CN110257428B - 一种表达猪圆环病毒3型orf2基因的重组腺病毒及制备方法与应用 - Google Patents

一种表达猪圆环病毒3型orf2基因的重组腺病毒及制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110257428B
CN110257428B CN201910584281.2A CN201910584281A CN110257428B CN 110257428 B CN110257428 B CN 110257428B CN 201910584281 A CN201910584281 A CN 201910584281A CN 110257428 B CN110257428 B CN 110257428B
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant adenovirus
vector
pcv3
seq
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910584281.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110257428A (zh
Inventor
张华伟
徐高原
朱娴静
周明光
陈波
郝根喜
方玉林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Keqian Biological Co ltd
Original Assignee
Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Keqian Biological Co ltd filed Critical Wuhan Keqian Biological Co ltd
Priority to CN201910584281.2A priority Critical patent/CN110257428B/zh
Publication of CN110257428A publication Critical patent/CN110257428A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110257428B publication Critical patent/CN110257428B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达猪圆环病毒3型ORF2基因的重组腺病毒及制备方法与应用。本发明提供含有PCV3的Cap蛋白编码基因的重组腺病毒转移质粒和重组腺病毒。本发明通过人工密码子优化和信号肽选择，实现了PCV3的Cap蛋白的高水平分泌表达，得到的PCV3的Cap蛋白的结构和功能与天然状态完全一致，最大程度地保留了Cap蛋白的免疫原性，可以更好更快地被DC等抗原呈递细胞识别。本发明提供的腺病毒载体疫苗具有高度的免疫原性和安全性，能够有效激活机体的免疫反应，刺激动物产生高水平的特异性抗体和中和抗体，对猪圆环病毒发挥优异的免疫保护效果。

Description

一种表达猪圆环病毒3型ORF2基因的重组腺病毒及制备方法 与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达猪圆环病毒3型 ORF2基因的重组腺病毒及制备方法，以及利用该重组腺病毒制备的猪圆环病毒3型腺病毒载体疫苗。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine Circovirus，PCV)为单股环状DNA病毒，是最小的动物DNA病毒之一，会引起仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸系统混合疾病、猪繁殖障碍症、猪皮炎肾病综合征等，对养猪业造成严重的危害。猪圆环病毒早期确定有两种类型，包括圆环病毒1型(PCV1)和圆环病毒2型(PCV2)。在2015年美国一猪场的母猪群暴发皮炎肾病综合，临床症状和组织学病变都与圆环病毒相关疾病一致，但是PCV2、PRRSV、IAV等均为阴性。美国学者Rachel Palinski等采用宏基因组测序后发现该病毒毒株的基因型不同以往的圆环病毒，因此将其命名为PCV3。
PCV能够侵害猪只的免疫系统，导致免疫抑制和机体抵抗力下降，干扰猪只对其他疫病免疫抗体的产生和维持，因此容易继发其他疾病。目前，针对PCV3的研究非常有限，并且没有相关的商品化疫苗，因此亟需针对PCV3的安全有效的疫苗。ORF2基因编码衣壳蛋白Cap，该蛋白与病毒致病性密切相关，至少存在5个相互重叠的免疫优势表位，能诱导产生中和抗体，是主要的免疫原性蛋白，因此，ORF2基因是PCV疫苗研制的主要候选基因。
腺病毒是目前最高效可靠的重组病毒表达系统之一，可用于在哺乳动物细胞中高水平地表达目的蛋白。因腺病毒感染不依赖细胞周期，故其既可以感染增殖细胞也可以感染非增殖细胞。同时其可感染的宿主范围广泛，可感染除人以外的几乎所有类型的细胞，且能将外源基因在靶细胞中持续表达10d以上。并且具有病毒颗粒稳定，病毒滴度高，可用于动物试验以及有较好的生物安全性等特点。虽然人腺病毒载体疫苗在人体中获得应用还需要更深入的研究，但是作为动物疫苗却很有前景，因为动物体内没有人腺病毒载体的中和抗体，相同的载体疫苗多次使用的概率也很低。中国专利201810263507.4(一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法)通过在猪圆环病毒2型Cap 蛋白编码基因前后添加了调控元件来提高重组腺病毒的Cap蛋白表达量。目前尚没有利用腺病毒表达系统表达猪圆环病毒3型Cap蛋白、制备腺病毒载体疫苗的相关报道，因此，开发PCV3的腺病毒载体疫苗具有重要意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供一种高效表达猪圆环病毒3型ORF2基因的重组腺病毒及制备方法，以及利用该重组腺病毒制备的猪圆环病毒3型腺病毒载体疫苗。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供一种重组腺病毒转移载体，其含有目的基因片段，所述目的基因片段包含PCV3的Cap蛋白编码基因，所述PCV3的Cap蛋白编码基因的序列为经密码子优化得到的如SEQ ID NO.1所示的序列。
