CN113336858B

CN113336858B - 单一位点嵌合巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原及其制备和应用

Info

Publication number: CN113336858B
Application number: CN202110552295.3A
Authority: CN
Inventors: 朱伟峰; 王芳; 胡波; 魏后军; 范志宇
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-05-20
Filing date: 2021-05-20
Publication date: 2024-02-23
Anticipated expiration: 2041-05-20
Also published as: CN113336858A

Abstract

本发明属于生物医学技术领域，提供了一种单一位点嵌合了巴氏杆菌抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原及其制备方法和应用，所述重组抗原通过将PlpE表位集中分布的一段区域（长180个氨基酸）嵌合展示到兔出血症病毒VP60蛋白N端而得到。免疫保护力实验表明该嵌合重组抗原对兔出血症病毒和巴氏杆菌均具有良好的免疫保护力。本发明仅耗费一份人工就可以制备出针对两种病原的抗原，简化了工艺，缩短了制备时间，显著降低了生产成本，从而为制备更低成本兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病二联疫苗提供了所需抗原。

Description

单一位点嵌合巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原及其制备和应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种嵌合了巴氏杆菌抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原及其制备方法和应用。

兔病毒性出血症，俗称兔瘟，是由兔出血症病毒( Rabbit hemorrhagic diseasevirus，RHDV) 引起的一种具有高度传染性、高发病率、高致死性的疾病。RHDV衣壳蛋白VP60由 579 个氨基酸组成，是病毒衣壳组成的最基本单位。衣壳蛋白 VP60 是病毒的免疫保护性抗原，与诱导机体抗感染免疫直接相关，单独表达VP60蛋白能够自聚成病毒样颗粒，由其制成的疫苗已经用于兔病毒性出血症的预防。

兔巴氏杆菌病（Pasteurellosis）是主要由多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）引起的一种危害养兔业的主要细菌性疫病。各种年龄、品种的家兔对于多杀性巴氏杆菌均易感，尤其2-6月龄的家兔易感染发病，该病是造成9周龄到6月龄家兔死亡的主要疫病之一。目前已经有PlpE等保护性抗原报道，动物实验显示出良好的免疫保护效力。

目前已经有兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病二联灭活疫苗用于同时防控兔病毒性出血症和兔巴氏杆菌病。但是该疫苗存在着生产成本偏高、对巴氏杆菌免疫保护效果并不理想等问题。传统兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病二联灭活疫苗的制备工艺是先分别制备兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌灭活疫苗，再进行物理混合制成联苗。这种二联苗的生产过程需要经历两个疫苗的生产过程，耗费两份人工及物料、水电等，增加了生产成本，并存在疫苗组分相互干扰的风险。虽然近年来有使用基因工程亚单位疫苗（以VP60和PlpE等为抗原）取代传统细菌或病毒灭活疫苗的趋势，但是目前基因工程二联亚单位疫苗的生产工艺依然需要经历分别制备单苗然后物理混合的过程，生产成本并未显著降低。因而将不同抗原及其表位嵌合连接在一起构成新抗原的方案正成为新的联苗发展方向，这将使二联疫苗生产过程简化，有效降低生产成本。

本发明的目的是将巴氏杆菌保护性抗原PlpE的表位嵌合展示到兔出血症病毒VP60上，从而获得一种新的兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病二联亚单位疫苗所需抗原。

发明内容

本发明所解决的技术问题是：通过构建嵌合有巴氏杆菌保护性抗原PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组蛋白抗原，获得一种只耗费一份人工就能够生产出对兔病毒性出血症和巴氏杆菌都具有免疫保护作用的重组蛋白抗原，从而应用于兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病二联疫苗制备

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供了一种嵌合了巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原，其特征在于，所述重组抗原包括兔出血症病毒VP60蛋白，其N端连接巴氏杆菌PlpE蛋白抗原表位多肽片段。

优选的，连接在兔出血症病毒VP60蛋白N端的巴氏杆菌PlpE蛋白抗原表位是PlpE蛋白抗原的第21位到第200位氨基酸的多肽片段。

优选的，所述VP60蛋白N端嵌入的PlpE抗原表位氨基酸序列为SEQ ID NO:1；其核苷酸序列为：SEQ ID NO:3。所述嵌合了巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。编码所述嵌合了巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

