CN107574182A - 跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法。所述重组腺病毒是利用重组腺病毒质粒进行腺病毒包装而得到的，所述重组腺病毒质粒由上述跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体同源重组形成。重组腺病毒穿梭载体插入有目的基因片段包括Intron A、共表达分泌型CD40L、跨膜型PCV2 Cap和分泌型GMC SF以及WPRE。通过提高蛋白表达量，以及使CD40L、Cap和GMCSF可以共表达，CD40L和GMCSF分泌到细胞外，Cap镶嵌到细胞膜上，更好更快地被抗原呈递细胞识别。该重组腺病毒结合两种不同作用机制，可增强腺病毒载体疫苗免疫原性。

Description

跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法

技术领域

本发明属于基因工程疫苗领域，具体涉及跨膜型猪圆环病毒2型(PCV2)重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W的构建。

背景技术

腺病毒具有致病力低、宿主范围广、稳定性好、易进行重组DNA操作、病毒滴度高、易于浓缩和贮存以及能容纳较大基因片段等优点，而且其生物学背景已研究得相当清楚，因而腺病毒载体在疫苗制备、癌症、传染病和遗传病的基因治疗等方面被广泛研究和应用，被认为是最有前途的载体之一。

腺病毒作为一种常用的疫苗载体，其最大的问题是腺病毒自身蛋白可以诱导宿主产生强烈的免疫应答反应，从而限制了这种疫苗在临床实践中的应用。

降低腺病毒自身免疫反应的方法之一是提高目的蛋白的表达量，从而降低腺病毒免疫剂量，进而降低腺病毒自身免疫反应。人巨细胞病毒第一内含子Intron A作为转录调节元件，与hCMV启动子/增强子一同提高缺失内含子的目的基因的表达。内含子可能通过几种不同机制来提高基因表达效率，这些机制通常分为两类：一类是保护机制；另一类是增强机制。保护机制强调内含子的保护能力，认为内含子的某些序列能够通过自身折叠或者结合其他蛋白形成一种二级结构从而达到稳定初级转录本的目的。另外内含子序列还可以作为RNA保护因子的靶序列来稳定初级转录本，间接增加了mRNA在核内的稳定性，导致细胞质中积累更多的成熟mRNA，进而增强目的基因的表达效率。增强机制则强调内含子的促转录能力。某些内含子有这样一些序列，能够起到类似增强子或其他顺式调控元件的功能，它们同某些蛋白质结合从而影响其转录的起始和延伸，开放染色体的功能域。另一个调控基因表达的元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件WPRE，主要作用是增加mRNA的稳定性、3'端的加工、促进mRNA出核以及胞质中mRNA的积累，从而增强未经剪接的目的基因表达量。

另一个方法是增强腺病毒载体疫苗的免疫效果，常用方法是引入细胞因子作为分子佐剂以增强疫苗免疫效果。CD40L是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族成员之一，CD40是其受体。CD40-CD40L交联不仅在体液免疫中扮演重要角色，而且在调节细胞介导的免疫应答中也发挥重要的作用。一方面CD40-CD40L交联对B细胞的活化、增殖，抗体的产生以及Ig类别转换，起了非常重要的作用。另一方面CD40-CD40L交联可促进CD4⁺T细胞自身被活化，表达CD25、CD40L增高，促进IL-12的跨膜，而后者参与CTL的产生以及诱导T细胞向Th l细胞分化。另一个细胞因子是GMCSF，其不仅能刺激造血祖细胞增殖、分化和成熟，而且还能活化中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞(dendritic cells,DC)及其他单核细胞，在细胞因子网络中占有重要地位。GMCSF能够诱导造血前体细胞分化增殖，维持造血前体细胞和成熟血细胞的存活，增强DC的活性和生物学功能，促进皮肤中朗罕氏细胞的增殖分化，吸引DC向注射部位集聚和成熟，并提高其抗原递呈能力，从而起到增强疫苗免疫效果的作用。

猪圆环病毒相关性疾病(porcine circovirus associated disease，PCVAD)是猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)引起的流行非常广泛的猪传染性疾病。1991年加拿大首次暴发该病，随后许多国家报道了该病，PCVAD已经给养猪业造成巨大经济损失。PCV2重组腺病毒载体疫苗已经有人进行过相关研究，例如未修饰的PCV2重组腺病毒载体疫苗Ad-Cap，但是还没有相应的商品化PCV2重组腺病毒载体疫苗应用于临床实践。分析原因得出：腺病毒载体自身蛋白可以诱导机体产生强烈的免疫应答反应，严重影响机体针对目的蛋白免疫应答反应。

发明内容

本发明的目的在于提供一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体，该重组腺病毒穿梭载体为插入有目的基因片段的腺病毒穿梭质粒，所述目的基因片段包括蛋白编码区以及增强表达元件，所述增强表达元件包括人巨细胞病毒第一内含子Intron A以及土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE，所述蛋白编码区包括带有分泌信号肽sp的肿瘤坏死因子相关激活蛋白CD40L(分泌型CD40L)序列、带有跨膜信号肽tp的猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap(跨膜型PCV2Cap)序列以及带有分泌信号肽sp的粒细胞-巨细胞集落刺激因子GMCSF(分泌型GMCSF)序列，所述CD40L、Cap以及GMCSF为共表达。

所述蛋白编码区还包括设置在所述CD40L、Cap以及GMCSF序列两两之间的自剪切2A肽的序列。

所述重组腺病毒穿梭载体具体包括依次排列的启动子、目的基因片段、polyA尾以及左、右两个同源臂序列。

上述跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体的构建方法，包括以下步骤：

1)构建目的基因片段

1.1)将所述CD40L序列、所述Cap序列、所述GMCSF序列三个片段，利用重叠PCR进行连接，得到中间片段，且其中任意两个片段之间插入有自剪切2A肽的序列；

1.2)将所述中间片段与Intron A及WPRE连接，得到目的基因片段；

2)将目的基因片段克隆至腺病毒穿梭质粒。

所述步骤1.1)具体包括以下步骤：

1.1.1)以pS-CD40L-Cap-GMCSF质粒为扩增模板，通过引物P1和P2、P3和P4及P7和P8分别扩增得到包含有所述CD40L序列的sp-CD40L-2A-tp片段、包含有所述Cap序列的tp-Cap-2A-sp片段及包含有所述GMCSF序列的sp-GMCSF片段；P1的序列如SEQ.ID.NO.1所示，P2的序列如SEQ.ID.NO.2所示，P3的序列如SEQ.ID.NO.3所示，P4的序列如SEQ.ID.NO.4所示，P7的序列如SEQ.ID.NO.7所示，P8的序列如SEQ.ID.NO.8所示；

1.1.2)将sp-CD40L-2A-tp片段及tp-Cap-2A-sp片段通过引物P5和P6进行重叠PCR，得到sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp片段，然后将sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp片段及sp-GMCSF片段通过引物P5和P8进行重叠PCR，得到中间片段sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp-GMCSF；P5的序列如SEQ.ID.NO.5所示，P6的序列如SEQ.ID.NO.6所示。

所述步骤1.2)具体包括以下步骤：将puc-Intron A-Cap-WPRE质粒中的Cap序列用所述中间片段(例如，sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp-GMCSF)替换，得到扩增模板，然后通过引物P9和P10扩增得到目的基因片段；P9的序列如SEQ.ID.NO.9所示，P10的序列如SEQ.ID.NO.10所示。

所述步骤2)的具体包括以下步骤：将目的基因片段插入至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV的多克隆位点。

一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒，所述重组腺病毒是利用重组腺病毒质粒进行腺病毒包装而得到的，所述重组腺病毒质粒由上述跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体同源重组形成。

所述重组腺病毒质粒的序列如SEQ.ID.NO.11所示。

上述跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体在制备猪圆环病毒2型基因工程疫苗中的用途。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过将Intron A和WPRE添加到腺病毒载体中，提高衣壳蛋白(Cap)表达量；同时引入CD40L和GMCSF，并且添加分泌型信号肽，使CD40L和GMCSF可以共表达并分泌到细胞外，Cap的N端添加跨膜型信号肽，使Cap表达并镶嵌到细胞膜上，更好更快地被抗原呈递细胞识别。以此构建跨膜型PCV2重组腺病毒结合两种不同作用机制，可增强腺病毒载体疫苗免疫原性。

附图说明

图1为pShuttle-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W PCR鉴定结果；泳道1：pShuttle-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W；泳道2：2KPlus Marker；泳道3：阴性对照(pShuttle-CMV)。

图2为重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W感染HEK293细胞48h照片；A：Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W；B：正常细胞对照。

图3为Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W western blotting鉴定结果；A：兔抗Cap一抗；B：兔抗CD40L一抗；C：兔抗GMCSF一抗；泳道1：Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W；泳道2：Ad-blank；泳道3：正常细胞对照。

图4为腺病毒穿梭载体pShuttle-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W的构建示意图；A：pShuttle-CMV图谱；B：多克隆位点(MCS)上限制性内切酶酶切位点分布；C：腺病毒穿梭载体上片段A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W的插入位置。

图5为重组腺病毒载体pAd-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W图谱。

图6为重组腺病毒免疫猪PCV2特异性抗体水平检测结果；*代表相同时间点Ad-Cap免疫组和Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W免疫组差异显著(p<0.05)。