上述如SEQ ID NO.1所示的序列为本发明经人工密码子优化和筛选得到，能够在最大程度地保证天然结构以及较高的免疫原性的同时，实现PCV3的Cap蛋白的高水平表达。
作为优选，所述PCV3的Cap蛋白编码基因的5’端和3’端分别连接有IL-2信号肽序列和His标签肽序列。
进一步优选地，所述目的基因片段的序列如SEQ ID NO.4所示。如SEQ ID NO.4所示的序列为在如SEQ ID NO.1的序列的5’端连接IL-2信号肽序列、3’端连接柔性肽和His标签肽序列得到，能够保证 Cap蛋白高水平分泌表达，表达的Cap蛋白分泌到细胞外，更有利于抗原递呈细胞的识别。
作为优选，所述重组腺病毒转移载体为在CMV启动子后插入序列如SEQ ID NO.4所示的目的基因片段的pShuttle-CMV载体或其衍生载体。Cap蛋白的编码基因序列能够更好地与该启动子配合作用，有利于进一步提高Cap蛋白的表达量。
所述pShuttle-CMV载体的衍生载体为以pShuttle-CMV载体为骨架经改造获得的载体，如连接eGFP标签，以便于重组腺病毒的观察。
本发明还提供一种重组腺病毒，其含有目的基因片段，所述目的基因片段包含PCV3的Cap蛋白编码基因，所述PCV3的Cap蛋白编码基因的序列为经密码子优化得到的如SEQ ID NO.1所示的序列。
作为优选，所述PCV3的Cap蛋白编码基因的5’端和3’端分别连接有IL-2信号肽序列和His标签肽序列；所述目的基因片段的序列如 SEQ ID NO.4所示。携带如SEQ ID NO.4所示序列的重组腺病毒能够高水平分泌表达PCV3的Cap蛋白，同时保证较高的重组腺病毒滴度。
本发明还提供所述重组腺病毒的构建方法，其为采用AdEasy腺病毒构建系统，具体包括如下步骤：
(1)将序列如SEQ ID NO.4所示的目的基因片段插入 pShuttle-CMV载体，构建重组腺病毒转移载体；
(2)将所述重组腺病毒转移载体线性化后转入含有骨架载体 pAdEasy-1的大肠杆菌中，进行同源重组，得到重组腺病毒质粒；
(3)将所述重组腺病毒质粒线性化后转染至哺乳动物细胞，进行重组腺病毒的包装和扩增，得到重组腺病毒。
作为优选，上述步骤(1)中，所述将序列如SEQ ID NO.4所示的目的基因片段插入pShuttle-CMV载体采用同源重组的方法。
进一步优选地，采用序列分别如SEQ ID NO.7-8所示的引物扩增所述目的基因片段后与线性化的载体通过同源重组连接。利用如SEQ ID NO.7-8所示的引物能够有效提高载体的构建效率。
作为优选，上述步骤(2)中所述大肠杆菌为BJ5183菌株。
作为优选，上述步骤(3)中，所述哺乳动物细胞为HEK-293T 细胞。
本发明还提供所述重组腺病毒转移载体或所述重组腺病毒在制备PCV3疫苗中的应用。
所述疫苗包括但不限于腺病毒载体疫苗。
本发明提供一种PCV3的腺病毒载体疫苗，其包含所述重组腺病毒。
上述PCV3的腺病毒载体疫苗还可包含其它疫苗领域允许的佐剂或辅料。
本发明的有益效果在于：
本发明利用重组腺病毒表达系统表达PCV3的Cap蛋白，根据密码子偏好性进行人工序列优化，筛选得到最优的PCV3 Cap蛋白编码序列，实现了重组腺病毒高水平表达PCV3的Cap蛋白，且得到的PCV3 的Cap蛋白的结构和功能与天然状态完全一致，最大程度地保留了 Cap蛋白的功能和免疫原性。进一步采用IL-2的信号肽、柔性肽序列和6×His标签肽序列使Cap蛋白能够高效分泌表达，可以更好更快地被DC等抗原呈递细胞识别。同时，在重组腺病毒中导入本发明经优化的PCV3的Cap蛋白编码序列还能够保证较高的重组腺病毒滴度。
本发明利于重组腺病毒制备PCV3的腺病毒载体疫苗，该疫苗具有高度的免疫原性和安全性，能够有效激活机体的免疫反应，刺激动物产生高水平的特异性抗体和中和抗体，对猪圆环病毒发挥优异的免疫保护效果，且具有用量少、产率高以及抗原不需纯化的优势。
本发明使用的腺病毒真核表达系统具有高效、安全、人畜无害等优势，适于大量生产制备。
附图说明
图1为本发明实施例1中pShuttle-CMV质粒的图谱。
图2为本发明实施例1中重组转移载体pShuttle-CMV-Cap的酶切鉴定结果；其中，M为DNA marker DL15000，泳道1、泳道2和泳道3 分别为pShuttle-CMV-Cap-1、pShuttle-CMV-Cap-2和 pShuttle-CMV-Cap-3双酶切产物。
图3为本发明实施例2中重组腺病毒质粒pAd-PCV3 Cap的酶切鉴定结果；其中，M为λ-Hind III digest DNA Marker，泳道1、泳道3和泳道5分别为pAd-PCV3 Cap-1、pAd-PCV3Cap-2和pAd-PCV3 Cap-3双酶切产物，泳道2、泳道4和泳道6分别为质粒未酶切对照。
图4为本发明实施例2中重组腺病毒感染的HEK-293T的细胞病变其中，A为正常细胞对照，B为重组腺病毒Ad-PCV3 Cap感染的 HEK-293T的细胞。