还提供了一种重组抗原的表达载体，用于表达嵌合了巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原，含有权利要求4所述核苷酸序列。

一种制备权利要求1所述嵌合了巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原制备方法，其步骤如下：

(1)通过PCR扩增巴氏杆菌PlpE的N端第21位到第200位氨基酸所对应的DNA序列;

(2)将步骤(1)得到PCR产物分别连接到VP60基因N端，并将重组基因连接到pFastBac1克隆位点上,得到重组穿梭质粒载体;

(3)将步骤(2)得到的重组穿梭载体转化到DH10Bac宿主菌中，通过该菌的转座作用获得重组杆状病毒质粒Bacmid-PlpE-VP60；

（4）将重组杆状病毒质粒转入sf9细胞后获得嵌合了巴氏杆菌PlpE表位的兔出血症病毒VP60重组蛋白抗原PlpE-VP60。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，尽管目前现有技术可以采用兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌二联灭活疫苗或二联基因工程亚单位疫苗来同时防控兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病，但是传统二联苗的制备工艺是先分别制备两种疫苗再进行物理混合，二联苗的生产过程需要经历两个疫苗的生产过程，耗费两份人工及物料、水电等，增加了生产成本，带来了疫苗组分相互干扰的风险。虽然理论上兔出血症病毒结构蛋白VP60的N端具有展示外源表位的能力，但既要尽可能多的展示外源表位（特别是亲缘关系比较远的细菌抗原表位），又要保证自身结构和中和表位不受影响则面临较大的困难（目前技术条件下VP60蛋白N端最长仅能展示40个氨基酸左右的外源动物病毒表位）。然而，本发明在分析巴氏杆菌保护性抗原PlpE表位组成的基础上，通过将PlpE表位集中分布的一段区域（长180个氨基酸）嵌合展示到兔出血症病毒VP60蛋白N端，意外发现该重组抗原仍然具有血凝活性（即能够形成病毒样颗粒，兔出血症病毒中和表位未受影响）。免疫保护力实验结果表明该重组抗原既对巴氏杆菌有免疫保护作用，又对兔出血症病毒具有免疫保护作用。

总之，本发明通过构建嵌合了巴氏杆菌保护性抗原PlpE表位的兔出血症病毒VP60重组蛋白，获得了对兔病毒性出血症和巴氏杆菌都具有免疫保护作用的重组抗原，为后期生产更低成本的兔病毒性出血症、兔巴氏杆菌病疫苗提供了基础。

附图说明

图1为PlpE的氨基酸残基构成B细胞表位能力预测结果;(使用在线软件Bepipred-2.0（http://tools.immuneepitope.org/bcell/），预测分值高于0.5构成B细胞表位的几率较大)。

图2为PlpE表位单一位点嵌合VP60重组抗原的重组穿梭质粒载体构建过程示意图；

图3为PlpE表位嵌合VP60重组蛋白PlpE-VP60的表达情况，其中M表示分子大小标识；VP60表示杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达的VP60蛋白；PlpE-VP60为杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达的PlpE-VP60重组蛋白；

图4 为本发明所述PlpE表位嵌合VP60重组蛋白PlpE-VP60的血凝特性。左图为PlpE-VP60对人O型红细胞的凝集；右图为对照，即野生型杆状病毒培养物对人O型红细胞的凝集；

图5为本发明所述PlpE表位嵌合VP60重组蛋白PlpE-VP60与PlpE高免血清的反应情况，其中M表示分子大小标识；PlpE-VP60为杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达的PlpE-VP60重组蛋白；VP60表示杆状病毒-昆虫细胞表达系统表达的VP60蛋白；

图6免疫保护力实验中兔出血症病毒攻毒（A）和巴氏杆菌攻毒（B）后家兔的存活情况。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：制备PlpE表位嵌合的VP60重组蛋白