图7为重组腺病毒免疫猪中和抗体水平检测结果；*代表相同时间点Ad-Cap免疫组和Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W免疫组差异显著(p<0.05)。

图8为重组腺病毒免疫猪淋巴细胞增殖水平检测结果；*代表相同时间点Ad-Cap免疫组和Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W免疫组差异显著(p<0.05)。

图9为重组腺病毒免疫猪IFN-γ(A)和IL-13(B)跨膜水平检测结果；*代表相同时间点Ad-Cap免疫组和Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W免疫组差异显著(p<0.05)。

图10为攻毒后重组腺病毒免疫猪血清病毒载量检测结果；*代表相同时间点Ad-Cap免疫组和Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W免疫组差异显著(p<0.05)，实时荧光定量PCR检测敏感度为10³拷贝数/毫升。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

腺病毒载体因其转导效率高、宿主细胞范围广以及可以感染不同时期细胞等优点成为应用最为广泛的活病毒载体之一。但是由于腺病毒自身蛋白(主要是腺病毒五邻体蛋白和六邻体蛋白)可以诱导宿主产生强烈的免疫应答反应，从而限制了这种疫苗在临床实践中的应用，如何降低自身免疫应答反应成为重组腺病毒载体疫苗规模化应用必须解决的关键科学问题。

本发明通过将人巨细胞病毒第一内含子(human cytomegalovirus firstintron，Intron A)和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(woodchuck hepatitis viruspost-transcriptional regulatory element，WPRE)添加到腺病毒载体中，提高PCV2Cap表达量；同时引入肿瘤坏死因子相关激活蛋白(tumor necrosis factor relatedactivation protein，TRAP/CD40L)和粒细胞-巨细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GMCSF)，并且在CD40L和GMCSF N端分别添加猪IL-2分泌信号肽(secretory signal peptide，sp)，从而使CD40L和GMCSF可以分泌到细胞外，在Cap N端添加猪CD8A跨膜信号肽(transmembrane signal peptide，tp)，使Cap可以镶嵌到细胞膜上，更好更快地被抗原呈递细胞识别，并且在CD40L和Cap的C端添加猪口蹄疫病毒2A，以便3个蛋白可以被2A蛋白酶剪切，避免形成融合蛋白，以此构建跨膜型PCV2重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W。结合两种不同作用机制，增强腺病毒载体疫苗免疫原性。

跨膜型PCV2重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W构建步骤如下：

一、目的基因A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W的克隆

1.设计sp-CD40L-2A-tp、tp-Cap-2A-sp和sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp的扩增引物。

sp-CD40L-2A-tp上游引物P1：5'-AATTCTAGAATGTATAAGATGCAGCTCTTGTGTTGCATTGCACTAACCCTTGCACTCATGGCAAACGGTATGATCGAAACGTACAGC-3'(5'端下划线部分为Xba I限制性内切酶酶切位点，斜体部分为分泌信号肽序列)；下游引物P2：5'-CCCGAGGACCTTGGCGGGATGGAGCTGCAGGACCAGCGGCAGGAGCAGAGCGGTCACCAGCGAGGCCATGGGTCCAGGGTTGGACTCAA-3'(5'端斜体部分为跨膜信号肽序列)；

tp-Cap-2A-sp上游引物P3：5'-ATGGCCTCGCTGGTGACCGCTCTGCTCCTGCCGCTGGTCCTGCAGCTCCATCCCGCCAAGGTCCTCGGGAATGGCTTTTTCAACAGCCG-3'(5'端斜体部分为跨膜信号肽序列)；下游引物P4：5'-ACCGTTTGCCATGAGTGCAAGGGTTAGTGCAATGCAACACAAGAGCTGCATCTTATACATGGGTCCAGGGTTGGACTCAA-3'(5'端斜体部分为分泌信号肽序列)；

sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp上游引物P5：5'-AATTCTAGAATGTATAAGATGCAGCTCTTG-3'(5'端下划线部分为Xba I限制性内切酶酶切位点)；下游引物P6：5'-ACCGTTTGCCATGAGTGCAAGGGTTAGTG-3'。

2.以PS-CD40L-Cap-GMCSF质粒(由本实验室构建及保存，构建参考文献：DelongLi etal,CD 40Ligand and GMCSF Coexpression Enhance the Immune Responses andProtective Efficacy of PCV2Adenovirus Vaccine,VIRAL IMMUNOLOGY 2016,Volume29,Pp.148-158,DOI10.1089/vim.2015.0109)为模板，以引物P1和P2扩增sp-CD40L-2A-tp(片段大小为963bp)；以引物P3和P4扩增tp-Cap-2A-sp(片段大小为759bp)。以sp-CD40L-2A-tp和tp-Cap-2A-sp为模板，以引物P5和P6经重叠PCR扩增sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp(片段大小为1653bp)。其中，扩增体系参见表1，反应条件参见表2。

表1.PCR反应体系

表2.PCR反应条件

3.设计基因sp-GMCSF扩增引物。sp-GMCSF上游引物P7：5'-ATGTATAAGATGCAGCTCTTGTGTTGCATTGCACTAACCCTTGCACTCATGGCAAACGGTATGTGGCTGCAGAACCTGCT-3'(5'端斜体部分为分泌信号肽序列)；下游引物P8：5'-ATTGTCGACTTACTTTTTGAC-3'(5'端下划线部分为SalI限制性内切酶酶切位点)。

4.以PS-CD40L-Cap-GMCSF质粒为模板，以引物P7和P8扩增sp-GMCSF(片段大小为495bp)；以sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp和sp-GMCSF为模板，以引物P5和P8经重叠PCR扩增sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp-GMCSF(片段大小为2088bp)。其中，扩增体系和PCR反应条件参考表1和表2。

核酸电泳回收sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp-GMCSF(片段大小为2088bp)，Xba I和Sal I双酶切sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp-GMCSF和puc-Intron A-Cap-WPRE质粒(由本实验室构建及保存，构建参考文献：D.L.LI etal,Modified recombinant adenovirusesincrease porcine circovirus 2capsid protein expression and induce enhancedimmune responses in mice,Acta virologica 60:271-280,2016,doi10.4149/av_2016_03_271)后，用T4DNA连接酶16℃过夜连接，转化入大肠杆菌感受态DH5α(北京索莱宝科技有限公司)，37℃恒温箱培养过夜，Amp⁺平板抗性筛选，挑取单克隆，220rpm、37℃恒温摇床(LB培养基)摇菌12h，用质粒提取试剂盒提取质粒，菌液PCR和酶切(Xba I和Sal I)鉴定正确后(4110bp和2088bp)送测序，测序正确后命名为puc-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W(即以sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp-GMCSF片段替换puc-Intron A-Cap-WPRE中原有的Cap序列)。其中，电泳条件为120V，30min；双酶切体系参见表3，连接体系参见表4。

表3.双酶切体系

表4.连接体系

二、穿梭载体pShuttle-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W的构建

以puc-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W质粒为模板，PCR反应扩增A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W(片段大小为3488bp，即Intron A-sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp-GMCSF-WPRE)。所用引物分别为上游引物P9：5'-AATCTCGAGGTAAGTACCGCCTATAGACTCTATAGGCAC-3'(5'端下划线部分为Xho I限制性内切酶酶切位点)；下游引物P10：5'-TCAGATATCGCCCAAAGGGAGATCCGACTC-3'(5'端下划线部分为EcoR V限制性内切酶酶切位点)。其中，PCR扩增体系参见表1，反应条件参见表2。

参见图4，A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W PCR产物用核酸胶回收试剂盒回收后，用限制性内切酶Xho I和EcoR V双酶切A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W和pShuttle-CMV(Agilent Technologies公司，7.5kb)，然后将目的基因A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W(geneof interest)连接到pShuttle-CMV，转化大肠杆菌感受态DH5a，37℃过夜培养后，Kana⁺平板抗性筛选，挑取单克隆，37℃摇床摇菌12h，质粒提取试剂盒提取质粒，提取的质粒用菌液PCR和Xho I和EcoR V酶切鉴定，鉴定正确(7500bp和3 500bp，如图1所示)后送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，测序正确后命名为pShuttle-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W，即在pShuttle-CMV的多克隆位点内，利用Xho I和EcoR V在CMV下游依次插入Intron A、sp、CD40L、2A、tp、PCV2Cap、2A、sp、GMCSF、WPRE，插入位置下游为SV40polyA。其中，双酶切体系(除内切酶)参见表3，连接体系参见表4。

三、重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W的包装

用限制性内切酶Pme I线性化pShuttle-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W后，与骨架载体AdEasy-1(Agilent Technologies公司)在BJ5183株感受态细胞(AgilentTechnologies公司)中进行同源重组(homologous recombination)，Kana⁺平板抗性筛选)，挑选阳性克隆提取质粒，菌液PCR和Pac I酶切鉴定(约30000bp和约5000bp)正确的质粒命名为pAd-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W(图5)。质粒大量提取试剂盒提取质粒并测定质粒浓度。

线性化：用Pac I酶切pAd-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W，核酸胶回收试剂盒回收酶切后的质粒。