图5为本发明实施例2中PCV3的Cap蛋白的Western blotting检测结果；其中，泳道1为Ad-PCV3 Cap-1蛋白，泳道2为Ad-PCV3 Cap-2 蛋白，泳道3为Ad-PCV3 Cap-3蛋白，泳道4为空白细胞上清对照
图6为本发明实施例3中腺病毒载体疫苗免疫小鼠产生的特异性抗体的ELISA检测结果。
图7为本发明实施例3中腺病毒载体疫苗免疫仔猪产生的特异性抗体的ELISA检测结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1携带猪圆环病毒3型的Cap蛋白编码基因的重组腺病毒转移载体的构建
1、PCV3的Cap蛋白编码基因的密码子优化和合成
参照数据库中PCV3的Cap蛋白编码基因(ORF2基因)的序列，为实现Cap蛋白的高效表达，本发明首先根据腺病毒表达系统密码子的偏爱性对ORF2基因序列进行密码子优化，分别设计了不同的密码子优化序列，并对其表达水平进行初步检测，经对比筛选，本发明发现，不同程度的密码子优化得到的编码序列的表达水平差异较大，而且密码子优化位置和优化程度与表达水平之间并无明确的规律，例如：将所有的密码子均优化为腺病毒偏爱密码子的编码序列的表达水平并不是最佳的，相反，个别位点违背腺病毒的密码子偏好性规则设计反而能够获得更优的表达性能。本实施例以设计的不同密码子优化序列中的3条序列为例(序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示)进行密码子优化序列筛选过程的示例性说明。
在如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的密码子优化序列的氨基端引入IL-2的信号肽序列，以便表达的目的蛋白分泌到细胞外，同时在羧基端引入柔性肽序列和His标签肽序列，分别得到如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列。由生工生物工程股份有限公司进行如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的序列的基因合成，得到PCV3 Cap-1、PCV3 Cap-2、PCV3 Cap-3。合成的目的基因置于质粒载体pUC-SP上，即以pUC-SP-Cap-1、 pUC-SP-Cap-2、pUC-SP-Cap-3的形式取得。
2、构建转移载体pShuttle-CMV-Cap
利用同源重组的方式将上述合成的如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的Cap基因插入到pShuttle-CMV载体(质粒图谱如图1所示)，将得到的质粒分别命名为pShuttle-CMV-Cap-1、pShuttle-CMV-Cap-2和pShuttle-CMV-Cap-3，具体构建方法如下：
(1)PCR扩增：通过PCR扩增，使如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5 和SEQ ID NO.6所示的Cap基因插入片段的5’和3’最末端分别带有和线性化pShuttle-CMV载体两末端一致的序列(15-20bp)。PCR扩增的引物如下：
PCV3-CAP-F：5-CAGATCCGCTAGAGATCTGGTACCGCCA CCGCGAATTCCACCATGAATCTG-3；
PCV3-CAP-R：5-GGATCGGATATCTTATCTAGAAGCTTTTAG TGATGGTGATGGTGATGAGAGCC-3。
PCR反应体系和反应条件如表1所示：
表1 PCR反应体系和反应条件
Figure BDA0002113913860000071
PCR扩增后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。
(2)酶切载体：采用KpnI和HindIII两个酶切(购自TAKARA) 对pShuttle-CMV转移载体进行双酶切。双酶切反应体系和条件如表2 所示。
表2双酶切反应体系和条件
Figure BDA0002113913860000072
Figure BDA0002113913860000081
酶切后用琼脂糖核酸电泳分离片段，并切胶回收。
(3)连接：通过PCR扩增使Cap基因插入片段的5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列，之后用Vazyme的
Figure BDA0002113913860000083
II One Step Cloning Kit进行连接，连接反应体系和条件如表3所示。
表3连接反应体系和条件
Figure BDA0002113913860000082
(4)转化：将连接产物转入大肠杆菌感受态DH10B中，涂平板。
(5)提取重组质粒pShuttle-CMV-Cap：从平板上挑取单克隆菌落，采用质粒抽提试剂盒提取质粒，KpnI、HindIII进行酶切鉴定正确后得到含Cap基因的重组转移载体pShuttle-CMV-Cap-1、 pShuttle-CMV-Cap-2和pShuttle-CMV-Cap-3，酶切鉴定结果如图2所示。
实施例2重组腺病毒Ad-PCV3 Cap的构建
1、构建重组腺病毒质粒pAd-PCV3 Cap