(1)质粒、菌种及培养载体质粒pFastBac1、pFastBac1-VP60 由本实验室构建并保存; E．coli DH5α 感受态购买自南京诺唯赞生物技术有限公司; E．coli DH10 Bac 感受态购自上海唯地生物科技有限公司; 多杀性巴氏杆菌C51-17株由本实验室保存提供；sf9昆虫细胞由本实验室保存培养。

蛋白质氨基酸序列分析以Genbank公布的多杀性巴氏杆菌C51-17株的全基因组序列中的PlpE基因序列为参考序列进行分析。使用Bepipred-2.0（http://tools.immuneepitope.org/bcell/）确定PlpE的B细胞表位分布情况。

上述PlpE的B细胞表位预测结果如图1所示:PlpE一级结构共包含336个氨基酸残基。选择Bepipred-2.0软件默认的0.5作为氨基酸残基构成表位的阈值，预测结果表明PlpE的表位主要分布于N端（图1）。因此本发明选择了将N端21位到200位氨基酸序列（即本发明所述的SEQ ID NO :1.）连接到兔出血症病毒VP60的N端以获得表位嵌合VP60。

端基因的克隆提取巴氏杆菌C51-17菌株基因组，以引物PlpE-F：5’-aggcatgcggtaccaagcttATGTGTAGCGGTGGTGGCGGT-3’（小写字母表示同源臂，大写字母表示与目的基因相同的序列，下同）和PlpE-R：5’-gctttgccctcATCTTCTTGATGGTAAGTTGCAGTTAG-3’进行PCR扩增PlpE的第21位到第200位氨基酸所对应的DNA片段。使用引物VP60--F 5’-caagaagatGAGGGCAAAGCCCGCACA-3’和VP60R 5’-atcctctagtacttctcgacCTAGACATAAGAAAAGCCATTGGT-3’扩增pFastBac1-VP60质粒载体制备VP60基因片段。使用引物pFastBacF5’-GTCGAGAAGTACTAGAGGATCATAATCAGCC-3’和pFastBacR5’-AAGCTTGGTACCGCATGCC-3’PCR扩增pFastBac1质粒载体制备线性化pFastBac1线性化载体。按照同源重组克隆试剂盒（诺唯赞，南京）说明书中的操作将PlpE第21-200位氨基酸对应的基因片段连接到VP60基因的5’端，然后将阳性重组质粒转入DH5α宿主菌。挑取阳性克隆PCR鉴定正确后送北京擎科新业有限公司南京分部测序，鉴定所克隆基因是否完整及是否正确连接到载体上,测序结果显示目的基因片段已经正确连接到载体上。提取阳性克隆质粒，按照E． coli DH10Bac 感受态细胞说明书中的操作，将重组质粒转化到E． coli DH10Bac 感受态细胞中并通过蓝白斑筛选和 PCR 鉴定获得重组杆粒Bacmid-PlpE-VP60。所构建的重组质粒如图2所示。

转染、表达与鉴定将Bacmid-PlpE-VP60通过脂质体 Lipofectamin^TM3000 转染至对数生长期的sf9 昆虫细胞。转染后每24 h 观察 1 次，细胞病变明显时收集细胞及上清液，作为重组杆状病毒原液，4 ℃保存。将第 1 代病毒液反复冻融 3 次后以 1% 体积比接种sf9 细胞，进行传代，得到第 2 代重组病毒。重复上述操作获得3代毒后将重组杆状病毒接种到对数期的悬浮sf9细胞中进行转瓶培养，培养约100h后收集培养物。反复冻融培养物3次后获得PlpE-VP60重组蛋白，进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色后进行观察，样品中存在约77 kDa的条带（图3），符合VP60-PlpE理论预测大小。

的血凝试验在50孔U型板上两个孔内分别加入PlpE-VP60和野生型杆状病毒培养物，每孔 50 μL。然后每孔加入 50 μL 1%人 O 型红细胞悬液，4 ℃作用30 min 后，观察血凝情况。结果表明PlpE-VP60重组蛋白存在明显的血凝现象（图4），即认为PlpE-VP60重组蛋白仍然可以形成兔出血症病毒样颗粒，有效展现兔出血症病毒中和表位。