将HEK293细胞(Agilent Technologies公司)培养于含10％FBS DMEM培养液中，转染前1d均匀铺于24孔板，每孔约5×10⁴个。铺板24h后，按照Lipofectamine^TM 2000转染试剂盒操作说明，采用脂质体法将重组腺病毒载体pAd-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W转染HEK293细胞，具体转染方法如下：(1)将线性化重组腺病毒质粒溶于50μL无血清无抗生素的Medium培养液中，轻轻混匀，并在室温下孵育5min；(2)将适量Lipofectamine^TM2000溶于50μL无血清无抗生素的Medium培养液中，混匀并在室温下孵育5min；(3)将上述两种混合物混合(总体积100μL)，轻轻混匀，在室温下孵育20min(不能出现雾状沉淀)；(4)上述操作同时，将待转染细胞用PBS清洗两次，在每孔(24孔板)中加入100μL无血清无抗生素的Medium培养液，待DNA质粒/Lipofectamine复合物混合20min后，立即加入待转染细胞孔中，并混匀，然后将细胞于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养，约4h后更换为含2％FBS的DMEM细胞培养液，继续培养，并定期用显微镜观察细胞生长情况。转染后7～10d收取细胞转入15mL离心管中，反复冻融3次裂解细胞，短暂离心后收集腺病毒上清(即离心所得上清液)，即第1代重组腺病毒，-80℃保存，将重组腺病毒命名为Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W。

四、重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W western blotting鉴定

第1代重组腺病毒病毒滴度较低，需要连续传代以增殖病毒(增殖病毒过程参见中国专利201610164590.0)，通过连续传代。以第5代腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W和空载体腺病毒Ad-blank(空载体腺病毒对照)感染HEK293细胞约48h出现细胞病变效应(图2)后收取细胞上清(离心所得上清液)。

1.测定细胞上清蛋白浓度

采用Bradford法蛋白定量试剂盒测定细胞上清蛋白含量。具体方法为：分别在96孔板的0～6号孔分别加入l mg/mL的蛋白标准液0μL、1μL、2μL、4μL、6μL、8μL和10μL，之后分别在0～6号孔加入去离子水100μL、99μL、98μL、96μL、94μL、92μL和90μL。同时，于另外孔中加入10倍稀释的待测蛋白样品100μL。每孔加入考马斯亮蓝G-250染液100μL，震荡混匀后室温放置10min。用酶标仪测定595nm波长吸光度，以0号孔作为空白对照。根据标准曲线方程确定待测蛋白样品的浓度。

2.SDS-PAGE电泳

将收集的正常HEK293细胞、重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W和Ad-blank感染的HEK293细胞的细胞上清与5×上样缓冲液按l:4混合，于微量恒温器上100℃加热煮沸10min。按顺序在上样孔中加入煮沸处理的蛋白样品，预染蛋白质Marker对照。用90V恒定电压开始电泳约30min，待溴酚蓝到达浓缩胶与分离胶分界线时，将电压改为120V，电泳至溴酚蓝达到距离分离胶底部约1cm时停止电泳。

3.转膜

根据凝胶大小，带手套剪6张定性滤纸和一张PVDF膜，做记号，与海绵一起浸入转移缓冲液中。并将胶切角做记号。依次按如下顺序：海绵—滤纸(3张)—膜—胶—滤纸(3张)—海绵叠好，并且要精确对齐，确保没有气泡。然后浸入转移缓冲液，膜一边接正极，凝胶一边接负极，300mA恒流转膜1.5h。关闭电源，取出膜，将膜蛋白面向上空气中干燥25min。

4.抗体孵育

转膜结束后，将膜取出，放入PBST中洗涤5次，5％脱脂奶粉室温于摇床上封闭PVDF膜l h。封闭结束后，用PBST洗涤3次，每次5min。PBS稀释兔抗Cap、兔抗CD40L和兔抗GMCSF一抗于封闭好的PVDF膜，4℃过夜孵育，PBST洗3次，每次10min。用PBS稀释HRP标记的羊抗兔二抗(1:10 000)室温孵育1h，PBST洗3次。

5.化学发光、显影

将ECL显色液A和B两种试剂在保鲜膜上按1:1等体积混合，再将膜蛋白面朝下与混合液充分接触1min，将膜移至另一保鲜膜上，包好，放入暗盒中。于暗室显色，避免背景过重。显色结束后，将胶片拍照。如图3所示，可以看出CD40L、Cap和GMCSF均可以表达，结论是跨膜型PCV2重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W构建成功。

重组腺病毒包装过程以及腺病毒增殖过程就是疫苗制备过程，疫苗纯化过程参见中国专利201610164590.0。

五、疫苗免疫效果评价

5.1实验动物分组

28日龄断奶仔猪25头，体重5.5±0.8kg，随机分为5组，每组5头，隔离饲养。商品化ELISA试剂盒检测无PCV2、PPV、PRRSV和CSFV抗体，PCR检测无PCV2、PPV、PRRSV和CSFV病毒血症。第1组肌肉注射10¹¹TCID₅₀重组腺病毒Ad-Cap。第2组肌肉注射10¹⁰TCID₅₀重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W。第3组肌肉注射10¹⁰TCID₅₀空载体腺病毒Ad-blank。第4组为PBS组。第5组为空白对照组(untreatedcontrol)。2w后以相同剂量加强免疫1次。一免后28d，组1～组5滴鼻攻毒PCV2 5×10⁵TCID₅₀。一免后70d处死猪。一免后每隔7d采血1次，测定特异性抗体水平与中和抗体水平。一免后28d，分离猪外周血淋巴细胞，测定淋巴细胞增殖水平和细胞因子水平。从一免后28d开始，每隔7d检测病毒载量1次。

5.2结果

5.2.1特异性抗体水平

参见图6，一免后0d至一免后70d，商品化ELISA试剂盒检测PCV2Cap特异性抗体水平。一免后14d，Ad-Cap免疫组和Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W免疫组特异性抗体转为阳性，一免后35d达到最高峰。一免后14d至一免后70d，Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W免疫组特异性抗体显著高于Ad-Cap免疫组(p<0.05)。

5.2.2中和抗体水平

参见图7，一免后14d，Ad-Cap免疫组和Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W免疫组中和抗体转为阳性，一免后35d达到最高峰。一免后21d至一免后70d，Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W免疫组中和抗体显著高于Ad-Cap免疫组(p<0.05)。

5.2.3淋巴细胞增殖水平

参见图8，一免后28d检测各组猪外周血淋巴细胞增殖水平。Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W免疫组淋巴细胞增殖水平显著高于Ad-Cap免疫组(p<0.05)。

5.2.4细胞因子水平

参见图9，一免后28d检测各组增殖的淋巴细胞IFN-γ和IL-13分泌量。Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W免疫组IFN-γ和IL-13分泌量显著高于Ad-Cap免疫组(p<0.05)。

5.2.5病毒载量检测

参见图10，一免后28d至一免后70d，检测血清中病毒载量水平。一免后28d，各组血清没有检测到PCV2。一免后42d和一免后49d，Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W免疫组病毒载量显著低于Ad-Cap免疫组(p<0.05)。

由以上得出，尽管免疫所用病毒滴度低一个数量级，针对PCV2，重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W的免疫原性增强(与仅利用非跨膜型PCV2Cap相比)。

5.3其他实验结果

本发明还以另外三组重组腺病毒Ad-A-spCap-W、Ad-A-CD40L-Cap-GMCSF-W、Ad-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W与重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W进行了比较。在相同的病毒滴度下，Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W的免疫效果(特异性抗体水平、中和抗体水平、淋巴细胞增殖水平、细胞因子水平、病毒载量)均显著优于Ad-A-spCap-W、Ad-A-CD40L-Cap-GMCSF-W及Ad-A-spCD40L-spCap-spGMCSF-W，而Ad-Cap则与Ad-A-spCap-W、Ad-A-CD40L-Cap-GMCSF-W无显著差异。本发明的优点如下：

1.Intron A作为基因转录调节元件，与hCMV(人巨细胞病毒)启动子(pShuttle-CMV上的CMV)一同提高目的基因表达量。WPRE能通过提高mRNA的稳定性、3'末端的加工、促进mRNA出核和胞质中mRNA的积累，增强基因表达效率。Intron A和WPRE添加到腺病毒载体中，可以提高PCV2Cap表达量，从而降低腺病毒疫苗免疫剂量，但不影响针对Cap蛋白免疫效果。

2.在已知Intron A和WPRE可以提高蛋白表达量，CD40L和GMCSF可以进行免疫调节的情况下，本专利主要解决了如何充分发挥二者的优势，从而能够结合两种不同机制实现增前重组腺病毒免疫效果的难题。从实验结果5.2证明了，重组腺病毒Ad-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W的确解决了这一难题，而进一步结合实验结果5.3，可以看出，为了结合两种不同作用机制诱导更强的免疫应答反应；需要重组腺病毒进入宿主细胞后，将表达的CD40L和GMCSF分泌到细胞外，才可以更好地发挥免疫调节功能，镶嵌到细胞膜的Cap也可以更好地被抗原呈递细胞识别，从而实现增强的免疫效果。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 87

<212> DNA

<213> 引物P1()

<400> 1

aattctagaa tgtataagat gcagctcttg tgttgcattg cactaaccct tgcactcatg 60

gcaaacggta tgatcgaaac gtacagc 87

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> 引物P2()

<400> 2

cccgaggacc cttggcggga tggagctgca ggaccagcgg caggagcaga gcggtcacca 60

gcgaggccat gggtccaggg ttggactcaa 90

<210> 3

<211> 90

<212> DNA

<213> 引物P3()