将pShuttle-CMV-Cap-1、pShuttle-CMV-Cap-2和 pShuttle-CMV-Cap-3重组质粒用PmeⅠ线性化后，酶切产物回收后，转化到含有骨架载体pAdEasy-1的E.coli BJ5183感受态细胞。挑取含有重组获得的重组腺病毒质粒pAd-PCV3 Cap-1、pAd-PCV3 Cap-2 和pAd-PCV3 Cap-3的阳性克隆，摇菌后提取质粒。用PacⅠ对重组腺病毒质粒pAd-PCV3 Cap-1、pAd-PCV3 Cap-2和pAd-PCV3 Cap-3进行酶切鉴定，鉴定结果如图3所示，并送测序验证。
获取大量pAd-PCV3 Cap重组质粒：取2μl重组转移质粒 pAd-PCV3 Cap-1、pAd-PCV3 Cap-2、pAd-PCV3 Cap-3转入100μl大肠杆菌感受态DH10B中，冰浴30min后，42℃热激1min，再冰浴 3min，加入900μl无抗性的LB，37℃复苏4h，涂布于LB平板(含卡那霉素)中，37℃培养12-16h，挑取单克隆，用去内毒素试剂盒提取重组腺病毒质粒pAd-PCV3 Cap-1、pAd-PCV3 Cap-2、pAd-PCV3 Cap-3。
2、重组腺病毒Ad-PCV3 Cap的包装及扩增
(1)重组腺病毒质粒pAd-PCV3 Cap的线性化：用PacⅠ酶切重组腺病毒质粒pAd-PCV3 Cap-1、pAd-PCV3 Cap-2、pAd-PCV3 Cap-3 后回收30kb左右的大片段。酶切反应体系和条件如表4所示。
表4酶切反应体系和条件
Figure BDA0002113913860000091
(2)重组腺病毒的包装：当HEK-293T细胞生长到80％左右时，按脂质体LipofectaminTM 2000说明书2μg质粒/孔转染，进行重组腺病毒Ad-PCV3 Cap包装。将细胞置于含5％CO2的37℃培养箱中孵育6h后换液，待细胞长满培养皿，将细胞传代于25cm2细胞培养皿中。待细胞长满瓶底时，再传入75cm2细胞培养瓶中，每天观察出毒迹象，即细胞收缩变圆，并伴随有细胞脱落(如图4所示)。转染12-14d后，当出现明显的细胞病变反应，且有50％以上细胞从培养瓶壁脱落后收集细胞，-80℃/37℃反复冻融3次，10000g离心10min，收集病毒上清，即为第一代病毒母液P1，分别命名为重组腺病毒 Ad-PCV3 Cap-1、Ad-PCV3Cap-2和Ad-PCV3 Cap-3。
(4)Western blotting检测目的蛋白Cap的表达：收集重组腺病毒Ad-PCV3 Cap感染的HEK-293T细胞上清，以兔抗PCV3 Cap多抗为一抗，进行Western blotting检测，结果如图5所示，三个重组腺病毒的Cap的表达量各不相同，其中Ad-PCV3 Cap-1表达量最佳，因此选择Ad-PCV3 Cap-1进行下一步的动物实验。
(3)重组腺病毒的扩增及滴度测定：将P1病毒再次感染HEK-293T细胞，感染48h后收集细胞，-80℃/37℃反复冻融3次， 10000g离心10min收集病毒上清，标记为P2。同样方法用P2代病毒感染大量的HEK-293T细胞扩增病毒至P3代。利用CsCl梯度离心法对扩增的病毒进行纯化。将收集的病毒悬液进行病毒滴度的检测，根据CPE，按Reed-Muench法计算病毒滴度，重组腺病毒Ad-PCV3 Cap-1、Ad-PCV3 Cap-2和Ad-PCV3 Cap-3中Ad-PCV3 Cap-1滴度最高，为1.8×109TCID50/mL。
实施例3腺病毒Ad-PCV3 Cap载体疫苗的安全性和免疫原性评价
1、腺病毒Ad-PCV3 Cap载体疫苗在小鼠体内进行安全性评价
购买16-18g雌性Balb/C小鼠10只，分为A、B两组，每组5 只。A组每只小鼠皮下注射108TCID50的实施例2制备的重组腺病毒 Ad-PCV3 Cap-1；B组每只小鼠皮下注射0.1mL灭菌PBS，连续观察 14天，两组小鼠状态相同且均无异常反应，此结果表明由实施例2 的重组腺病毒制备的腺病毒载体疫苗对小鼠是安全的。
2、腺病毒Ad-PCV3 Cap载体疫苗在小鼠体内进行免疫原性评价
购买6-8周龄的雌性Balb/C小鼠10只，随机分成A、B两组，每组5只。A组每只小鼠背部皮下注射108TCID50的实施例2制备的重组腺病毒Ad-PCV3 Cap-1，B组免疫PBS，2周后以相同剂量加强免疫一次。加强免疫2周后，断尾采血取血清，检测特异性抗体水平，结果如图6所示，结果表明，由实施例2的重组腺病毒制备的腺病毒载体疫苗具有较好的免疫原性，能够刺激小鼠产生高水平特异性抗体。
3、腺病毒Ad-PCV3 Cap载体疫苗在猪体内进行安全性评价
购买28日龄断奶仔猪6头，体重6.0±0.4kg，随机分为A、B 两组，隔离饲养，ELISA检测无PCV2、PRRSV、PPV和CSFV抗体。 A组肌肉注射109TCID50的实施例2制备的重组腺病毒Ad-PCV3 Cap-1，B组免疫PBS，连续观察14天，同时每三天测量猪直肠温度，两组仔猪体温均处于正常范围内(38℃-39.5℃)，无异常反应，此结果表明由实施例2的重组腺病毒Ad-PCV3Cap-1制备的腺病毒载体疫苗对本体动物是安全的。
4、腺病毒Ad-PCV3 Cap载体疫苗在猪体内进行免疫原性评价
购买28日龄断奶仔猪8头，体重6.0±0.5kg，随机分为A、B两组，隔离饲养，ELISA检测无PCV2、PRRSV、PPV和CSFV抗体。A组肌肉注射109TCID50的实施例2制备的重组腺病毒Ad-PCV3 Cap-1，B组免疫PBS，2周后以相同剂量加强免疫一次。一免后每隔7d采血一次，共采血5次，检测特异性抗体水平，结果如图7所示，结果表明，由实施例2的重组腺病毒Ad-PCV3Cap-1制备的腺病毒载体疫苗具有较好的免疫原性，能够刺激仔猪产生高水平特异性抗体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 武汉科前生物股份有限公司
<120> 一种表达猪圆环病毒3型ORF2基因的重组腺病毒及制备方法与应用