重组蛋白与PlpE高免血清的反应将PlpE-VP60重组蛋白和VP60重组蛋白（对照）进行SDS-PAGE凝胶电泳后将蛋白转印到NC膜上。经过5%的脱脂乳封闭后，加入本实验室保存的1/500稀释的小鼠抗PlpE血清，37℃孵育1 h；PBST漂洗5遍，加入1/10000稀释的HRP偶联的羊抗鼠IgG，37℃孵育1 h； PBST漂洗5遍，进行ECL显色。Western blot结果显示，PlpE-VP60泳道存在一条77KDa左右的条带（图5），但作为对照的VP60泳道则不存在符合预期大小的条带，这就表明PlpE-VP60重组蛋白能够与小鼠抗PlpE血清发生特异性反应，即PlpE部分免疫原性片段顺利整合到VP60上。

实施例2：免疫保护力实验

选取60只2-3月龄健康易感家兔，随机分成6组，2组对照，另4组实验，每组10只。两个实验组免疫PlpE-VP60重组蛋白组：200mg/ml重组蛋白中加入20%体积的铝胶佐剂后皮下注射免疫家兔，每只1ml；另两个实验组免疫VP60和PlpE重组蛋白的物理混合物（Mixture），其中包含VP60重组蛋白和PlpE重组蛋白各100mg/ml，加入20%体积的铝胶佐剂后免疫家兔。剩余两组作为阴性对照组：PBS代替重组蛋白，使用的佐剂与实验组的佐剂相同。免疫3周后使用兔出血症病毒皖阜株对PlpE-VP60嵌合抗原免疫组、物理混合Mixture组和一组对照组攻毒，100×LD50/只，连续7天观察家兔存活情况。免疫3周后使用巴氏杆菌C51-17株对PlpE-VP60嵌合抗原免疫组、物理混合mixture组和另一组对照组攻毒，100CFU（10×MLD）/只，连续7天观察家兔存活情况。兔出血症病毒攻毒后实验组家（免疫PlpE-VP60嵌合抗原重组蛋白组和免疫两种蛋白物理混合物组）兔存活率100%，对照组全部死亡（存活率0/10，图6A）。巴氏杆菌攻毒后实验组家兔存活率100%，而对照组全部死亡（存活率0/10，图6B）。这些实验结果表明VP60-PlpE重组蛋白的免疫能使家兔同时对兔出血症病毒和巴氏杆菌的攻毒产生免疫保护作用，且PlpE-Vp60重组蛋白具有与两种蛋白物理混合物相同的保护力。

实施例 3 工艺及耗时比较

本发明所提供的嵌合抗原与两种蛋白混合物疫苗虽然具有相似的免疫保护效果，但是制备工艺差别明显。如表1所示，嵌合抗原制备过程不需要经历纯化抗原、内毒素去除、物理混合等步骤，制备时间缩短了50%，也不存在相应步骤的物料、水电消耗，生产成本显著降低，具有很好的应用前景。

表1制备工艺比较

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 江苏农业科学院

<120> 单一位点嵌合巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原及其制备和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 200

