CN105056227B - 一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子vlp疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于遗传工程技术领域，具体为一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗及其制备方法。本发明涉及的类病毒粒子（VLP）疫苗是由含有口蹄疫病毒的抗原表位基因和作为载体的猪圆环病毒（procine circovirus，PCV）的外壳蛋白CAP基因的重组杆状病毒连接形成的，其中口蹄疫病毒的抗原基因可以是任何毒株的抗原表位基因。该重组杆状病毒转入表达体系后传代到第三代可以收获重组病毒粒子，提取出的类病毒粒子便是抗口蹄疫病毒的VLP疫苗。该疫苗免疫口蹄疫模式动物豚鼠后，可以使37.5%的豚鼠免受口蹄疫病毒的感染。

Description

一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体的说，涉及一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗及其制备方法。

背景技术

口蹄疫是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物。多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。预防接种是控制该病毒的主要手段。在各种预防口蹄疫的疫苗中，用基因工程技术制备亚单位疫苗是近几十年较为成功的方向，已有产品在市场销售。但是近年来发现免疫原性最强，效果最好具有广阔应用前景的基因工程疫苗是类病毒粒子（VLP）疫苗。

制备抗口蹄疫病毒的类病毒粒子有多条技术路线，其中一个重要方向是用能在细胞中自动装配为类病毒粒子的病毒蛋白基因为载体，在该载体表面插入抗口蹄疫病毒的抗原表位基因，置入昆虫细胞培养并表达类病毒颗粒。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗及其制备方法。本发明首次采用同为常见家畜病毒的猪圆环病毒（PCV）作为载体，插入口蹄疫病毒单个表位或不同抗原表位组合从而构建类病毒颗粒。这种类病毒粒子具有很强的免疫原性，能诱导体液免疫和细胞免疫，可制备成安全、稳定、多价，高效的抗口蹄疫病毒病亚单位疫苗。

本发明以猪圆环病毒（procine circovirus，PCV）的外壳蛋白CAP基因为载体，以抗口蹄疫病毒的抗原表位基因作为抗原蛋白基因，通过遗传工程技术将上述基因连接并利用表达系统构建重组杆状病毒粒子，将重组杆状病毒粒子转入细胞，在细胞中合成类病毒粒子，提取出的类病毒粒子便是抗口蹄疫病毒的疫苗。

抗原表位（epitope）是指抗原分子表面具有特殊结构和免疫活性的化学基团，其能刺激机体产生抗体或促进淋巴细胞增殖并能被其识别，又称抗原决定簇（antigenicdetermination）。按表位结构不同，可分为线型表位和构象型表位；按结合的受体细胞不同可分为B细胞抗原表位和T细胞抗原表位。B细胞表位既有线型表位，又有构象型表位，而T细胞表位一般只有线型表位。

本发明具体技术方案介绍如下。

本发明提供一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗，以猪圆环病毒PCV的外壳蛋白CAP基因作为载体，将抗口蹄疫病毒的抗原表位基因插在CAP基因的C端，二者联合组成抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗。

本发明中，所述类病毒粒子VLP疫苗是由含有将抗口蹄疫病毒的抗原表位基因和作为载体的猪圆环病毒PCV的外壳蛋白CAP基因的重组杆状病毒在表达体系中形成的；所述表达体系选自大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，植物或者哺乳动物细胞中任一种。上述每个表达体系统均有其特点，例如大肠杆菌系统表达量高，但糖基化等蛋白修饰程度差；哺乳动物细胞系统表达量低，成本高，但其能进行复杂的蛋白翻译后修饰；昆虫细胞系统既能进行一定的蛋白修饰，也有较高的表达量，但其蛋白的纯化有一定的难度。本发明所运用的表达体系可以是任一符合条件的常用体系

本发明中，所述抗口蹄疫病毒的抗原表位基因来自O型、A型或亚洲I型的口蹄疫病毒。

本发明中，所述抗口蹄疫病毒的抗原表位基因为VP1的G-H环（141～160aa）、21～40aa、200～213aa，VP2的74~88aa，VP3的26~39aa、VP4的20~35aa或者为上述抗原表位的组合。