<400> 3

atggcctcgc ctggtgaccg ctctgctcct gccgctggtc ctgcagctcc atcccgccaa 60

ggtcctcggg aatggctttt tcaacagccg 90

<210> 4

<211> 80

<212> DNA

<213> 引物P4()

<400> 4

accgtttgcc atgagtgcaa gggttagtgc aatgcaacac aagagctgca tcttatacat 60

gggtccaggg ttggactcaa 80

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物P5()

<400> 5

aattctagaa tgtataagat gcagctcttg 30

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物P6()

<400> 6

accgtttgcc atgagtgcaa gggttagtg 29

<210> 7

<211> 80

<212> DNA

<213> 引物P7()

<400> 7

atgtataaga tgcagctctt gtgttgcatt gcactaaccc ttgcactcat ggcaaacggt 60

atgtggctgc agaacctgct 80

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物P8()

<400> 8

attgtcgact tactttttga c 21

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物P9()

<400> 9

aatctcgagg taagtaccgc ctatagactc tataggcac 39

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物P10()

<400> 10

tcagatatcg cccaaaggga gatccgactc 30

<210> 11

<211> 37680

<212> DNA

<213> pAd-A-spCD40L-tpCap-spGMCSF-W

<400> 11

nnnttaatta annntccctt ccagctctct gccccttttg gattgaagcc aatatgataa 60

tgagggggtg gagtttgtga cgtggcgcgg ggcgtgggaa cggggcgggt gacgtagtag 120

tgtggcggaa gtgtgatgtt gcaagtgtgg cggaacacat gtaagcgacg gatgtggcaa 180

aagtgacgtt tttggtgtgc gccggtgtac acaggaagtg acaattttcg cgcggtttta 240

ggcggatgtt gtagtaaatt tgggcgtaac cgagtaagat ttggccattt tcgcgggaaa 300

actgaataag aggaagtgaa atctgaataa ttttgtgtta ctcatagcgc gtaannnnta 360

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 420

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 480

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 540

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 600

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 660

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 720

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 780

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 840

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 900

ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt 960

cgacgcggcc gctcgaggta agtaccgcct atagactcta taggcacacc cctttggctc 1020

ttatgcatgc tatactgttt ttggcttggg gcctatacac ccccgctcct tatgctatag 1080

gtgatggtat agcttagcct ataggtgtgg gttattgacc attattgacc actcccctat 1140

tggtgacgat actttccatt actaatccat aacatggctc tttgccacaa ctatctctat 1200

tggctatatg ccaatactct gtccttcaga gactgacacg gactctgtat ttttacagga 1260

tggggtccca tttattattt acaaattcac atatacaaca acgccgtccc ccgtgcccgc 1320

agtttttatt aaacatagcg tgggatctcc acgcgaatct cgggtacgtg ttccggacat 1380

gggctcttct ccggtagcgg cggagcttcc acatccgagc cctggtccca tgcctccagc 1440

ggctcatggt cgctcggcag ctccttgctc ctaacagtgg aggccagact taggcacagc 1500

acaatgccca ccaccaccag tgtgccgcac aaggccgtgg cggtagggta tgtgtctgaa 1560

aatgagctcg gagattgggc tcgcaccgtg acgcagatgg aagacttaag gcagcggcag 1620

aagaagatgc aggcagctga gttgttgtat tctgataaga gtcagaggta actcccgttg 1680

cggtgctgtt aacggtggag ggcagtgtag tctgagcagt actcgttgct gccgcgcgcg 1740

ccaccagaca taatagctga cagactaaca gactgttcct ttccatgggt cttttctgca 1800

gatgtataag atgcagctct tgtgttgcat tgcactaacc cttgcactca tggcaaacgg 1860

tatgatcgaa acgtacagcc aaccttcgcc ccgctctgtg gccgctggac cacccgtcag 1920

tatgaaaatc tttatgtatt tacttactgt ttttcttatc acccagatga ttgggtcagc 1980

actttttgca gcgtaccttc acagaagatt ggacaagata gaagatgaaa ggaatcttca 2040

tgaagatttt gtgttcataa aaacgataca gagatgcaag caaggagagg ggtccttatc 2100

cttattgaac tgtgaggaaa tcagaagcca gtttgaagac ctggtcaagg gtataatgca 2160

aagcaaagaa gtgaagaaga aagaaaaaag ctttgaaatg cacaaaggcg atcaggatcc 2220

tcaaattgcg gcacatgtca taagcgaggc cagtagtaaa acagcatctg tcctgcagtg 2280

ggcccccaaa gggtactaca ccctcagcac caacttggtg accctggaaa acgggagaca 2340

gctggccgtc aaaagacaag gaatctatta catctacgcc caagtcacct tctgctccaa 2400

ccgggacgcc gcgggtcaag ctcccttcat agccagcctc tgcctgaggt ccccaagcgg 2460

gtcggagaga atcttactcc gcgcggccaa cacccacagt tcctccaagc cctgcgggca 2520

gcaatccatt cacttgggcg gagtcttcga gttgcaaccc ggcgcttcgg tgttcgtcaa 2580

cgtgactgat ccaagccaag tgagccacgg gaccggcttc acgtcttttg gcctcctcaa 2640

actcaacttt gaccttctca agttggcagg ggacgttgag tccaaccctg gaccccccga 2700

ggaccttggc gggatggagc tgcaggacca gcggcaggag cagagcggtc accagcgagg 2760

ccataatgga ctttttcaac agccgcctct cccgcacctt cggatatact gtcaaggcta 2820

ccacagtcac aacgccctcc ggggcggggg acatgctcaa atttaatatt gacgactttc 2880

ttccccgggg aggggggacc aacaaaatct ctataccctt tgaatactac aaaataaaaa 2940

aggttaaggt tgaattctgg ccctgctccc caatcaccca gggggacagg ggagttggat 3000

ccagtgctgt tattctaaat gataattttt tccctaagtc cacagcccta acctatgacc 3060

cctacgtaaa ctactcctcc cgccatacca taccccagcc cttctcctac cactcccggt 3120

actttacccc caaacctgtc cttgattcca ccattgatta cttccaaccg aataacaaaa 3180

gaaatcagct gtggatgaaa attcaaacca gtaaaaatgt aaaccacgta ggcctcggca 3240

ctgcgttcga aaacagtaaa tacaaccagg actacaatat ctgtgtaacc atgtatgtac 3300

aattcagaga atttaatctg aaagaccccc cactaaaacc caactttgac cttctcaagt 3360

tggcagggga cgttgagtcc aaccctggac ccatgtataa gatgcagctc ttgtgttgca 3420

ttgcactaac ccttgcactc atggcaaacg gtatgtggct gcagaacctg cttctcctgg 3480

gcactgtggt ctgcagcatc tccgctccca cccgcccacc cagccctgtc acccggccct 3540

ggcagcatgt ggatgccatc aaagaagccc tgagccttct aaacaacagt aatgacacag 3600

cggctgtgat gaatgaaacc gtagacgtcg tctgtgaaat gtttgacccc caggagccga 3660

catgcgtgca gactcgcctg aacctgtaca agcagggcct gcggggcagc ctcactaggc 3720

tcaagagccc cttgactctg ttggccaagc actatgagca gcactgcccc ctcaccgagg 3780

aaacttcctg tgaaacccag tctatcacct tcaaaagttt caaagacagt ctgaacaaat 3840

ttctttttac catccccttt gactgctggg ggccagtcaa aaagtaatca acctctggat 3900

tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt tacgctatgt 3960

ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc tttcattttc 4020

tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc cgttgtcagg 4080

caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg gggcattgcc 4140

accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc tccctattgc cacggcggaa 4200

ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg cactgacaat 4260

tccgtggtgt tgtcggggaa gctgacgtcc tttccatggc tgctcgcctg tgttgccacc 4320

tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc agcggacctt 4380

ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag 4440

acgagtcgga tctccctttg ggcgatatcc gatccaccgg atctagataa ctgatcataa 4500

tcagccatac cacatttgta gaggttttac ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc 4560

tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata 4620

atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc 4680

attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta acgcnnnnta agggtgggaa 4740