<130> KHP191112810.4
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgcccaccg ccggcaccta ctacaccaag aagtactcca ccatgaacgt gatcagcgtg 60
ggcacccctc agaacaacaa gccttggcac gctaaccact tcatcacccg cctgaacgag 120
tgggagaccg ccatcagctt cgagtactac aagatcctga agatgaaggt gaccctgagc 180
cctgtgatca gccctgctca gcagaccaag accatgttcg gtcacaccgc catcgacctg 240
gacggtgcct ggaccaccaa cacctggctg caggacgacc cttacgctga aagcagcacc 300
cgtaaggtta tgacctccaa gaagaagcac tcccgctact tcacccctaa gcctatcctg 360
gctggtacta ccagcgctca ccctggccag tccctgttct tcttctcccg tcctacccct 420
tggctgaaca cctacgaccc taccgtgcag tggggcgctc tgctgtggag catctacgtg 480
cctgaaaaga ccggtatgac cgacttctac ggtactaagg aagtgtggat caggtacaag 540
agcgtgctg 549
<210> 2
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgcccaccg ccggcaccta ctacaccaag aaatactcca ccatgaacgt gatctccgtg 60
ggcacccctc agaacaataa gccctggcac gctaaccact tcatcacccg cctgaacgag 120
tgggagaccg ccatcagctt tgagtattat aagatcctga agatgaaggt gaccctgagc 180
cctgtgatct ctccagctca gcagaccaag accatgttcg gtcacaccgc catcgatctg 240
gacggtgcct ggaccaccaa cacctggctg caggacgacc cttacgcgga aagctccacc 300
cgtaaggtta tgacctccaa gaagaagcac agccgctact tcacccccaa gccaatcctg 360
gcgggaacta ccagcgctca cccaggccag agcctgttct ttttctcccg tcctacccca 420
tggctgaaca cctatgaccc caccgtgcag tggggcgctc tgctgtggag catttacgtg 480
cctgaaaaga ccggtatgac cgacttctac ggtactaagg aagtgtggat ccgttacaag 540
tccgttctc 549
<210> 3
<211> 549
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgcccaccg ccggcaccta ctacaccaag aaatactcca ccatgaacgt gatttccgtg 60
ggcacccctc agaacaacaa gccttggcac gctaaccact tcatcacccg cctgaacgag 120
tgggagaccg ccatcagctt cgagtattat aagatcctga agatgaaggt gaccctgagc 180
cctgtgatct ctcctgctca gcagaccaag accatgttcg gtcacaccgc catcgatctg 240
gacggtgcct ggaccaccaa cacctggctg caggacgacc cttacgccga aagcagcacc 300
cgtaaggtta tgacctccaa gaagaagcac agccgctact tcacccctaa gcccatcctg 360
gccggtacta ccagcgctca ccccggccag agcctgttct tcttctcccg tcctacccca 420
tggctgaaca cctatgaccc caccgtgcag tggggcgctc tgctgtggag catttacgtg 480
cctgaaaaga ccggtatgac cgacttctac ggtactaagg aagtgtggat caggtacaag 540
tccgtgctg 549
<210> 4
<211> 680
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gccaccgcga attccaccat gaatctgctg ctcatactga ctttcgtagc tgctgcagta 60
gcacaaagga aaagaagaaa tacaattcat gaattcaagc gcccaccgcc ggcacctact 120
acaccaagaa gtactccacc atgaacgtga tcagcgtggg cacccctcag aacaacaagc 180