本发明中，所述抗原表位选自O型口蹄疫病毒Mya98毒株的VP1蛋白抗原表位141~160aa，其氨基酸序列为SEQ No.1，核苷酸序列为如SEQ No.2；或者VP1蛋白抗原表位20~40aa，其氨基酸序列为SEQ No.3，核苷酸序列为SEQ No.4；或者VP1蛋白抗原表位200~213aa；或者上述VP1蛋白抗原表位20~40aa和VP1蛋白抗原表位141~160aa的串联组合，其氨基酸序列为SEQ No.5，核苷酸序列为SEQ No.6。

本发明还进一步提供上述抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗的制备方法，其特征在于：其包括：基因制备、重组质粒构建、重组杆状病毒制备、重组蛋白获取和制苗步骤，具体步骤如下：

(1)分别克隆出CAP、单表位、串联表位基因；

(2)利用重叠PCR获得重组VLP基因；

(3)将上一步的基因克隆入杆状病毒载体获得重组杆状病毒质粒并鉴定；

(4)将上一步质粒转入昆虫细胞内，收获重组杆状病毒；

(5)扩增重组杆状病毒，使用扩增后的病毒感染细胞表达重组蛋白；

(6)利用SDS-PAGE,Western-Blot和电镜鉴定重组蛋白；

(7)将重组蛋白按一定浓度与佐剂1：1混匀后制成疫苗，免疫动物检测效果。

本发明的有益效果在于：本发明是第一次将FMDV的抗原表位以单个表位或串联表位插入猪圆环病毒（procine circovirus， PCV）的外壳蛋白CAP基因。含有上述二种基因的质粒可在不同细胞（昆虫细胞）中能合成类病毒粒子，提取出的类病毒粒子具有免疫原性，该类病毒粒子对抵抗FMDV感染效果已经显现。本发明的口蹄疫病毒的抗原表位基因序列来自任何一型的口蹄疫病毒，包括O型、A型、亚洲I型。因此抗口蹄疫病毒的类病毒粒子（VLP）疫苗可以是单价的也可以是多价的。即一种疫苗可以同时抗O型、A型、亚洲I型口蹄疫病毒的感染。

附图说明

图1为重组杆粒的PCR鉴定；A．CAP-B和CAP-BTB的M13引物PCR鉴定结果；1泳道为CAP-B结果，2泳道为阴性对照结果，3泳道为Marker，从上到下分别为7000，5500，3000，2000bp，4泳道为CAP-BTB结果； B．CAP-B和CAP-BTB的特异性引物PCR鉴定结果，1泳道为CAP-B结果，2泳道为CAP-BTB结果，3泳道为Marker，从上到下分别为1200，900，700，500bp图上标出目的条带附近的marker的大小。

图2为转染后Sf9细胞的病变情况（X100）； A为正常细胞对照，B为病变细胞。

图3为重组蛋白CAP-B电镜观察结果；标尺放大倍率为100000X，标尺长200nm。

图4为重组蛋白CAP-BTB电镜观察结果；标尺放大倍率为100000X，标尺长200nm。

图5为组蛋白的SDS-PAGE和Western-Blot结果；A：泳道1为空细胞对照，2为杆状病毒感染细胞对照，3，5分别为CAP-B，CAP-BTB实验组，4泳道为Marker ；B：1，Sf9细胞对照；2，空杆状病毒感染对照，3，CAP-B实验组，5，CAP-BTB实验组，4泳道为Marker。

具体实施方式

本发明实例中的两种抗原基因按照FMDV O型MYA98亚型毒株（O/BY/CHA/2010）的核苷酸序列（GenBank: JN998085.1）经化学法合成。VP1上的141~160aa的抗原表位基因命名为B基因，将141~160aa---21~40aa----141~160aa串联的基因命名为BTB基因。

本发明所涉及的抗原表位组合方式参考了O型口蹄疫基因工程多肽疫苗（专利号：02137011.7）。组合方式为141～160aa---20～40aa（或其他表位）---141-160aa串联结构，在肽段连接处加入适当氨基酸多肽作为接头，如实例中采用的141-160aa—Pro—Gly—21-40aa—Gln—Phe—Glu—Leu—Glu—Phe—Met—Val—-Pro—Ser—Arg—141-160aa的抗原多肽结构，前后两个接头分别是2个和11个氨基酸。