agaatatata aggtgggggt cttatgtagt tttgtatctg ttttgcagca gccgccgccg 4800

ccatgagcac caactcgttt gatggaagca ttgtgagctc atatttgaca acgcgcatgc 4860

ccccatgggc cggggtgcgt cagaatgtga tgggctccag cattgatggt cgccccgtcc 4920

tgcccgcaaa ctctactacc ttgacctacg agaccgtgtc tggaacgccg ttggagactg 4980

cagcctccgc cgccgcttca gccgctgcag ccaccgcccg cgggattgtg actgactttg 5040

ctttcctgag cccgcttgca agcagtgcag cttcccgttc atccgcccgc gatgacaagt 5100

tgacggctct tttggcacaa ttggattctt tgacccggga acttaatgtc gtttctcagc 5160

agctgttgga tctgcgccag caggtttctg ccctgaaggc ttcctcccct cccaatgcgg 5220

tttaaaacat aaataaaaaa ccagactctg tttggatttg gatcaagcaa gtgtcttgct 5280

gtctttattt aggggttttg cgcgcgcggt aggcccggga ccagcggtct cggtcgttga 5340

gggtcctgtg tattttttcc aggacgtggt aaaggtgact ctggatgttc agatacatgg 5400

gcataagccc gtctctgggg tggaggtagc accactgcag agcttcatgc tgcggggtgg 5460

tgttgtagat gatccagtcg tagcaggagc gctgggcgtg gtgcctaaaa atgtctttca 5520

gtagcaagct gattgccagg ggcaggccct tggtgtaagt gtttacaaag cggttaagct 5580

gggatgggtg catacgtggg gatatgagat gcatcttgga ctgtattttt aggttggcta 5640

tgttcccagc catatccctc cggggattca tgttgtgcag aaccaccagc acagtgtatc 5700

cggtgcactt gggaaatttg tcatgtagct tagaaggaaa tgcgtggaag aacttggaga 5760

cgcccttgtg acctccaaga ttttccatgc attcgtccat aatgatggca atgggcccac 5820

gggcggcggc ctgggcgaag atatttctgg gatcactaac gtcatagttg tgttccagga 5880

tgagatcgtc ataggccatt tttacaaagc gcgggcggag ggtgccagac tgcggtataa 5940

tggttccatc cggcccaggg gcgtagttac cctcacagat ttgcatttcc cacgctttga 6000

gttcagatgg ggggatcatg tctacctgcg gggcgatgaa gaaaacggtt tccggggtag 6060

gggagatcag ctgggaagaa agcaggttcc tgagcagctg cgacttaccg cagccggtgg 6120

gcccgtaaat cacacctatt accgggtgca actggtagtt aagagagctg cagctgccgt 6180

catccctgag caggggggcc acttcgttaa gcatgtccct gactcgcatg ttttccctga 6240

ccaaatccgc cagaaggcgc tcgccgccca gcgatagcag ttcttgcaag gaagcaaagt 6300

ttttcaacgg tttgagaccg tccgccgtag gcatgctttt gagcgtttga ccaagcagtt 6360

ccaggcggtc ccacagctcg gtcacctgct ctacggcatc tcgatccagc atatctcctc 6420

gtttcgcggg ttggggcggc tttcgctgta cggcagtagt cggtgctcgt ccagacgggc 6480

cagggtcatg tctttccacg ggcgcagggt cctcgtcagc gtagtctggg tcacggtgaa 6540

ggggtgcgct ccgggctgcg cgctggccag ggtgcgcttg aggctggtcc tgctggtgct 6600

gaagcgctgc cggtcttcgc cctgcgcgtc ggccaggtag catttgacca tggtgtcata 6660

gtccagcccc tccgcggcgt ggcccttggc gcgcagcttg cccttggagg aggcgccgca 6720

cgaggggcag tgcagacttt tgagggcgta gagcttgggc gcgagaaata ccgattccgg 6780

ggagtaggca tccgcgccgc aggccccgca gacggtctcg cattccacga gccaggtgag 6840

ctctggccgt tcggggtcaa aaaccaggtt tcccccatgc tttttgatgc gtttcttacc 6900

tctggtttcc atgagccggt gtccacgctc ggtgacgaaa aggctgtccg tgtccccgta 6960

tacagactnn ngtttaaacg aattcnnnat ataaaatgca aggcttgggc gcgagaaata 7020

ccgattccgg ggagtaggca tccgcgccgc aggccccgca gacggtctcg cattccacga 7080

gccaggtgag ctctggccgt tcggggtcaa aaaccaggtt tcccccatgc tttttgatgc 7140

gtttcttacc tctggtttcc atgagccggt gtccacgctc ggtgacgaaa aggctgtccg 7200

tacagacttg agaggcctgt cctcgagcgg tgttccgcgg tcctcctcgt atagaaactc 7260

ggaccactct gagacaaagg ctcgcgtcca ggccagcacg aaggaggcta agtgggaggg 7320

gtagcggtcg ttgtccacta gggggtccac tcgctccagg gtgtgaagac acatgtcgcc 7380

ctcttcggca tcaaggaagg tgattggttt gtaggtgtag gccacgtgac cgggtgttcc 7440

tgaagggggg ctataaaagg gggtgggggc gcgttcgtcc tcactctctt ccgcatcgct 7500

gtctgcgagg gccagctgtt ggggtgagta ctccctctga aaagcgggca tgacttctgc 7560

gctaagattg tcagtttcca aaaacgagga ggatttgata ttcacctggc ccgcggtgat 7620

gcctttgagg gtggccgcat ccatctggtc agaaaagaca atctttttgt tgtcaagctt 7680

ggtggcaaac gacccgtaga gggcgttgga cagcaacttg gcgatggagc gcagggtttg 7740

gtttttgtcg cgatcggcgc gctccttggc cgcgatgttt agctgcacgt attcgcgcgc 7800

aacgcaccgc cattcgggaa agacggtggt gcgctcgtcg ggcaccaggt gcacgcgcca 7860

accgcggttg tgcagggtga caaggtcaac gctggtggct acctctccgc gtaggcgctc 7920

gttggtccag cagaggcggc cgcccttgcg cgagcagaat ggcggtaggg ggtctagctg 7980

cgtctcgtcc ggggggtctg cgtccacggt aaagaccccg ggcagcaggc gcgcgtcgaa 8040

gtagtctatc ttgcatcctt gcaagtctag cgcctgctgc catgcgcggg cggcaagcgc 8100

gcgctcgtat gggttgagtg ggggacccca tggcatgggg tgggtgagcg cggaggcgta 8160

catgccgcaa atgtcgtaaa cgtagagggg ctctctgagt attccaagat atgtagggta 8220

gcatcttcca ccgcggatgc tggcgcgcac gtaatcgtat agttcgtgcg agggagcgag 8280

gaggtcggga ccgaggttgc tacgggcggg ctgctctgct cggaagacta tctgcctgaa 8340

gatggcatgt gagttggatg atatggttgg acgctggaag acgttgaagc tggcgtctgt 8400

gagacctacc gcgtcacgca cgaaggaggc gtaggagtcg cgcagcttgt tgaccagctc 8460

ggcggtgacc tgcacgtcta gggcgcagta gtccagggtt tccttgatga tgtcatactt 8520

atcctgtccc ttttttttcc acagctcgcg gttgaggaca aactcttcgc ggtctttcca 8580

gtactcttgg atcggaaacc cgtcggcctc cgaacggtaa gagcctagca tgtagaactg 8640

gttgacggcc tggtaggcgc agcatccctt ttctacgggt agcgcgtatg cctgcgcggc 8700

cttccggagc gaggtgtggg tgagcgcaaa ggtgtccctg accatgactt tgaggtactg 8760

gtatttgaag tcagtgtcgt cgcatccgcc ctgctcccag agcaaaaagt ccgtgcgctt 8820

tttggaacgc ggatttggca gggcgaaggt gacatcgttg aagagtatct ttcccgcgcg 8880

aggcataaag ttgcgtgtga tgcggaaggg tcccggcacc tcggaacggt tgttaattac 8940

ctgggcggcg agcacgatct cgtcaaagcc gttgatgttg tggcccacaa tgtaaagttc 9000

caagaagcgc gggatgccct tgatggaagg caatttttta agttcctcgt aggtgagctc 9060

ttcaggggag ctgagcccgt gctctgaaag ggcccagtct gcaagatgag ggttggaagc 9120

gacgaatgag ctccacaggt cacgggccat tagcatttgc aggtggtcgc gaaaggtcct 9180

aaactggcga cctatggcca ttttttctgg ggtgatgcag tagaaggtaa gcgggtcttg 9240

ttcccagcgg tcccatccaa ggttcgcggc taggtctcgc gcggcagtca ctagaggctc 9300

atctccgccg aacttcatga ccagcatgaa gggcacgagc tgcttcccaa aggcccccat 9360

ccaagtatag gtctctacat cgtaggtgac aaagagacgc tcggtgcgag gatgcgagcc 9420

gatcgggaag aactggatct cccgccacca attggaggag tggctattga tgtggtgaaa 9480

gtagaagtcc ctgcgacggg ccgaacactc gtgctggctt ttgtaaaaac gtgcgcagta 9540

ctggcagcgg tgcacgggct gtacatcctg cacgaggttg acctgacgac cgcgcacaag 9600

gaagcagagt gggaatttga gcccctcgcc tggcgggttt ggctggtggt cttctacttc 9660

ggctgcttgt ccttgaccgt ctggctgctc gaggggagtt acggtggatc ggaccaccac 9720

gccgcgcgag cccaaagtcc agatgtccgc gcgcggcggt cggagcttga tgacaacatc 9780

gcgcagatgg gagctgtcca tggtctggag ctcccgcggc gtcaggtcag gcgggagctc 9840

ctgcaggttt acctcgcata gacgggtcag ggcgcgggct agatccaggt gatacctaat 9900

ttccaggggc tggttggtgg cggcgtcgat ggcttgcaag aggccgcatc cccgcggcgc 9960

gactacggta ccgcgcggcg ggcggtgggc cgcgggggtg tccttggatg atgcatctaa 10020

aagcggtgac gcgggcgagc ccccggaggt agggggggct ccggacccgc cgggagaggg 10080

ggcaggggca cgtcggcgcc gcgcgcgggc aggagctggt gctgcgcgcg taggttgctg 10140

gcgaacgcga cgacgcggcg gttgatctcc tgaatctggc gcctctgcgt gaagacgacg 10200

ggcccggtga gcttgagcct gaaagagagt tcgacagaat caatttcggt gtcgttgacg 10260

gcggcctggc gcaaaatctc ctgcacgtct cctgagttgt cttgataggc gatctcggcc 10320

atgaactgct cgatctcttc ctcctggaga tctccgcgtc cggctcgctc cacggtggcg 10380

gcgaggtcgt tggaaatgcg ggccatgagc tgcgagaagg cgttgaggcc tccctcgttc 10440

cagacgcggc tgtagaccac gcccccttcg gcatcgcggg cgcgcatgac cacctgcgcg 10500

agattgagct ccacgtgccg ggcgaagacg gcgtagtttc gcaggcgctg aaagaggtag 10560

ttgagggtgg tggcggtgtg ttctgccacg aagaagtaca taacccagcg tcgcaacgtg 10620

gattcgttga tatcccccaa ggcctcaagg cgctccatgg cctcgtagaa gtccacggcg 10680

aagttgaaaa actgggagtt gcgcgccgac acggttaact cctcctccag aagacggatg 10740

agctcggcga cagtgtcgcg cacctcgcgc tcaaaggcta caggggcctc ttcttcttct 10800

tcaatctcct cttccataag ggcctcccct tcttcttctt ctggcggcgg tgggggaggg 10860

gggacacggc ggcgacgacg gcgcaccggg aggcggtcga caaagcgctc gatcatctcc 10920

ccgcggcgac ggcgcatggt ctcggtgacg gcgcggccgt tctcgcgggg gcgcagttgg 10980

aagacgccgc ccgtcatgtc ccggttatgg gttggcgggg ggctgccatg cggcagggat 11040

acggcgctaa cgatgcatct caacaattgt tgtgtaggta ctccgccgcc gagggacctg 11100

agcgagtccg catcgaccgg atcggaaaac ctctcgagaa aggcgtctaa ccagtcacag 11160

tcgcaaggta ggctgagcac cgtggcgggc ggcagcgggc ggcggtcggg gttgtttctg 11220

gcggaggtgc tgctgatgat gtaattaaag taggcggtct tgagacggcg gatggtcgac 11280

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tacctggaca tccaggtgat gccggcggcg gtggtggagg cgcgcggaaa gtcgcggacg 11940

cggttccaga tgttgcgcag cggcaaaaag tgctccatgg tcgggacgct ctggccggtc 12000

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ccgcggcaat gcagccggtg gaggacatga acgatcatgc cattcgcggc gacacctttg 16620

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ccgagctgtt gcccgtgcac tccaagagct tctacaacga ccaggccgtc tactcccaac 17040

tcatccgcca gtttacctct ctgacccacg tgttcaatcg ctttcccgag aaccagattt 17100

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tcctatcgag ccgcactttt tgagcaagca tgtccatcct tatatcgccc agcaataaca 17340

caggctgggg cctgcgcttc ccaagcaaga tgtttggcgg ggccaagaag cgctccgacc 17400

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ccgcggtgca ggcggtcgct gcggccgcgt ccaagacctc tacggaggtg caaacggacc 18780

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cacatttcgg ccccaccggt tcttcacgat cttggccttg ctagactgct ccttcagcgc 24540