cttggcacgc taaccacttc atcacccgcc tgaacgagtg ggagaccgcc atcagcttcg 240
agtactacaa gatcctgaag atgaaggtga ccctgagccc tgtgatcagc cctgctcagc 300
agaccaagac catgttcggt cacaccgcca tcgacctgga cggtgcctgg accaccaaca 360
cctggctgca ggacgaccct tacgctgaaa gcagcacccg taaggttatg acctccaaga 420
agaagcactc ccgctacttc acccctaagc ctatcctggc tggtactacc agcgctcacc 480
ctggccagtc cctgttcttc ttctcccgtc ctaccccttg gctgaacacc tacgacccta 540
ccgtgcagtg gggcgctctg ctgtggagca tctacgtgcc tgaaaagacc ggtatgaccg 600
acttctacgg tactaaggaa gtgtggatca ggtacaagag cgtgctgggt agcggtagcc 660
accaccacca ccatcactaa 680
<210> 5
<211> 680
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccaccgcga attccaccat gaatctgctg ctcatactga ctttcgtagc tgctgcagta 60
gcacaaagga aaagaagaaa tacaattcat gaattcaagc gcccaccgcc ggcacctact 120
acaccaagaa atactccacc atgaacgtga tctccgtggg cacccctcag aacaataagc 180
cctggcacgc taaccacttc atcacccgcc tgaacgagtg ggagaccgcc atcagctttg 240
agtattataa gatcctgaag atgaaggtga ccctgagccc tgtgatctct ccagctcagc 300
agaccaagac catgttcggt cacaccgcca tcgatctgga cggtgcctgg accaccaaca 360
cctggctgca ggacgaccct tacgcggaaa gctccacccg taaggttatg acctccaaga 420
agaagcacag ccgctacttc acccccaagc caatcctggc gggaactacc agcgctcacc 480
caggccagag cctgttcttt ttctcccgtc ctaccccatg gctgaacacc tatgacccca 540
ccgtgcagtg gggcgctctg ctgtggagca tttacgtgcc tgaaaagacc ggtatgaccg 600
acttctacgg tactaaggaa gtgtggatcc gttacaagtc cgttctcggt agcggtagcc 660
accaccacca ccatcactaa 680
<210> 6
<211> 680
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gccaccgcga attccaccat gaatctgctg ctcatactga ctttcgtagc tgctgcagta 60
gcacaaagga aaagaagaaa tacaattcat gaattcaagc gcccaccgcc ggcacctact 120
acaccaagaa atactccacc atgaacgtga tttccgtggg cacccctcag aacaacaagc 180
cttggcacgc taaccacttc atcacccgcc tgaacgagtg ggagaccgcc atcagcttcg 240
agtattataa gatcctgaag atgaaggtga ccctgagccc tgtgatctct cctgctcagc 300
agaccaagac catgttcggt cacaccgcca tcgatctgga cggtgcctgg accaccaaca 360
cctggctgca ggacgaccct tacgccgaaa gcagcacccg taaggttatg acctccaaga 420
agaagcacag ccgctacttc acccctaagc ccatcctggc cggtactacc agcgctcacc 480
ccggccagag cctgttcttc ttctcccgtc ctaccccatg gctgaacacc tatgacccca 540
ccgtgcagtg gggcgctctg ctgtggagca tttacgtgcc tgaaaagacc ggtatgaccg 600
acttctacgg tactaaggaa gtgtggatca ggtacaagtc cgtgctgggt agcggtagcc 660
accaccacca ccatcactaa 680
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cagatccgct agagatctgg taccgccacc gcgaattcca ccatgaatct g 51
<210> 8