本发明选用的载体基因为PCV2的CAP基因（GeneBank：ACZ06084.1），从含有猪圆环病毒（procine circovirus， PCV）ORF2编码的Cap蛋白基因（GeneBank：ACZ06084.1）的重组质粒上扩增获得。

本实例采用invitrogen公司的bac to bac体系，其在重组杆状病毒构建时，使用供体质粒pFastBac和宿主菌DH10Bac（含有杆状病毒质粒和辅助质粒）。其中供体质粒pFastBac上含有苜宿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiplenuclear polyhedrosis virus，AcMNPV)的强效启动子P_H以控制基因表达，此表达框被Tn7左、右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV40多腺苷酸化信号，形成一个微型的Tn7；同时宿主菌DH10Bac内的杆状病毒穿梭质粒上含有微型attTn7靶位点。将之前构建的重组VLP基因克隆到pFastBac载体上后，将含有外源片段的pFastBac质粒转化进入DH10Bac内，在辅助质粒的帮助下，在微型Tn7单位和微型attTn7靶位点之间就会发生转座，从而产生重组杆粒，然后转入昆虫细胞获得重组杆状病毒，重组杆状病毒再次感染细胞即可表达蛋白。

下面结合实施例和附图对本发明进一步详细说明。

1、 CAP-BTB序列和CAP-B序列的获得

通过重叠PCR(合成的BTB基因N端有CAP基因C端一部分序列)获得CAP-BTB序列，测序确认。从测序正确的CAP-BTB序列上扩增出CAP-B序列，测序确认后分别保存。

2、重组质粒pFB-CAP-B和pFB-CAP-BTB的构建

将CAP-B基因和pFastBac1载体分别用BamH I和Xho I双酶切，回收后进行连接，将连接产物转入感受态DH5α后，挑取阳性克隆测序确认，抽取质粒并命名为pFB-CAP-B；同样方法获得pFB-CAP-BTB。

3、重组杆状病毒质粒rBAC-CAP-B和rBAC-CAP-BTB的获得

分别将质粒pFB-CAP-B和pFB-CAP-BTB转化入DH10Bac感受态细胞内，借由质粒上的Tn5转座单位和细胞内辅助质粒的功能将目的基因转座到杆状病毒载体Bacmid上。经由抗生素（卡那霉素，四环素，庆大霉素）和蓝白斑筛选后，提取重组质粒，分别利用目的基因的特异性引物和载体上的M13通用引物进行PCR鉴定，分别命名为rBAC-VLP+B和rBAC-VLP+BTB。

4、重组杆状病毒质粒的获得及鉴定

挑选转座后白斑抽取重组质粒，分别获得rBAC-CAP-B和rBAC-CAP-BTB；分别利用M13引物（杆粒上自带引物，见图1A）和序列对应的特异性引物进行PCR鉴定；M13引物PCR产物理论大小分别为3100bp和3200bp，特异性引物PCR产物结果分别为771bp和930bp，结果见图1B。均在目的大小位置看到对应条带，说明重组杆粒构建成功。

5、重组杆状病毒的获得

用rBAC-CAP-B和rBAC-CAP-BTB分别转染sf9细胞，3-4天后细胞停止生长，体积变大，内部出现颗粒体（小泡），晚期细胞脱落或破碎，大量死亡；阴性对照组细胞正常生长，说明重组病毒转染成功，见图2。

6、重组蛋白的表达

将2种重组质粒分别转染至对数期Sf9昆虫细胞，当细胞出现明显病变时，收获培养基上清，500g离心5-10min收取上清，即为P1代毒株；再用P1代毒株感染细胞获得滴度较高的P2代毒株；P2代毒株再次感染细胞（MOI=1-5）即可表达重组蛋白，分别命名为CAP-B和CAP-BTB。

使用P2代毒株感染细胞，收获细胞获得重组蛋白。

7、重组病毒样颗粒的电镜观察

表达的2种重组蛋白经过负染后，在透射电镜下观察结构。PCV2病毒颗粒大小理论上为17-20nm，预估插入了外源片段后，CAP-B的大小为20nm-25nm，CAP-BTB大小为20nm-30nm。图3、图4中可以分别观察到预测大小的颗粒，证明了重组病毒形成了VLPs结构。