gcgctgcccg ttttcgctcg tcacatccat ttcaatcacg tgctccttat ttatcataat 24600

gcttccgtgt agacacttaa gctcgccttc gatctcagcg cagcggtgca gccacaacgc 24660

gcagcccgtg ggctcgtgat gcttgtaggt cacctctgca aacgactgca ggtacgcctg 24720

caggaatcgc cccatcatcg tcacaaaggt cttgttgctg gtgaaggtca gctgcaaccc 24780

gcggtgctcc tcgttcagcc aggtcttgca tacggccgcc agagcttcca cttggtcagg 24840

cagtagtttg aagttcgcct ttagatcgtt atccacgtgg tacttgtcca tcagcgcgcg 24900

cgcagcctcc atgcccttct cccacgcaga cacgatcggc acactcagcg ggttcatcac 24960

cgtaatttca ctttccgctt cgctgggctc ttcctcttcc tcttgcgtcc gcataccacg 25020

cgccactggg tcgtcttcat tcagccgccg cactgtgcgc ttacctcctt tgccatgctt 25080

gattagcacc ggtgggttgc tgaaacccac catttgtagc gccacatctt ctctttcttc 25140

ctcgctgtcc acgattacct ctggtgatgg cgggcgctcg ggcttgggag aagggcgctt 25200

ctttttcttc ttgggcgcaa tggccaaatc cgccgccgag gtcgatggcc gcgggctggg 25260

tgtgcgcggc accagcgcgt cttgtgatga gtcttcctcg tcctcggact cgatacgccg 25320

cctcatccgc ttttttgggg gcgcccgggg aggcggcggc gacggggacg gggacgacac 25380

gtcctccatg gttgggggac gtcgcgccgc accgcgtccg cgctcggggg tggtttcgcg 25440

ctgctcctct tcccgactgg ccatttcctt ctcctatagg cagaaaaaga tcatggagtc 25500

agtcgagaag aaggacagcc taaccgcccc ctctgagttc gccaccaccg cctccaccga 25560

tgccgccaac gcgcctacca ccttccccgt cgaggcaccc ccgcttgagg aggaggaagt 25620

gattatcgag caggacccag gttttgtaag cgaagacgac gaggaccgct cagtaccaac 25680

agaggataaa aagcaagacc aggacaacgc agaggcaaac gaggaacaag tcgggcgggg 25740

ggacgaaagg catggcgact acctagatgt gggagacgac gtgctgttga agcatctgca 25800

gcgccagtgc gccattatct gcgacgcgtt gcaagagcgc agcgatgtgc ccctcgccat 25860

agcggatgtc agccttgcct acgaacgcca cctattctca ccgcgcgtac cccccaaacg 25920

ccaagaaaac ggcacatgcg agcccaaccc gcgcctcaac ttctaccccg tatttgccgt 25980

gccagaggtg cttgccacct atcacatctt tttccaaaac tgcaagatac ccctatcctg 26040

ccgtgccaac cgcagccgag cggacaagca gctggccttg cggcagggcg ctgtcatacc 26100

tgatatcgcc tcgctcaacg aagtgccaaa aatctttgag ggtcttggac gcgacgagaa 26160

gcgcgcggca aacgctctgc aacaggaaaa cagcgaaaat gaaagtcact ctggagtgtt 26220

ggtggaactc gagggtgaca acgcgcgcct agccgtacta aaacgcagca tcgaggtcac 26280

ccactttgcc tacccggcac ttaacctacc ccccaaggtc atgagcacag tcatgagtga 26340

gctgatcgtg cgccgtgcgc agcccctgga gagggatgca aatttgcaag aacaaacaga 26400

ggagggccta cccgcagttg gcgacgagca gctagcgcgc tggcttcaaa cgcgcgagcc 26460

tgccgacttg gaggagcgac gcaaactaat gatggccgca gtgctcgtta ccgtggagct 26520

tgagtgcatg cagcggttct ttgctgaccc ggagatgcag cgcaagctag aggaaacatt 26580

gcactacacc tttcgacagg gctacgtacg ccaggcctgc aagatctcca acgtggagct 26640

ctgcaacctg gtctcctacc ttggaatttt gcacgaaaac cgccttgggc aaaacgtgct 26700

tcattccacg ctcaagggcg aggcgcgccg cgactacgtc cgcgactgcg tttacttatt 26760

tctatgctac acctggcaga cggccatggg cgtttggcag cagtgcttgg aggagtgcaa 26820

cctcaaggag ctgcagaaac tgctaaagca aaacttgaag gacctatgga cggccttcaa 26880

cgagcgctcc gtggccgcgc acctggcgga catcattttc cccgaacgcc tgcttaaaac 26940

cctgcaacag ggtctgccag acttcaccag tcaaagcatg ttgcagaact ttaggaactt 27000

tatcctagag cgctcaggaa tcttgcccgc cacctgctgt gcacttccta gcgactttgt 27060

gcccattaag taccgcgaat gccctccgcc gctttggggc cactgctacc ttctgcagct 27120

agccaactac cttgcctacc actctgacat aatggaagac gtgagcggtg acggtctact 27180

ggagtgtcac tgtcgctgca acctatgcac cccgcaccgc tccctggttt gcaattcgca 27240

gctgcttaac gaaagtcaaa ttatcggtac ctttgagctg cagggtccct cgcctgacga 27300

aaagtccgcg gctccggggt tgaaactcac tccggggctg tggacgtcgg cttaccttcg 27360

caaatttgta cctgaggact accacgccca cgagattagg ttctacgaag accaatcccg 27420

cccgccaaat gcggagctta ccgcctgcgt cattacccag ggccacattc ttggccaatt 27480

gcaagccatc aacaaagccc gccaagagtt tctgctacga aagggacggg gggtttactt 27540

ggacccccag tccggcgagg agctcaaccc aatccccccg ccgccgcagc cctatcagca 27600

gcagccgcgg gcccttgctt cccaggatgg cacccaaaaa gaagctgcag ctgccgccgc 27660

cacccacgga cgaggaggaa tactgggaca gtcaggcaga ggaggttttg gacgaggagg 27720

aggaggacat gatggaagac tgggagagcc tagacgagga agcttccgag gtcgaagagg 27780

tgtcagacga aacaccgtca ccctcggtcg cattcccctc gccggcgccc cagaaatcgg 27840

caaccggttc cagcatggct acaacctccg ctcctcaggc gccgccggca ctgcccgttc 27900

gccgacccaa ccgtagatgg gacaccactg gaaccagggc cggtaagtcc aagcagccgc 27960

cgccgttagc ccaagagcaa caacagcgcc aaggctaccg ctcatggcgc gggcacaaga 28020

acgccatagt tgcttgcttg caagactgtg ggggcaacat ctccttcgcc cgccgctttc 28080

ttctctacca tcacggcgtg gccttccccc gtaacatcct gcattactac cgtcatctct 28140

acagcccata ctgcaccggc ggcagcggca gcggcagcaa cagcagcggc cacacagaag 28200

caaaggcgac cggatagcaa gactctgaca aagcccaaga aatccacagc ggcggcagca 28260

gcaggaggag gagcgctgcg tctggcgccc aacgaacccg tatcgacccg cgagcttaga 28320

aacaggattt ttcccactct gtatgctata tttcaacaga gcaggggcca agaacaagag 28380

ctgaaaataa aaaacaggtc tctgcgatcc ctcacccgca gctgcctgta tcacaaaagc 28440

gaagatcagc ttcggcgcac gctggaagac gcggaggctc tcttcagtaa atactgcgcg 28500

ctgactctta aggactagtt tcgcgccctt tctcaaattt aagcgcgaaa actacgtcat 28560

ctccagcggc cacacccggc gccagcacct gtcgtcagcg ccattatgag caaggaaatt 28620

cccacgccct acatgtggag ttaccagcca caaatgggac ttgcggctgg agctgcccaa 28680

gactactcaa cccgaataaa ctacatgagc gcgggacccc acatgatatc ccgggtcaac 28740

ggaatccgcg cccaccgaaa ccgaattctc ttggaacagg cggctattac caccacacct 28800

cgtaataacc ttaatccccg tagttggccc gctgccctgg tgtaccagga aagtcccgct 28860

cccaccactg tggtacttcc cagagacgcc caggccgaag ttcagatgac taactcaggg 28920

gcgcagcttg cgggcggctt tcgtcacagg gtgcggtcgc ccgggcaggg tataactcac 28980

ctgacaatca gagggcgagg tattcagctc aacgacgagt cggtgagctc ctcgcttggt 29040

ctccgtccgg acgggacatt tcagatcggc ggcgccggcc gtccttcatt cacgcctcgt 29100

caggcaatcc taactctgca gacctcgtcc tctgagccgc gctctggagg cattggaact 29160

ctgcaattta ttgaggagtt tgtgccatcg gtctacttta accccttctc gggacctccc 29220

ggccactatc cggatcaatt tattcctaac tttgacgcgg taaaggactc ggcggacggc 29280

tacgactgaa tgttaagtgg agaggcagag caactgcgcc tgaaacacct ggtccactgt 29340

cgccgccaca agtgctttgc ccgcgactcc ggtgagtttt gctactttga attgcccgag 29400

gatcatatcg agggcccggc gcacggcgtc cggcttaccg cccagggaga gcttgcccgt 29460

agcctgattc gggagtttac ccagcgcccc ctgctagttg agcgggacag gggaccctgt 29520

