttt tggcaccttt cttctctagc 120

agtgggacag cctgctatcc catagcaaat gcttctcctc aggtggccaa gatactctgg 180

agtcaaaccg cgtgcctgcg gagcgttaaa atcattatcc aagcaggtac ccaacgcgct 240

gtcgcagtga ccgccgacca cgaggttacc tctactaagc tggagaaggg gcacaccctt 300

gccaaataca atccttttaa gaaa 324

<210> 14

<211> 1887

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 14

atggaaacag atacactcct cctctgggtg ctgctcctct gggtgccagg atctacagga 60

caccatcatc accaccatca tgacagggcc gtgtcccagg tggctctgga gaacgatgag 120

cgggaggcta agaatacctg gagactgatc ttccgcatcg ccatcctgtt tctgaccgtg 180

gtgacactgg ccatcagcgt ggcttctctg ctgtattcta tgggagcttc cacccctagc 240

gacctggtgg gcatcccaac aagaatctcc cgcgccgagg agaagatcac ctctacactg 300

ggctccaacc aggacgtggt ggatagaatc tacaagcagg tggccctgga gtctcctctg 360

gctctgctga agaccgagac cacaatcatg aacgctatca catctctgtc ctaccagatc 420

aatggagctg ctaacaattc cggatgggga gctcctatcc acgacccaga ttatatcggc 480

ggcatcggca aggagctgat cgtggacgat gccagcgatg tgacctcttt ctacccatcc 540

gcttttcagg agcatctgaa cttcatccca gctccaacca caggcagcgg atgcacaaga 600

atcccctcct tcgacatgtc tgctacccac tactgctata cacataatgt gatcctgagc 660

ggctgtcggg atcacagcca ttcttaccag tatctggccc tgggcgtgct gagaacctct 720

gctacaggcc gcgtgttctt ttccaccctg aggagcatca acctggacga tacacagaat 780

cggaagtcct gtagcgtgtc tgctacccct ctgggctgcg acatgctgtg ctccaaggtg 840

accgagacag aggaggagga ttacaactct gccgtgccaa ccaggatggt gcacggccgg 900

ctgggattcg acggacagta tcatgagaag gacctggatg tgaccacact gtttggcgac 960

tgggtggcca attacccagg agtgggagga ggctctttca tcgattcccg cgtgtggttt 1020

agcgtgtatg gcggcctgaa gccaaactcc cccagcgaca ccgtgcagga gggcaagtac 1080

gtgatctata agaggtacaa tgatacatgc cccgacgagc aggattatca gatccggatg 1140

gctaagtcca gctacaagcc tggcagattc ggcggcaagc gcatccagca ggccatcctg 1200

tctatcaagg tgtctacctc cctgggagag gaccccgtgc tgacagtgcc ccctaacacc 1260

gtgacactga tgggcgctga gggcagaatc ctgaccgtgg gcacatccca cttcctgtat 1320

cagcgcggct cttcctactt tagcccagcc ctgctgtatc ccatgaccgt gtctaacaag 1380

accgctacac tgcattcccc ttacaccttc aatgccttta caagaccagg ctccatccct 1440

tgtcaggcct ccgccaggtg ccctaaccca tgcgtgaccg gcgtggaata tgcgcagctg 1500

tatagctttg cggaatatgc gcagctgtat agctttgcgc tggaaaagaa aataaggagc 1560

cttgatctat ctgtcgggct cagtgatgtg ctcgggcctt ccgtgttggt aaaagcaaga 1620

ggtgcacgga ctaagctttt ggcacctttc ttctctagca gtgggacagc ctgctatccc 1680

atagcaaatg cttctcctca ggtggccaag atactctgga gtcaaaccgc gtgcctgcgg 1740

agcgttaaaa tcattatcca agcaggtacc caacgcgctg tcgcagtgac cgccgaccac 1800

gaggttacct ctactaagct ggagaagggg cacacccttg ccaaatacaa tccttttaag 1860

aaacatcatc accaccacca ttgatga 1887

<210> 15

<211> 1902

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 15

atggaaacag atacactcct cctctgggtg ctgctcctct gggtgccagg atctacagga 60

caccatcatc accaccatca tgacagggcc gtgtcccagg tggctctgga gaacgatgag 120

cgggaggcta agaatacctg gagactgatc ttccgcatcg ccatcctgtt tctgaccgtg 180

gtgacactgg ccatcagcgt ggcttctctg ctgtattcta tgggagcttc cacccctagc 240

gacctggtgg gcatcccaac aagaatctcc cgcgccgagg agaagatcac ctctacactg 300

ggctccaacc aggacgtggt ggatagaatc tacaagcagg tggccctgga gtctcctctg 360

gctctgctga agaccgagac cacaatcatg aacgctatca catctctgtc ctaccagatc 420

aatggagctg ctaacaattc cggatgggga gctcctatcc acgacccaga ttatatcggc 480

ggcatcggca aggagctgat cgtggacgat gccagcgatg tgacctcttt ctacccagat 540

tatatcggcg gcatcggcaa ggagctgatc gtggacgatg ccagcgatgt gacctctttc 600

tacccatccg cttttcagga gcatctgaac ttcatcccag ctccaaccac aggcagcgga 660

tgcacaagaa tcccctcctt cgacatgtct gctacccact actgctatac acataatgtg 720

atcctgagcg gctgtcggga tcacagccat tcttaccagt atctggccct gggcgtgctg 780

agaacctctg ctacaggccg cgtgttcttt tccaccctga ggagcatcaa cctggacgat 840

acacagaatc ggaagtcctg tagcgtgtct gctacccctc tgggctgcga catgctgtgc 900

tccaaggtga ccgagacaga ggaggaggat tacaactctg ccgtgccaac caggatggtg 960

cacggccggc tgggattcga cggacagtat catgagaagg acctggatgt gaccacactg 1020

tttggcgact gggtggccaa ttacccagga gtgggaggag gctctttcat cgattcccgc 1080

gtgtggttta gcgtgtatgg cggcctgaag ccaaactccc ccagcgacac cgtgcaggag 1140

ggcaagtacg tgatctataa gaggtacaat gatacatgcc ccgacgagca ggattatcag 1200

atccggatgg ctaagtccag ctacaagcct ggcagattcg gcggcaagcg catccagcag 1260

gccatcctgt ctatcaaggt gtctacctcc ctgggagagg accccgtgct gacagtgccc 1320

cctaacaccg tgacactgat gggcgctgag ggcagaatcc tgaccgtggg cacatcccac 1380

ttcctgtatc agcgcggctc ttcctacttt agcccagccc tgctgtatcc catgaccgtg 1440

tctaacaaga ccgctacact gcattcccct tacaccttca atgcctttac aagaccaggc 1500

tccatccctt gtcaggcctc cgccaggtgc cctaacccat gcgtgaccgg cgtgctggaa 1560

aagaaaataa ggagccttga tctatctgtc gggctcagtg atgtgctcgg gccttccgtg 1620

ttggtaaaag caagaggtgc acggactaag cttttggcac ctttcttctc tagcagtggg 1680

acagcctgct atcccatagc aaatgcttct cctcaggtgg ccaagatact ctggagtcaa 1740

accgcgtgcc tgcggagcgt taaaatcatt atccaagcag gtacccaacg cgctgtcgca 1800

gtgaccgccg accacgaggt tacctctact aagctggaga aggggcacac ccttgccaaa 1860

tacaatcctt ttaagaaaca tcatcaccac caccattgat ga 1902

<210> 16

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 16

atggaaacag atacactcct cctctgggtg ctgctcctct gggtgccagg atctacagga 60

caccatcatc accaccatca tgacagggcc gtgtcccagg tggctctgga gaacgatgag 120

cgggaggcta agaatacctg gagactgatc ttccgcatcg ccatcctgtt tctgaccgtg 180

gtgacactgg ccatcagcgt ggcttctctg ctgtattcta tgggagcttc cacccctagc 240

gacctggtgg gcatcccaac aagaatctcc cgcgccgagg agaagatcac ctctacactg 300

ggctccaacc aggacgtggt ggatagaatc tacaagcagg tggccctgga gtctcctctg 360

gctctgctga agaccgagac cacaatcatg aacgctatca catctctgtc ctaccagatc 420

aatggagctg ctaacaattc cggatgggga gctcctatcc acgacccaga ttatatcggc 480

ggcatcggca aggagctgat cgtggacgat gccagcgatg tgacctcttt ctacccagat 540

tatatcggcg gcatcggcaa ggagctgatc gtggacgatg ccagcgatgt gacctctttc 600

tacccatccg cttttcagga gcatctgaac ttcatcccag ctccaaccac aggcagcgga 660

tgcacaagaa tcccctcctt cgacatgtct gctacccact actgctatac acataatgtg 720

atcctgagcg gctgtcggga tcacagccat tcttaccagt atctggccct gggcgtgctg 780

agaacctctg ctacaggccg cgtgttcttt tccaccctga ggagcatcaa cctggacgat 840

acacagaatc ggaagtcctg tagcgtgtct gctacccctc tgggctgcga catgctgtgc 900

tccaaggtga ccgagacaga ggaggaggat tacaactctg ccgtgccaac caggatggtg 960

cacggccggc tgggattcga cggacagtat catgagaagg acctggatgt gaccacactg 1020

tttggcgact gggtggccaa ttacccagga gtgggaggag gctctttcat cgattcccgc 1080

gtgtggttta gcgtgtatgg cggcctgaag ccaaactccc ccagcgacac cgtgcaggag 1140

ggcaagtacg tgatctataa gaggtacaat gatacatgcc ccgacgagca ggattatcag 1200

atccggatgg ctaagtccag ctacaagcct ggcagattcg gcggcaagcg catccagcag 1260

gccatcctgt ctatcaaggt gtctacctcc ctgggagagg accccgtgct gacagtgccc 1320

cctaacaccg tgacactgat gggcgctgag ggcagaatcc tgaccgtggg cacatcccac 1380

ttcctgtatc agcgcggctc ttcctacttt agcccagccc tgctgtatcc catgaccgtg 1440

tctaacaaga ccgctacact gcattcccct tacaccttca atgcctttac aagaccaggc 1500

tccatccctt gtcaggcctc cgccaggtgc cctaacccat gcgtgaccgg cgtggaatat 1560

gcgcagctgt atagctttgc ggaatatgcg cagctgtata gctttgcgca tcatcaccac 1620

caccattgat ga 1632

<210> 17

<211> 1575

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 17

atggaaacag atacactcct cctctgggtg ctgctcctct gggtgccagg atctacagga 60

caccatcatc accaccatca ctcgcgaatc gacggcaggc cactggccgc tgccggaatc 120

gtggtgaccg gcgataaggc cgtgaacatc tacacctcca gccagacagg cagcatcatc 180

gtgaagctgc tgccaaatct gcccaaggac aaggaggctt gcgccaaggc tccactggat 240

gcttataacc ggaccctgac cacactgctg acacccctgg gcgactctat caggagaatc 300

caggagtccg tgaccacaag cggaggcggc agacagggcc gcctgatcgg cgccatcatc 360

ggaggagtgg ccctgggagt ggctaccgct gctcagatca cagctgccgc tgccctgatc 420

caggccaagc agaacgctgc caatatcctg aggctgaagg agtctatcgc tgccaccaac 480

gaggctgttc atgaggtgac agatggactg tcccagctgg ctgtggctgt gggcaagatg 540

cagcagttcg tgaacgacca gtttaataag accgcccagg agctggattg tatcaagatc 600

gctcagcaag tgggcgtgga gctgaatctg tacctgaccg agctgaccac agtgttcggc 660

ccccagatca cctcccctgc cctgaacaag ctgacaatcc aggccctgta caacctggct 720

ggcggcaata tggactatct gctgaccaag ctgggcatcg gcaacaatca gctgtcttcc 780

ctgatcggct ccggcctgat cacaggcaat cctatcctgt acgatagcca gacccagctg 840

ctgggcatcc aggtgacact gccatccgtg ggcaacctga acaatatgag ggctacctat 900

ctggagacac tgagcgtgtc taccacacgg ggcttcgcct ccgccctggt gcccaaggtg 960

gtgacccaag tgggctctgt gatggaggag ctggacacct cctactgcat cgagacagac 1020

ctggatctgt attgtaccag aatcgtgaca tttcctatgt ctccaggcat ctatagctgc 1080

ctgtctggca ataccagcgc ctgtatgtac tctaagacag agggcgctct gaccacacct 1140

tatatgacca tcaagggctc cgtgatcgcc aacgaatatg cgcagctgta tagctttgcg 1200

gaatatgcgc agctgtatag ctttgcgctg gaaaagaaaa taaggagcct tgatctatct 1260

gtcgggctca gtgatgtgct cgggccttcc gtgttggtaa aagcaagagg tgcacggact 1320

aagcttttgg cacctttctt ctctagcagt gggacagcct gctatcccat agcaaatgct 1380

tctcctcagg tggccaagat actctggagt caaaccgcgt gcctgcggag cgttaaaatc 1440

attatccaag caggtaccca acgcgctgtc gcagtgaccg ccgaccacga ggttacctct 1500

actaagctgg agaaggggca cacccttgcc aaatacaatc cttttaagaa acatcaccac 1560

catcaccact gatga 1575

<210> 18

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 18

atggaaacag atacactcct cctctgggtg ctgctcctct gggtgccagg atctacagga 60

caccatcatc accaccatca ctcgcgaatc gacggcaggc cactggccgc tgccggaatc 120

gtggtgaccg gcgataaggc cgtgaacatc tacacctcca gccagacagg cagcatcatc 180

gtgaagctgc tgccaaatct gcccaaggac aaggaggctt gcgccaaggc tccactggat 240

gcttataacc ggaccctgac cacactgctg acacccctgg gcgactctat caggagaatc 300

caggagtccg tgaccacaag cggaggcggc agacagggcc gcctgatcgg cgccatcatc 360

ggaggagtgg ccctgggagt ggctaccgct gctcagatca cagctgccgc tgccctgatc 420

caggccaagc agaacgctgc caatatcctg aggctgaagg agtctatcgc tgccaccaac 480

gaggctcccc cagaggtgac agatggactg tcccagctgg ctgtggctgt gggcaagatg 540

cagcagttcg tgaacgacca gtttaataag accgcccagg agctggattg tatcaagatc 600

gctcagcaag tgggcgtgga gctgaatctg tacctgaccg agctgaccac agtgttcggc 660

ccccagatca cctcccctgc cctgaacaag ctgacaatcc aggccctgta caacctggct 720

ggcggcaata tggactatct gctgaccaag ctgggcatcg gcaacaatca gctgtcttcc 780

ctgatcggct ccggcctgat cacaggcaat cctatcctgt acgatagcca gacccagctg 840

ctgggcatcc aggtgacact gccatccgtg ggcaacctga acaatatgag ggctacctat 900

ctggagacac tgagcgtgtc taccacacgg ggcttcgcct ccgccctggt gcccaaggtg 960

gtgacccaag tgggctctgt gatggaggag ctggacacct cctactgcat cgagacagac 1020

ctggatctgt attgtaccag aatcgtgaca tttcctatgt ctccaggcat ctatagctgc 1080

ctgtctggca ataccagcgc ctgtatgtac tctaagacag agggcgctct gaccacacct 1140

tatatgacca tcaagggctc cgtgatcgcc aacctggaaa agaaaataag gagccttgat 1200

ctatctgtcg ggctcagtga tgtgctcggg ccttccgtgt tggtaaaagc aagaggtgca 1260

cggactaagc ttttggcacc tttcttctct agcagtggga cagcctgcta tcccatagca 1320

aatgcttctc ctcaggtggc caagatactc tggagtcaaa ccgcgtgcct gcggagcgtt 1380

aaaatcatta tccaagcagg tacccaacgc gctgtcgcag tgaccgccga ccacgaggtt 1440

acctctacta agctggagaa ggggcacacc cttgccaaat acaatccttt taagaaacat 1500

caccaccatc accactgatg a 1521

<210> 19

<211> 1251

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 19

atggaaacag atacactcct cctctgggtg ctgctcctct gggtgccagg atctacagga 60

caccatcatc accaccatca ctcgcgaatc gacggcaggc cactggccgc tgccggaatc 120

gtggtgaccg gcgataaggc cgtgaacatc tacacctcca gccagacagg cagcatcatc 180

gtgaagctgc tgccaaatct gcccaaggac aaggaggctt gcgccaaggc tccactggat 240

gcttataacc ggaccctgac cacactgctg acacccctgg gcgactctat caggagaatc 300

caggagtccg tgaccacaag cggaggcggc agacagggcc gcctgatcgg cgccatcatc 360

ggaggagtgg ccctgggagt ggctaccgct gctcagatca cagctgccgc tgccctgatc 420

caggccaagc agaacgctgc caatatcctg aggctgaagg agtctatcgc tgccaccaac 480

gaggctcccc cagaggtgac agatggactg tcccagctgg ctgtggctgt gggcaagatg 540

cagcagttcg tgaacgacca gtttaataag accgcccagg agctggattg tatcaagatc 600

gctcagcaag tgggcgtgga gctgaatctg tacctgaccg agctgaccac agtgttcggc 660

ccccagatca cctcccctgc cctgaacaag ctgacaatcc aggccctgta caacctggct 720

ggcggcaata tggactatct gctgaccaag ctgggcatcg gcaacaatca gctgtcttcc 780

ctgatcggct ccggcctgat cacaggcaat cctatcctgt acgatagcca gacccagctg 840

ctgggcatcc aggtgacact gccatccgtg ggcaacctga acaatatgag ggctacctat 900

ctggagacac tgagcgtgtc taccacacgg ggcttcgcct ccgccctggt gcccaaggtg 960

gtgacccaag tgggctctgt gatggaggag ctggacacct cctactgcat cgagacagac 1020

ctggatctgt attgtaccag aatcgtgaca tttcctatgt ctccaggcat ctatagctgc 1080

ctgtctggca ataccagcgc ctgtatgtac tctaagacag agggcgctct gaccacacct 1140

tatatgacca tcaagggctc cgtgatcgcc aacgaatatg cgcagctgta tagctttgcg 1200

gaatatgcgc agctgtatag ctttgcgcat caccaccatc accactgatg a 1251

Claims (14)

1.一种免疫组合物的制备方法，其特征在于包括：将优化的禽新城疫病毒的HN蛋白编码基因、F蛋白编码基因分别克隆到真核表达载体上，得到重组真核表达载体，之后将所述重组真核表达载体转染CHO细胞，再筛选获得能够悬浮稳定高效表达禽新城疫病毒重组HN蛋白、重组F蛋白的CHO细胞株且进行发酵培养，之后分离得到所述重组HN蛋白、重组F蛋白，其后将所述重组HN蛋白和/或重组F蛋白与佐剂充分混匀，即得所述免疫组合物；所述重组HN蛋白、重组F蛋白的编码基因序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3所示。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述重组HN蛋白、重组F蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4所示。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述真核表达载体包括pSV2-GS、pCI-GS或pcDNA4-GS。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述真核表达载体为pCI-GS。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述CHO细胞包括DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述CHO细胞为CHO-S。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述佐剂包括白油、硬脂酸铝、司本、吐温的任意一种或者两种以上的组合。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述佐剂为白油。

9.一种免疫组合物，其特征在于包括禽新城疫病毒重组HN蛋白和/或重组F蛋白，所述重组HN蛋白、重组F蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4所示。

10.如权利要求9所述的免疫组合物，其特征在于还包括药学上可接受的佐剂，所述佐剂包括白油、硬脂酸铝、司本、吐温的任意一种或者两种以上的组合。

11.如权利要求10所述的免疫组合物，其特征在于：所述佐剂为白油。

12.由权利要求1-8中任一项所述方法制备的免疫组合物或者权利要求9-11中任一项所述的免疫组合物用于生产用于在受试动物中诱导针对禽新城疫病毒抗原的免疫反应的药剂的用途。

13.由权利要求1-8中任一项所述方法制备的免疫组合物或者权利要求9-11中任一项所述的免疫组合物用于生产用于检测或预防动物受禽新城疫病毒感染的试剂中的用途。

14.由权利要求1-8中任一项所述方法制备的免疫组合物或者权利要求9-11中任一项所述的免疫组合物在制备禽新城疫病毒基因工程亚单位疫苗中的用途。

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