8、类病毒粒中重组蛋白的免疫原性检测SDS-PAGE和Western-Blot结果

使用P2代毒株感染细胞，从中收获类病毒粒子获得重组蛋白。其大小分别为30KD和36KD啊（图5A），使用豚鼠抗FMDV MYA98亚型血清作为一抗进行Western Blot，在实验组目的大小处可以观察到特异性条带，而阴性对照均无对应条带（见图5B），结果说明本发明所获得的类病毒颗粒中所展示的FMDV抗原表位具有免疫原性。

9、两种类病毒粒子苗对豚鼠的免疫保护效果

将上述重组蛋白按照一定浓度与弗氏佐剂混匀后制成疫苗进行豚鼠保护实验。第一次免疫所用佐剂为完全弗氏佐剂，每只豚鼠注射0.3ml；2周后进行第二次免疫，佐剂为不完全弗氏佐剂，每只豚鼠注射0.3ml；3周后按照100ID₅₀剂量攻毒，记录10d内豚鼠发病情况，见表1。

表1 rBAC-VLP+B和rBAC-VLP+BTB苗对豚鼠的免疫保护效果

结果表明，实验组CAP-B和CAP-BTB中8组豚鼠均各有3只未发病，即都为37.5%的保护率；对照组中8只豚鼠全部发病，保护率为0%。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学

<120> 一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗及其制备方法

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213>

<400> 1

Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala

1 5 10 15

Arg Pro Leu Pro

20

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213>

<400> 2

ctgccaaacg tgcgcggaga cctgcaagtc ctggcccaga aggctgcccg tcctctgcct 60

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213>

<400> 3

Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp Val Ser Phe Ile Leu

1 5 10 15

Asp Arg Phe Val

20

<210> 4

<211> 60

<212> DNA

<213>

<400> 4

gagacccagg tgcagcgtcg ccatcacacc gacgtgtcct tcatcctgga ccgcttcgtg 60

<210> 5

<211> 73

<212> PRT

<213>

<400> 5

Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala

1 5 10 15

Arg Pro Leu Pro Pro Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr

20 25 30

Asp Val Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Gln Phe Glu Leu Glu Phe

35 40 45

Met Val Pro Ser Arg Leu Pro Asn Val Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu

50 55 60

Ala Gln Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro

65 70

<210> 6

<211> 219

<212> DNA

<213>

<400> 6

ctgccaaacg tgcgcggaga cctgcaagtc ctggcccaga aggctgcccg tcctctgcct 60

cctggtgaga cccaggtgca gcgtcgccat cacaccgacg tgtccttcat cctggaccgc 120

ttcgtgcagt tcgagctgga gttcatggtg ccttcccgcc tgcctaacgt ccgtggtgat 180

ctgcaggtgc tggctcagaa agctgctcgc cccctgcct 219

Claims (3)

1.一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗，其特征在于：以猪圆环病毒PCV的外壳蛋白CAP基因作为载体，将抗口蹄疫病毒的抗原表位基因插在CAP基因的C端，二者联合组成抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗；

所述抗原表位为VP1蛋白抗原表位20~40aa和VP1蛋白抗原表位141~160aa的串联组合，其氨基酸序列为SEQNo.5，核苷酸序列为SEQNo.6。

2.根据权利要求1所述的类病毒粒子VLP疫苗，其特征在于，所述类病毒粒子VLP疫苗是由含有将抗口蹄疫病毒的抗原表位基因和作为载体的猪圆环病毒PCV的外壳蛋白CAP基因的重组杆状病毒在表达体系中形成的；所述表达体系选自大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，植物或者哺乳动物细胞。

3.一种如权利要求1所述的抗口蹄疫病毒的类病毒粒子VLP疫苗的制备方法，其特征在于：其包括：基因制备、重组质粒构建、重组杆状病毒制备、重组蛋白获取和制苗步骤，具体步骤如下：

(1)分别克隆出CAP、单表位、串联表位基因；

(2)利用重叠PCR获得重组VLP基因；

(3)将上一步的基因克隆入杆状病毒载体获得重组杆状病毒质粒并鉴定；

(4)将上一步质粒转入昆虫细胞内，收获重组杆状病毒；

(5)扩增重组杆状病毒，使用扩增后的病毒感染细胞表达重组蛋白；

(6)利用SDS-PAGE,Western-Blot和电镜鉴定重组蛋白；

(7)将重组蛋白按一定浓度与佐剂1：1混匀后制成疫苗，免疫动物检测效果。