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Asn Arg Ala Asp Arg Val Glu

1 5 10 15

Glu Lys Ala Gln Pro Val Gln Ser Asn Ser Glu Pro Ser Ser Thr Pro

20 25 30

Ile Lys His Pro Met Thr Asn Ser Ala Thr Asn Thr Ser Leu His Asp

35 40 45

Lys Leu Ser Met Ser Ser His Asp Thr Ser Lys Glu Asn Ser Gln Gln

50 55 60

Ser Ser Phe Gln Ala Pro Leu Glu Gln Glu Lys Asn Gln Pro Ala Gln

65 70 75 80

Glu Asn Leu Thr Trp Thr Gly Tyr His Val Ser Glu Trp Gly Asn Ala

85 90 95

Ser Asn Asn Val Asp Lys Asp Asn Val Thr Val Phe Thr Phe Val Lys

100 105 110

Tyr Asn Ser Gln Tyr Asn Asp Asp Pro Val Phe Asp Lys Thr Lys Thr

115 120 125

Gln Ser Lys Thr Ile Ser Leu Val Asp Gly Lys Asn Glu Asn Lys Glu

130 135 140

His Tyr Tyr His Phe Thr Leu Lys Asp Asp Leu Phe Tyr Tyr Gly Ser

145 150 155 160

Tyr Gly Gln Pro Ser Ser Asp Tyr Lys Lys Ile Glu Glu Asn Tyr Ile

165 170 175

Tyr Ala Ile Lys Pro Asp Ala Ile Asn Asn Glu Asn Ile Asn Ala Leu

180 185 190

Thr Ala Thr Tyr His Gln Glu Asp

195 200

<210> 2

<211> 779

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Asn Arg Ala Asp Arg Val

1 5 10 15

Glu Glu Lys Ala Gln Pro Val Gln Ser Asn Ser Glu Pro Ser Ser Thr

20 25 30

Pro Ile Lys His Pro Met Thr Asn Ser Ala Thr Asn Thr Ser Leu His

35 40 45

Asp Lys Leu Ser Met Ser Ser His Asp Thr Ser Lys Glu Asn Ser Gln

50 55 60

Gln Ser Ser Phe Gln Ala Pro Leu Glu Gln Glu Lys Asn Gln Pro Ala

65 70 75 80

Gln Glu Asn Leu Thr Trp Thr Gly Tyr His Val Ser Glu Trp Gly Asn

85 90 95

Ala Ser Asn Asn Val Asp Lys Asp Asn Val Thr Val Phe Thr Phe Val

100 105 110

Lys Tyr Asn Ser Gln Tyr Asn Asp Asp Pro Val Phe Asp Lys Thr Lys

115 120 125

Thr Gln Ser Lys Thr Ile Ser Leu Val Asp Gly Lys Asn Glu Asn Lys

130 135 140

Glu His Tyr Tyr His Phe Thr Leu Lys Asp Asp Leu Phe Tyr Tyr Gly

145 150 155 160

Ser Tyr Gly Gln Pro Ser Ser Asp Tyr Lys Lys Ile Glu Glu Asn Tyr

165 170 175

Ile Tyr Ala Ile Lys Pro Asp Ala Ile Asn Asn Glu Asn Ile Asn Ala

180 185 190

Leu Thr Ala Thr Tyr His Gln Glu Asp Glu Gly Lys Ala Arg Thr Ala

195 200 205

Pro Gln Gly Glu Ala Ala Gly Thr Ala Thr Thr Ala Ser Val Pro Gly

210 215 220

Thr Thr Thr Asp Gly Met Asp Pro Gly Val Val Ala Ala Thr Ser Val

225 230 235 240

Val Thr Ala Glu Asn Ser Ser Ala Ser Val Ala Thr Ala Gly Ile Gly

245 250 255

Gly Pro Pro Gln Gln Val Asp Gln Gln Glu Thr Trp Arg Thr Asn Phe

260 265 270

Tyr Tyr Asn Asp Val Phe Thr Trp Ser Val Ala Asp Ala Pro Gly Ser

275 280 285

Ile Leu Tyr Thr Val Gln His Ser Pro Gln Asn Asn Pro Phe Thr Ala

290 295 300

Val Leu Ser Gln Met Tyr Ala Gly Trp Ala Gly Gly Met Gln Phe Arg

305 310 315 320

Phe Ile Val Ala Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Arg Leu Val Ala Ala