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggatcggata tcttatctag aagcttttag tgatggtgat ggtgatgaga gcc 53

Claims (14)

1.一种重组腺病毒转移载体，其特征在于，其含有目的基因片段，所述目的基因片段包含一个或多个拷贝的PCV3的Cap蛋白编码基因，所述PCV3的Cap蛋白编码基因的序列为经密码子优化得到的如SEQ ID NO.1所示的序列。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒转移载体，其特征在于，所述PCV3的Cap蛋白编码基因的5’端和3’端分别连接有IL-2信号肽序列和His标签肽序列。
3.根据权利要求1或2所述的重组腺病毒转移载体，其特征在于，所述目的基因片段的序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1或2所述的重组腺病毒转移载体，其特征在于，所述重组腺病毒转移载体为在CMV启动子后插入序列如SEQ ID NO.4所示的目的基因片段的pShuttle-CMV载体或其衍生载体。
5.根据权利要求3所述的重组腺病毒转移载体，其特征在于，所述重组腺病毒转移载体为在CMV启动子后插入序列如SEQ ID NO.4所示的目的基因片段的pShuttle-CMV载体或其衍生载体。
6.一种重组腺病毒，其特征在于，其含有目的基因片段，所述目的基因片段包含一个或多个拷贝的PCV3的Cap蛋白编码基因，所述PCV3的Cap蛋白编码基因的序列为经密码子优化得到的如SEQ ID NO.1所示的序列。
7.根据权利要求6所述的重组腺病毒，其特征在于，所述PCV3的Cap蛋白编码基因的5’端和3’端分别连接有IL-2信号肽序列和His标签肽序列。
8.根据权利要求6或7所述的重组腺病毒，其特征在于，所述目的基因片段的序列如SEQID NO.4所示。
9.权利要求6～8任一项所述的重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将序列如SEQ ID NO.4所示的目的基因片段插入pShuttle-CMV载体，构建重组腺病毒转移载体；
(2)将所述重组腺病毒转移载体线性化后转入含有骨架载体pAdEasy-1的大肠杆菌中，进行同源重组，得到重组腺病毒质粒；
(3)将所述重组腺病毒质粒线性化后转染至哺乳动物细胞，进行重组腺病毒的包装和扩增，得到所述重组腺病毒。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述将序列如SEQ ID NO.4所示的目的基因片段插入pShuttle-CMV载体采用同源重组的方法。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，采用序列分别如SEQ ID NO.7-8所示的引物扩增所述目的基因片段后与线性化的载体通过同源重组连接。
12.根据权利要求9～11任一项所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为BJ5183菌株，和/或，所述哺乳动物细胞为HEK-293T细胞。
13.权利要求1～5任一项所述的重组腺病毒转移载体或权利要求6～8任一项所述的重组腺病毒在制备PCV3疫苗中的应用。
14.一种PCV3的腺病毒载体疫苗，其特征在于，包含权利要求6～8任一项所述的重组腺病毒。
CN201910584281.2A 2019-07-01 2019-07-01 一种表达猪圆环病毒3型orf2基因的重组腺病毒及制备方法与应用 Active CN110257428B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910584281.2A CN110257428B (zh) 2019-07-01 2019-07-01 一种表达猪圆环病毒3型orf2基因的重组腺病毒及制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910584281.2A CN110257428B (zh) 2019-07-01 2019-07-01 一种表达猪圆环病毒3型orf2基因的重组腺病毒及制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110257428A CN110257428A (zh) 2019-09-20
CN110257428B true CN110257428B (zh) 2020-09-15

Family

ID=67923495

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910584281.2A Active CN110257428B (zh) 2019-07-01 2019-07-01 一种表达猪圆环病毒3型orf2基因的重组腺病毒及制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110257428B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110606873B (zh) * 2019-09-09 2021-05-04 武汉科前生物股份有限公司 猪圆环病毒2d型与3型Cap蛋白二联亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN113416236B (zh) * 2021-05-21 2022-05-03 武汉科前生物股份有限公司 猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其制备方法与应用