gttctcactg tgatttgcaa ctgtcctaac cttggattac atcaagatcc tctagttata 29580

actagagtac ccggggatct tattcccttt aactaataaa aaaaaataat aaagcatcac 29640

ttacttaaaa tcagttagca aatttctgtc cagtttattc agcagcacct ccttgccctc 29700

ctcccagctc tggtattgca gcttcctcct ggctgcaaac tttctccaca atctaaatgg 29760

aatgtcagtt tcctcctgtt cctgtccatc cgcacccact atcttcatgt tgttgcagat 29820

gaagcgcgca agaccgtctg aagatacctt caaccccgtg tatccatatg acacggaaac 29880

cggtcctcca actgtgcctt ttcttactcc tccctttgta tcccccaatg ggtttcaaga 29940

gagtccccct ggggtactct ctttgcgcct atccgaacct ctagttacct ccaatggcat 30000

gcttgcgctc aaaatgggca acggcctctc tctggacgag gccggcaacc ttacctccca 30060

aaatgtaacc actgtgagcc cacctctcaa aaaaaccaag tcaaacataa acctggaaat 30120

atctgcaccc ctcacagtta cctcagaagc cctaactgtg gctgccgccg cacctctaat 30180

ggtcgcgggc aacacactca ccatgcaatc acaggccccg ctaaccgtgc acgactccaa 30240

acttagcatt gccacccaag gacccctcac agtgtcagaa ggaaagctag ccctgcaaac 30300

atcaggcccc ctcaccacca ccgatagcag tacccttact atcactgcct caccccctct 30360

aactactgcc actggtagct tgggcattga cttgaaagag cccatttata cacaaaatgg 30420

aaaactagga ctaaagtacg gggctccttt gcatgtaaca gacgacctaa acactttgac 30480

cgtagcaact ggtccaggtg tgactattaa taatacttcc ttgcaaacta aagttactgg 30540

agccttgggt tttgattcac aaggcaatat gcaacttaat gtagcaggag gactaaggat 30600

tgattctcaa aacagacgcc ttatacttga tgttagttat ccgtttgatg ctcaaaacca 30660

actaaatcta agactaggac agggccctct ttttataaac tcagcccaca acttggatat 30720

taactacaac aaaggccttt acttgtttac agcttcaaac aattccaaaa agcttgaggt 30780

taacctaagc actgccaagg ggttgatgtt tgacgctaca gccatagcca ttaatgcagg 30840

agatgggctt gaatttggtt cacctaatgc accaaacaca aatcccctca aaacaaaaat 30900

tggccatggc ctagaatttg attcaaacaa ggctatggtt cctaaactag gaactggcct 30960

tagttttgac agcacaggtg ccattacagt aggaaacaaa aataatgata agctaacttt 31020

gtggaccaca ccagctccat ctcctaactg tagactaaat gcagagaaag atgctaaact 31080

cactttggtc ttaacaaaat gtggcagtca aatacttgct acagtttcag ttttggctgt 31140

taaaggcagt ttggctccaa tatctggaac agttcaaagt gctcatctta ttataagatt 31200

tgacgaaaat ggagtgctac taaacaattc cttcctggac ccagaatatt ggaactttag 31260

aaatggagat cttactgaag gcacagccta tacaaacgct gttggattta tgcctaacct 31320

atcagcttat ccaaaatctc acggtaaaac tgccaaaagt aacattgtca gtcaagttta 31380

cttaaacgga gacaaaacta aacctgtaac actaaccatt acactaaacg gtacacagga 31440

aacaggagac acaactccaa gtgcatactc tatgtcattt tcatgggact ggtctggcca 31500

caactacatt aatgaaatat ttgccacatc ctcttacact ttttcataca ttgcccaaga 31560

ataaagaatc gtttgtgtta tgtttcaacg tgtttatttt tcaattgcag aaaatttcaa 31620

gtcatttttc attcagtagt atagccccac caccacatag cttatacaga tcaccgtacc 31680

ttaatcaaac tcacagaacc ctagtattca acctgccacc tccctcccaa cacacagagt 31740

acacagtcct ttctccccgg ctggccttaa aaagcatcat atcatgggta acagacatat 31800

tcttaggtgt tatattccac acggtttcct gtcgagccaa acgctcatca gtgatattaa 31860

taaactcccc gggcagctca cttaagttca tgtcgctgtc cagctgctga gccacaggct 31920

gctgtccaac ttgcggttgc ttaacgggcg gcgaaggaga agtccacgcc tacatggggg 31980

tagagtcata atcgtgcatc aggatagggc ggtggtgctg cagcagcgcg cgaataaact 32040

gctgccgccg ccgctccgtc ctgcaggaat acaacatggc agtggtctcc tcagcgatga 32100

ttcgcaccgc ccgcagcata aggcgccttg tcctccgggc acagcagcgc accctgatct 32160

cacttaaatc agcacagtaa ctgcagcaca gcaccacaat attgttcaaa atcccacagt 32220

gcaaggcgct gtatccaaag ctcatggcgg ggaccacaga acccacgtgg ccatcatacc 32280

acaagcgcag gtagattaag tggcgacccc tcataaacac gctggacata aacattacct 32340

cttttggcat gttgtaattc accacctccc ggtaccatat aaacctctga ttaaacatgg 32400

cgccatccac caccatccta aaccagctgg ccaaaacctg cccgccggct atacactgca 32460

gggaaccggg actggaacaa tgacagtgga gagcccagga ctcgtaacca tggatcatca 32520

tgctcgtcat gatatcaatg ttggcacaac acaggcacac gtgcatacac ttcctcagga 32580

ttacaagctc ctcccgcgtt agaaccatat cccagggaac aacccattcc tgaatcagcg 32640

taaatcccac actgcaggga agacctcgca cgtaactcac gttgtgcatt gtcaaagtgt 32700

tacattcggg cagcagcgga tgatcctcca gtatggtagc gcgggtttct gtctcaaaag 32760

gaggtagacg atccctactg tacggagtgc gccgagacaa ccgagatcgt gttggtcgta 32820

gtgtcatgcc aaatggaacg ccggacgtag tcatatttcc tgaagcaaaa ccaggtgcgg 32880

gcgtgacaaa cagatctgcg tctccggtct cgccgcttag atcgctctgt gtagtagttg 32940

tagtatatcc actctctcaa agcatccagg cgccccctgg cttcgggttc tatgtaaact 33000

ccttcatgcg ccgctgccct gataacatcc accaccgcag aataagccac acccagccaa 33060

cctacacatt cgttctgcga gtcacacacg ggaggagcgg gaagagctgg aagaaccatg 33120

tttttttttt tattccaaaa gattatccaa aacctcaaaa tgaagatcta ttaagtgaac 33180

gcgctcccct ccggtggcgt ggtcaaactc tacagccaaa gaacagataa tggcatttgt 33240

aagatgttgc acaatggctt ccaaaaggca aacggccctc acgtccaagt ggacgtaaag 33300

gctaaaccct tcagggtgaa tctcctctat aaacattcca gcaccttcaa ccatgcccaa 33360

ataattctca tctcgccacc ttctcaatat atctctaagc aaatcccgaa tattaagtcc 33420

ggccattgta aaaatctgct ccagagcgcc ctccaccttc agcctcaagc agcgaatcat 33480

gattgcaaaa attcaggttc ctcacagacc tgtataagat tcaaaagcgg aacattaaca 33540

aaaataccgc gatcccgtag gtcccttcgc agggccagct gaacataatc gtgcaggtct 33600

gcacggacca gcgcggccac ttccccgcca ggaaccttga caaaagaacc cacactgatt 33660

atgacacgca tactcggagc tatgctaacc agcgtagccc cgatgtaagc tttgttgcat 33720

gggcggcgat ataaaatgca aggtgctgct caaaaaatca ggcaaagcct cgcgcaaaaa 33780

agaaagcaca tcgtagtcat gctcatgcag ataaaggcag gtaagctccg gaaccaccac 33840

agaaaaagac accatttttc tctcaaacat gtctgcgggt ttctgcataa acacaaaata 33900

aaataacaaa aaaacattta aacattagaa gcctgtctta caacaggaaa aacaaccctt 33960

ataagcataa gacggactac ggccatgccg gcgtgaccgt aaaaaaactg gtcaccgtga 34020

ttaaaaagca ccaccgacag ctcctcggtc atgtccggag tcataatgta agactcggta 34080

aacacatcag gttgattcat cggtcagtgc taaaaagcga ccgaaatagc ccgggggaat 34140

acatacccgc aggcgtagag acaacattac agcccccata ggaggtataa caaaattaat 34200

aggagagaaa aacacataaa cacctgaaaa accctcctgc ctaggcaaaa tagcaccctc 34260

ccgctccaga acaacataca gcgcttcaca gcggcagcct aacagtcagc cttaccagta 34320

aaaaagaaaa cctattaaaa aaacaccact cgacacggca ccagctcaat cagtcacagt 34380

gtaaaaaagg gccaagtgca gagcgagtat atataggact aaaaaatgac gtaacggtta 34440

aagtccacaa aaaacaccca gaaaaccgca cgcgaaccta cgcccagaaa cgaaagccaa 34500

aaaacccaca acttcctcaa atcgtcactt ccgttttccc acgttacgta acttcccatt 34560

ttaagaaaac tacaattccc aacacataca agttactccg ccctaaaacc tacgtcaccc 34620

gccccgttcc cacgccccgc gccacgtcac aaactccacc ccctcattat catattggct 34680

tcaatccaaa ataaggtata ttattgatga tnnncgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc 34740

tcattatcat attggcttca atccaaaata aggtatatta ttgatgatnn nttaattaag 34800

gatccnnncg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgct 34860

cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 34920

cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 34980

acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 35040

ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 35100

ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 35160

gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 35220

gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 35280

ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 35340

actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 35400

gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 35460

ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 35520

ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 35580

gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 35640

tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 35700

tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 35760

aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg 35820

aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg 35880

tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc 35940

gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg 36000

agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg 36060

aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgnn nnaaaaagga 36120

tcttcaccta gatccttttc acgtagaaag ccagtccgca gaaacggtgc tgaccccgga 36180

tgaatgtcag ctactgggct atctggacaa gggaaaacgc aagcgcaaag agaaagcagg 36240

tagcttgcag tgggcttaca tggcgatagc tagactgggc ggttttatgg acagcaagcg 36300

aaccggaatt gccagctggg gcgccctctg gtaaggttgg gaagccctgc aaagtaaact 36360

ggatggcttt ctcgccgcca aggatctgat ggcgcagggg atcaagctct gatcaagaga 36420

caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg 36480

cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg 36540

ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt 36600

ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg 36660

gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat 36720

tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat 36780

ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg 36840

accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg 36900

atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc 36960

tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc 37020

cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg 37080

tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg 37140

gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca 37200

tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgaatttt gttaaaattt ttgttaaatc 37260

agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaacatcc cttataaatc aaaagaatag 37320

accgcgatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg 37380

gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca 37440

tcacccaaat caagtttttt gcggtcgagg tgccgtaaag ctctaaatcg gaaccctaaa 37500

gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg 37560

aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta 37620

accaccacac ccgcgcgctt aatgcgccgn tgtccccgta nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 37680

Claims (10)

1.一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体，其特征在于：该重组腺病毒穿梭载体为插入有目的基因片段的腺病毒穿梭质粒，所述目的基因片段包括蛋白编码区以及增强表达元件，所述增强表达元件包括人巨细胞病毒第一内含子Intron A以及土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE，所述蛋白编码区包括带有分泌信号肽sp的肿瘤坏死因子相关激活蛋白CD40L序列、带有跨膜信号肽tp的猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap序列以及带有分泌信号肽sp的粒细胞-巨细胞集落刺激因子GMCSF序列，所述CD40L、Cap以及GMCSF为共表达。

2.根据权利要求1所述一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体，其特征在于：所述蛋白编码区还包括设置在所述CD40L、Cap以及GMCSF序列两两之间的自剪切2A肽的序列。

3.根据权利要求1所述一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体，其特征在于：所述重组腺病毒穿梭载体具体包括依次排列的启动子、目的基因片段、polyA尾以及两个同源臂序列。

4.一种如权利要求1所述的跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)构建目的基因片段

1.1)将所述CD40L序列、所述Cap序列、所述GMCSF序列三个片段，利用重叠PCR进行连接，得到中间片段，且其中任意两个片段之间插入有自剪切2A肽的序列；

1.2)将所述中间片段与Intron A及WPRE连接，得到目的基因片段；

2)将目的基因片段克隆至腺病毒穿梭质粒。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1.1)具体包括以下步骤：

1.1.1)以pS-CD40L-Cap-GMCSF质粒为扩增模板，通过引物P1和P2、P3和P4及P7和P8分别扩增得到包含有所述CD40L序列的sp-CD40L-2A-tp片段、包含有所述Cap序列的tp-Cap-2A-sp片段及包含有所述GMCSF序列的sp-GMCSF片段；P1的序列如SEQ.ID.NO.1所示，P2的序列如SEQ.ID.NO.2所示，P3的序列如SEQ.ID.NO.3所示，P4的序列如SEQ.ID.NO.4所示，P7的序列如SEQ.ID.NO.7所示，P8的序列如SEQ.ID.NO.8所示；

1.1.2)将sp-CD40L-2A-tp片段及tp-Cap-2A-sp片段通过引物P5和P6进行重叠PCR，得到sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp片段，然后将sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp片段及sp-GM CSF片段通过引物P5和P8进行重叠PCR，得到中间片段sp-CD40L-2A-tp-Cap-2A-sp-GMCSF；P5的序列如SEQ.ID.NO.5所示，P6的序列如SEQ.ID.NO.6所示。

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1.2)具体包括以下步骤：将puc-Intron A-Cap-WPRE质粒中的Cap序列用所述中间片段替换，得到扩增模板，然后通过引物P9和P10扩增得到目的基因片段；P9的序列如SEQ.ID.NO.9所示，P10的序列如SEQ.ID.NO.10所示。

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)具体包括以下步骤：将目的基因片段插入至腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV的多克隆位点。

8.一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒，其特征在于：所述重组腺病毒是利用重组腺病毒质粒进行腺病毒包装而得到的，所述重组腺病毒质粒由跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体与腺病毒骨架载体同源重组形成；该重组腺病毒穿梭载体为插入有目的基因片段的腺病毒穿梭质粒，所述目的基因片段包括蛋白编码区以及增强表达元件，所述增强表达元件包括人巨细胞病毒第一内含子Intron A以及土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件WPRE，所述蛋白编码区包括带有分泌信号肽sp的肿瘤坏死因子相关激活蛋白CD40L序列、带有跨膜信号肽tp的猪圆环病毒2型衣壳蛋白Cap序列以及带有分泌信号肽sp的粒细胞-巨细胞集落刺激因子GMCSF序列，所述CD40L、Cap以及GMCSF为共表达。

9.根据权利要求8所述一种跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒，其特征在于：所述重组腺病毒质粒的序列如SEQ.ID.NO.11所示。

10.如权利要求1所述的跨膜型猪圆环病毒2型重组腺病毒穿梭载体在制备猪圆环病毒2型基因工程疫苗中的用途。