325 330 335

Val Ile Pro Pro Gly Ile Glu Ile Gly Pro Gly Leu Glu Val Arg Gln

340 345 350

Phe Pro His Val Val Ile Asp Ala Arg Ser Leu Glu Pro Val Thr Ile

355 360 365

Thr Met Pro Asp Leu Arg Pro Asn Met Tyr His Pro Thr Gly Asp Pro

370 375 380

Gly Leu Val Pro Thr Leu Val Leu Ser Val Tyr Asn Asn Leu Ile Asn

385 390 395 400

Pro Phe Gly Gly Ser Thr Asn Ala Ile Gln Val Thr Val Glu Thr Arg

405 410 415

Pro Ser Asp Asp Phe Glu Phe Val Met Ile Arg Ala Pro Ser Ser Lys

420 425 430

Thr Val Asp Ser Ile Ser Pro Ala Gly Leu Leu Thr Thr Pro Val Leu

435 440 445

Thr Gly Val Gly Asn Asp Asn Arg Trp Asn Gly Gln Ile Val Gly Leu

450 455 460

Gln Pro Val Pro Gly Gly Phe Ser Thr Cys Asn Arg His Trp Asn Leu

465 470 475 480

Asn Gly Ser Thr Tyr Gly Trp Ser Ser Pro Arg Phe Ala Asp Ile Asp

485 490 495

His Arg Arg Gly Ser Ala Ser Tyr Ser Gly Asn Asn Ser Thr Asn Val

500 505 510

Leu Gln Phe Trp Tyr Ala Asn Ala Gly Ser Ala Ile Asp Asn Pro Ile

515 520 525

Ser Gln Val Ala Pro Asp Gly Phe Pro Asp Met Ser Phe Val Pro Phe

530 535 540

Asn Ser Pro Asn Ile Pro Thr Ala Gly Trp Val Gly Phe Gly Gly Ile

545 550 555 560

Trp Asn Ser Asn Asn Gly Ala Pro Ala Ala Thr Thr Val Gln Ala Tyr

565 570 575

Glu Leu Gly Phe Ala Thr Gly Ala Pro Asn Ser Leu Gln Pro Thr Thr

580 585 590

Asn Thr Ser Gly Ala Gln Thr Val Ala Lys Ser Ile Tyr Ala Val Val

595 600 605

Thr Gly Thr Asn Gln Asn Pro Thr Gly Leu Phe Val Met Ala Ser Gly

610 615 620

Val Ile Ser Thr Pro Asn Ala Ser Ala Val Thr Tyr Thr Pro Gln Pro

625 630 635 640

Asp Arg Ile Val Thr Thr Pro Gly Thr Pro Ala Ala Ala Pro Val Gly

645 650 655

Lys Asn Thr Pro Ile Met Phe Ala Ser Val Val Arg Arg Thr Gly Asp

660 665 670

Val Asn Ala Ala Ala Gly Ser Thr Asn Gly Thr Gln Tyr Gly Thr Gly

675 680 685

Ser Gln Pro Leu Pro Val Thr Ile Gly Leu Ser Leu Asn Asn Tyr Ser

690 695 700

Ser Ala Leu Val Pro Gly Gln Phe Phe Val Trp Gln Leu Thr Phe Ala

705 710 715 720

Ser Gly Phe Met Glu Ile Gly Leu Ser Val Asp Gly Tyr Phe Tyr Ala

725 730 735

Gly Thr Gly Ala Ser Thr Thr Leu Ile Asp Leu Thr Glu Leu Ile Asp

740 745 750

Val Arg Pro Val Gly Pro Arg Pro Ser Lys Ser Thr Leu Val Phe Asn

755 760 765

Leu Gly Gly Thr Thr Asn Gly Phe Ser Tyr Val

770 775

<210> 3

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgtagcggtg gtggcggtag cgctggaaat cgtgctgacc gtgtagagga aaaagcacaa 60

ccggttcaat caaatagtga gccttcttcc actccaatca aacatcctat gactaatagt 120

gctacgaata cttctcttca tgacaaactt tcaatgtctt ctcatgacac atccaaagaa 180

aatagtcaac aatcctcctt tcaagcccct ctagaacaag aaaaaaacca acctgcacaa 240

gaaaatctta cttggacagg ttatcatgtt tcagaatggg gaaatgcgag taataatgta 300

gataaagata atgttacggt attcactttc gtaaaatata attctcaata taatgatgat 360

ccagtttttg ataaaacaaa aacacaaagt aaaacgatat cattagttga cggaaaaaat 420

gaaaataaag agcattatta tcactttacg ctaaaagacg atttatttta ttatggcagt 480

tatggacaac cttcatcaga ttataaaaaa atagaagaaa actatattta tgcaatcaaa 540

ccagatgcaa taaataatga gaacatcaat gcactaactg caacttacca tcaagaagat 600

<210> 4

<211> 2340

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtgtagcg gtggtggcgg tagcgctgga aatcgtgctg accgtgtaga ggaaaaagca 60

caaccggttc aatcaaatag tgagccttct tccactccaa tcaaacatcc tatgactaat 120

agtgctacga atacttctct tcatgacaaa ctttcaatgt cttctcatga cacatccaaa 180

gaaaatagtc aacaatcctc ctttcaagcc cctctagaac aagaaaaaaa ccaacctgca 240

caagaaaatc ttacttggac aggttatcat gtttcagaat ggggaaatgc gagtaataat 300

gtagataaag ataatgttac ggtattcact ttcgtaaaat ataattctca atataatgat 360

gatccagttt ttgataaaac aaaaacacaa agtaaaacga tatcattagt tgacggaaaa 420

aatgaaaata aagagcatta ttatcacttt acgctaaaag acgatttatt ttattatggc 480

agttatggac aaccttcatc agattataaa aaaatagaag aaaactatat ttatgcaatc 540

aaaccagatg caataaataa tgagaacatc aatgcactaa ctgcaactta ccatcaagaa 600

gatgaaggta aagcacgtac cgcaccgcag ggtgaagcag caggcaccgc aaccaccgca 660

agcgttccgg gtacaaccac cgatggtatg gatccgggtg ttgttgcagc aaccagcgtt 720

gttaccgcag aaaatagcag cgccagcgtg gcaaccgcag gtattggtgg tccgcctcag 780

caggttgatc agcaagaaac ctggcgtacc aatttctatt ataacgatgt ttttacttgg 840

agcgttgcag atgcaccggg tagcattctg tataccgttc agcatagtcc gcagaataat 900

ccgtttaccg cagttctgag ccagatgtat gcaggttggg caggcggtat gcagtttcgt 960

tttattgttg caggtagcgg tgtttttggt ggtcgtctgg ttgcagcagt tattccgcct 1020

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cgtagcctgg aaccggttac cattaccatg ccggatctgc gtccgaatat gtatcatccg 1140

accggtgatc ctggtctggt tccgaccctg gttctgagcg tttataacaa tctgattaac 1200

ccgtttggtg gtagcaccaa tgcaattcag gttaccgttg aaacccgtcc gagtgatgat 1260

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ggtctgctga ccacaccggt tctgaccggt gttggtaatg ataatcgttg gaatggtcag 1380

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aatggtagta cctatggttg gagcagtccg cgttttgcag atattgatca tcgtcgtggt 1500

agcgcaagct atagcggtaa taatagtacc aatgttctgc agttttggta tgcaaatgcc 1560

ggtagcgcca ttgataatcc gattagccag gttgcaccgg atggttttcc ggatatgagc 1620

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agcaccaccc tgattgatct gaccgaactg attgatgttc gtccggttgg tccgcgtccg 2280

agcaaaagca ccctggtttt taatctgggt ggcaccacca atggtttcag ctatgtttaa 2340

Claims

1. 一种嵌合了巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原，其特征在于，所述重组抗原包括兔出血症病毒VP60蛋白，其N端连接巴氏杆菌PlpE蛋白抗原表位多肽片段；所述嵌合了巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原的氨基酸序列为SEQ IDNO:2；编码所述嵌合了巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

2.根据权利要求1所述一种嵌合了巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原，其特征在于，连接在兔出血症病毒VP60蛋白N端的巴氏杆菌PlpE蛋白抗原表位是PlpE蛋白抗原的第21位到第200位氨基酸的多肽片段。

3. 根据权利要求1所述嵌合了巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原，其特征在于，所述VP60蛋白N端嵌入的PlpE抗原表位氨基酸序列为SEQ ID NO:1；其核苷酸序列为：SEQ ID NO:3。

4. 一种重组抗原的表达载体，其特征在于，所述载体用于表达嵌合了巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原，含有SEQ ID NO:4所述核苷酸序列。

5.一种制备权利要求1所述嵌合了巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原制备方法，其步骤如下：

(1)通过PCR扩增巴氏杆菌PlpE的N端第21位到第200位氨基酸所对应的DNA序列，其核苷酸序列为：SEQ ID NO:3；

6.权利要求1所述嵌合了巴氏杆菌PlpE抗原表位的兔出血症病毒VP60重组抗原在制备预防兔病毒性出血症和兔巴氏杆菌病疫苗方面的应用。