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1328373C (zh) * 2005-04-07 2007-07-25 南京农业大学 猪ⅱ型圆环病毒重组腺病毒
CN1769434A (zh) * 2005-08-30 2006-05-10 广东省农业科学院兽医研究所 一种猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法和应用
CN103805573A (zh) * 2013-12-31 2014-05-21 广东大华农动物保健品股份有限公司 一种重组腺病毒rAd-ORF2-TCE及其应用
WO2017066772A1 (en) * 2015-10-16 2017-04-20 Kansas State University Research Foundation Porcine circovirus type 3 immunogenic compositions and methods of making and using the same
CN108619503A (zh) * 2017-03-24 2018-10-09 华南农业大学 一种猪圆环病毒基因工程亚单位疫苗及其制备方法与应用
CN108627648A (zh) * 2017-03-24 2018-10-09 华南农业大学 一种新型猪圆环病毒3型的elisa抗体检测试剂盒及其应用
CN107446895B (zh) * 2017-07-24 2020-05-12 西北农林科技大学 分泌型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法
CN107574182A (zh) * 2017-10-12 2018-01-12 西北农林科技大学 跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法
CN108159409A (zh) * 2017-12-25 2018-06-15 南京大爻网络科技有限公司 一种猪圆环病毒3型Cap蛋白疫苗及其制备方法和应用
CN108611359B (zh) * 2018-05-04 2021-11-19 武汉科前生物股份有限公司 猪圆环病毒3型病毒样颗粒的制备方法及其应用
CN109852622B (zh) * 2019-01-18 2022-05-27 南京农业大学 一种可溶性PCV3Cap蛋白及其编码基因和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110257428A (zh) 2019-09-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111218459B (zh) 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗
CN103930551B (zh) 猴腺病毒和杂合腺病毒载体
CN112625095B (zh) 一种猪轮状病毒重组蛋白以及表达该蛋白的重组腺病毒和应用
CN110551695A (zh) 非洲猪瘟病毒四基因缺失弱毒株及其应用
CN102333876A (zh) 基于pcv 2的用于治疗猪的方法和组合物
CN105056227B (zh) 一种抗口蹄疫病毒的类病毒粒子vlp疫苗及其制备方法
CN113881704A (zh) 一种包含新型冠状病毒双抗原靶标序列组合的重组新城疫病毒载体及相应疫苗株和疫苗
WO2023092863A1 (zh) 一种非洲猪瘟病毒asfv基因的重组病毒组合及由其制备的疫苗
CN107227311B (zh) 重组猪细小病毒样粒子及其制备方法和应用
CN110257428B (zh) 一种表达猪圆环病毒3型orf2基因的重组腺病毒及制备方法与应用
CN103305542B (zh) 一种重组噬菌体双表达载体及应用
CN111040024A (zh) 4型禽腺病毒基因工程疫苗及其制备方法与应用
CN106318955B (zh) 表达人肠道病毒71型衣壳蛋白的重组腺病毒、由其制备的疫苗和应用
CN110358741B (zh) 一种表达猪塞内卡病毒vp2基因的重组杆状病毒及其制备方法与应用
CN111454989A (zh) 一种嵌合型基因i型乙型脑炎病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
WO2022122036A1 (zh) 一种SARS-CoV-2病毒的免疫原、药物组合物及其应用
CN112891528B (zh) 一种鸡传染性支气管炎疫苗株
CN110295190A (zh) 用汉逊酵母表达系统产生hpv45 l1蛋白的方法
CN113248576A (zh) 一种针对冠状病毒的核酸疫苗及其制备方法
CN116102660B (zh) 一种猪细小病毒基因工程表位疫苗及其制备方法
CN116492455B (zh) 非洲猪瘟病毒k421r基因及利用其制备的复制缺陷型非洲猪瘟疫苗
CN116492456B (zh) 非洲猪瘟病毒d129l基因及其在制备复制缺陷型非洲猪瘟疫苗中的应用
CN116024244B (zh) 一种融合蛋白基因及其应用
CN116904489B (zh) 一种鸭坦布苏病毒核酸疫苗及应用
CN113388641B (zh) 一种禽4型腺病毒载体、构建方法及其减毒活疫苗和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant