CN106399262A - 一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，将人巨细胞病毒第一内含子(Intron A)和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)克隆到腺病毒穿梭载体中，完成重组腺病毒的构建。本发明的优点体现在：提高Cap表达量，从而降低腺病毒使用剂量和腺病毒自身蛋白免疫反应，提高猪圆环病毒2型重组腺病毒的制备效率。

Description

一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法
技术领域
本发明涉及动物病毒基因工程技术领域，具体涉及一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法。
背景技术
腺病毒具有易感性强、致病力低、宿主范围广、稳定性好、病毒滴度高、易于浓缩和贮存、介导基因转移效率高和能容纳较大基因片段等优点，而且其生物学背景已研究得相当清楚，因而腺病毒载体在疫苗制备中被广泛研究和应用，是最有前途的载体之一，但是腺病毒本身也有一些缺点限制了它的应用。
腺病毒载体作为一种疫苗载体，其最大的问题是机体针对载体的免疫反应过强，现在有几种策略来解决这个问题,这些策略包括：1.化学法，即用聚乙二醇等化学试剂包裹腺病毒，屏蔽其抗原表位，从而逃逸宿主的免疫作用，但此类方法难以获得高滴度的病毒，在实际应用过程中有较大难度；2.采用基因工程的方法对腺病毒进行修饰，包括构建嵌合体修饰的腺病毒衣壳、构建嵌合型的腺病毒和将基于5型人腺病毒的疫苗完全替换为其他稀有的(来自人类或非人类的)腺病毒血清型；3.利用一些细胞因子(IL-2、IFN-γ和IL-18等)与目的基因一起表达，发挥细胞因子分子佐剂的功能，从而提高重组腺病毒载体的免疫原性。
通过提高抗原基因的表达，降低腺病毒疫苗免疫剂量，达到降低载体自身免疫反应，增强疫苗免疫效果的目的。提高抗原基因的表达策略之一是对载体骨架调控元件的优化。人巨细胞病毒(humancytomegalovirus,hCMV)第一内含子(human cytomegalovirus firstintron,Intron A)作为转录后调节元件，与hCMV启动子/增强子(Promoter/Enhancer)一同提高缺失内含子的目的基因的表达。内含子可能通过几种不同机制来提高基因表达效率，这些机制通常分为两类：一类是保护机制；另一类是增强机制。保护机制强调内含子的保护能力，认为内含子的某些序列能够通过自身的折叠或者结合其他蛋白形成一种二级结构从而达到稳定初级转录本的作用。另外内含子序列还可以作为RNA保护因子的靶序列来稳定初级转录本，间接增加mRNA核内稳定性，导致细胞质中积累更多的成熟mRNA，从而增强目的基因的表达效率。而增强机制则强调内含子的促进转录能力，某些内含子有这样一些序列，能够起到类似增强子或其他顺式调控元件的功能，它们同某些蛋白质结合，影响其转录的起始和延伸，从而开放染色体的功能域。
另外文献报道，土拨鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus,WHV)转录后调节元件(woodchuck hepatitis virus post-transcriptionalregulatory element,WPRE)能通过提高mRNA稳定性、3’端加工、促进mRNA出细胞核和细胞质中mRNA的积累来增强未经剪接的基因表达。
猪圆环病毒可引起猪圆环病毒病(porcine circovirus disease,PCVD)或猪圆环病毒相关性疾病(porcine circovirus-associated disease,PCVAD)，如引起仔猪的传染性先天性震颤和断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)等多种疾病。1991年加拿大首次暴发该病，随后许多国家和地区都报道了该病，其已给养猪业造成了严重的经济损失。1978年德国学者Tischer首次从猪肾传代细胞系PK-15细胞中分离到该病毒，并于1982将其命名为圆环病毒，随后经血清学调查发现在德国、加拿大、新西兰、英国、北爱尔兰和美国等国家的猪群中抗体阳性率很高，其中1997年Clark从加拿大西部患有PMWS的猪群中分离到一种新的病毒，该病毒与PK-15细胞中圆环病毒相似，并命名为猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)。
PCV2重组腺病毒载体疫苗已经有学者进行相关研究，但是还没有相应的商品化疫苗，分析其原因是腺病毒载体本身蛋白引起的免疫反应会严重影响机体针对PCV2Cap的免疫应答。
本发明将Intron A和WPRE引入到重组腺病毒载体中，提高PCV2Cap表达量，以降低重组腺病毒免疫剂量，减弱腺病毒自身的免疫反应。
发明内容
本发明的目的是针对腺病毒表达系统的不足，提供一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，以提高Cap表达量，从而降低腺病毒使用剂量，减弱腺病毒自身的免疫反应。
为实现上述目的，本发明公开了如下技术方案：
一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，将Intron A和WPRE加入到腺病毒穿梭载体中，完成重组腺病毒的构建。
作为一种改进方案，所述重组腺病毒的构建具体包括如下步骤：
S1依次将Intron A、Cap和WPRE编码基因连接到载体pUC57，测序鉴定，命名为pUC-Intron A-Cap-WPRE；
S2将IntronA、Cap和WPRE连接到pShuttle-CMV。用Xho I和EcoR V双酶切pUC-Intron A-Cap-WPRE和pShuttle-CMV，然后连接Intron A-Cap-WPRE和pShuttle-CMV，转化DH5a，挑菌、摇菌、提质粒，PCR鉴定和单双酶切鉴定正确后，送测序，测序正确后，命名为PS-Intron A-Cap-WPRE；
S3将构建好的PS-Intron A-Cap-WPRE用限制性内切酶Pme I线性化后电转BJ5183与其中的骨架质粒pAdEasy-1进行重组，挑菌、摇菌、提质粒，用限制性内切酶Pac I单酶切鉴定；
S4鉴定正确后用试剂盒提取重组质粒，用限制性内切酶Pac I线性化后的重组质粒转染HEK293A细胞，当细胞病变出现时，收集细胞，离心后将沉淀重悬于PBS；
S5反复冻融3次后，离心取上清，此病毒即为原种腺病毒，命名为rAd-Intron A-Cap-WPRE。
进一步的改进方案
作为一种进一步的改进方案，所述步骤S3中，电转条件为200Ω,2.5kV,25μF。
作为一种进一步的改进方案，所述步骤S3中，用限制性内切酶Pac I线性化的条件为37℃，2h。
作为一种进一步的改进方案，所述步骤S3中，挑取单克隆的方法是：电转化后，涂琼脂板时，同时设立5个梯度的涂菌量，分别为20μL、40μL、60μL、80μL和100μL菌量，在37℃细菌培养箱中放置18h，挑取单克隆菌落，单克隆菌落大小约为中等的菌落，太大或太小均不能挑取，每个梯度挑取10个单克隆重复，共计50个单克隆。
作为一种进一步的改进方案，所述步骤S4中，转染HEK293A细胞方法按照优化后的LipofectamineTM2000转染程序进行转染。具体转染方法如下：(1)将DNA质粒溶于50μL无血清无抗生素的Medium培养液中，轻轻混匀，并在室温下孵育5min；(2)将适量LipofectamineTM 2000溶于50μL无血清无抗生素的Medium培养液中，混匀并在室温下孵育5min；(3)将上述两种混合物混合(总体积100μL)，轻轻混匀，在室温下孵育20min(不能出现雾状沉淀)；(4)上述操作同时，将待转染细胞用PBS清洗两次，在每孔(24孔板)中加入100μL无血清无抗生素的Medium培养液，待DNA质粒/Lipofectamine复合物混合20min后，立即加入待转染细胞孔中，并混匀，然后将细胞于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，约4h后更换为含2％胎牛血清(fetalbovine serum,FBS)的DMEM细胞培养液，继续培养，并定期用显微镜观察细胞生长情况。
作为一种进一步的改进方案，所述步骤S4中，细胞病变指细胞肿胀、变圆、脱落，但形态完整。
作为一种进一步的改进方案，所述步骤S5中，离心的条件为3000g，10min。
本发明公开的一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，具有以下有益效果：
1.hCMV Intron A作为转录调节元件，与hCMV启动子/增强子(Promoter/Enhancer)一起提高缺失内含子的目的基因表达。
2.WPRE能通过提高mRNA稳定性、3’端加工、促进mRNA出细胞核和细胞质中mRNA的积累来增强未经剪接的目的基因的表达。
3.Intron A和WPRE克隆到腺病毒穿梭载体中，可以提高PCV2Cap表达量，降低腺病毒免疫剂量和腺病毒自身载体免疫反应。
附图说明
图1是重组腺病毒穿梭载体改造示意图；
图2是PS-Intron A-Cap-WPRE PCR鉴定图，其中：1：Intron-Cap-WPRE；2：阴性对照；3：2K Plus Marker
图3是重组腺病毒rAd-Intron A-Cap-WPRE感染HEK293A细胞48h对比照片，其中：A为rAd-Intron A-Cap-WPRE感染HEK293A细胞；B为正常细胞对照；
图4重组腺病毒rAd-Intron A-Cap-WPRE感染猪PK-15细胞后Cap表达显著升高，其中：1为rAd-Cap；2为rAd-Intron A-Cap-WPRE；β-actin为内参蛋白；
图5低剂量的rAd-Intron A-Cap-WPRE感染猪PK-15细胞可达到高剂量的rAd-Cap感染猪PK-15细胞后Cap的表达水平，并显著降低载体蛋白的表达，其中：1为rAd-Cap(感染剂量为20MOI)；2为rAd-Intron A-Cap-WPRE(感染剂量为2MOI)。
具体实施方式
下面结合实施例并参照附图对本发明作进一步描述。
一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，将Intron A和WPRE加入到腺病毒穿梭载体中，完成重组腺病毒的构建。
具体来说，所述重组腺病毒的构建具体包括如下步骤：
S1依次将Intron A、Cap和WPRE编码基因连接到载体pUC57，测序鉴定，命名为pUC-Intron A-Cap-WPRE；
S2将IntronA、Cap和WPRE连接到pShuttle-CMV。用Xho I和EcoR V双酶切pUC-Intron A-Cap-WPRE和pShuttle-CMV，然后连接Intron A-Cap-WPRE和pShuttle-CMV，转化DH5a，挑菌、摇菌、提质粒，PCR鉴定和单双酶切鉴定正确后，送测序，测序正确后，命名为PS-Intron A-Cap-WPRE；
S3将构建好的PS-Intron A-Cap-WPRE用限制性内切酶Pme I线性化后电转BJ5183与其中的骨架质粒pAdEasy-1进行重组，挑菌、摇菌、提质粒，用限制性内切酶Pac I单酶切鉴定；
S4鉴定正确后用试剂盒提取重组质粒，用限制性内切酶Pac I线性化后的重组质粒转染HEK293A细胞，当细胞病变出现时，收集细胞，离心后将沉淀重悬于PBS；
S5反复冻融3次后，离心取上清，此病毒即为原种腺病毒，命名为rAd-Intron A-Cap-WPRE。
本发明中，所述步骤S4中，转染HEK293A细胞方法按照优化后的LipofectamineTM2000转染程序进行转染。具体转染方法如下：(1)将DNA质粒溶于50μL无血清无抗生素的Medium培养液中，轻轻混匀，并在室温下孵育5min；(2)将适量LipofectamineTM 2000溶于50μL无血清无抗生素的Medium培养液中，混匀并在室温下孵育5min；(3)将上述两种混合物混合(总体积100μL)，轻轻混匀，在室温下孵育20min(不能出现雾状沉淀)；(4)上述操作同时，将待转染细胞用PBS清洗两次，在每孔(24孔板)中加入100μL无血清无抗生素的Medium培养液，待DNA质粒/Lipofectamine复合物混合20min后，立即加入待转染细胞孔中，并混匀，然后将细胞于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，约4h后更换为含2％FBS的DMEM细胞培养液，继续培养，并定期用显微镜观察细胞生长情况。
请参见图1。图1是腺病毒穿梭载体PS-Intron A-Cap-WPRE构建示意图。Intron A基因插入到Cap基因的上游，WPRE基因插入到Cap基因的下游。启动子为CMV启动子，多聚腺苷酸信号为SV40poly。
请参见图2。图2是PS-Intron A-Cap-WPRE PCR鉴定图。将IntronA-Cap-WPRE连接到pShuttle-CMV穿梭载体上，转化入DH5α，挑菌、摇菌和提质粒，用提取的质粒为模板，进行PCR，鉴定重组质粒是否构建成功。
请参见图3。图中A：rAd-Intron A-Cap-WPRE；B：正常细胞对照。将在BJ5183中重组成功的质粒转染进入HEK293A细胞中进行包装，约7～10d出现细胞病变效应，两图分别是重组腺病毒和对照感染细胞后的细胞病变图。
请参见图4。重组腺病毒rAd-Intron A-Cap-WPRE感染猪PK-15细胞后，Cap表达显著升高；
请参见图5。低剂量的rAd-Intron A-Cap-WPRE感染猪PK-15细胞可达到高剂量的rAd-Cap感染猪PK-15细胞后Cap的表达水平，并显著降低载体蛋白的表达。
综上所述，本发明提供了提高了Cap的表达量，从而降低腺病毒使用剂量，减少腺病毒自身蛋白表达量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还可以对本发明做出的若干改进和补充，这些改进和补充，也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，其特征在于，将人巨细胞病毒第一内含子(Intron A)和土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)加入到腺病毒穿梭载体中，完成重组腺病毒的构建。
2.根据权利要求1所述的一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，其特征在于，所述重组腺病毒的构建具体包括如下步骤：
S1依次将Intron A、Cap和WPRE编码基因连接到载体pUC57，测序鉴定，命名为pUC-Intron A-Cap-WPRE；
S2将IntronA、Cap和WPRE连接到pShuttle-CMV。用Xho I和EcoR V双酶切pUC-Intron A-Cap-WPRE和pShuttle-CMV，然后连接Intron A-Cap-WPRE和pShuttle-CMV，转化DH5a，挑菌、摇菌、提质粒，PCR鉴定和单双酶切鉴定正确后，送测序，测序正确后，命名为PS-Intron A-Cap-WPRE；
S3将构建好的PS-Intron A-Cap-WPRE用限制性内切酶Pme I线性化后电转BJ5183与其中的骨架质粒pAdEasy-1进行重组，挑菌、摇菌、提质粒，用限制性内切酶Pac I单酶切鉴定；
S4鉴定正确后用试剂盒提取重组质粒，用限制性内切酶Pac I线性化后的重组质粒转染HEK293A细胞，当细胞病变出现时，收集细胞，离心后将沉淀重悬于PBS；
S5反复冻融3次后，离心取上清，此病毒即为原种腺病毒，命名为rAd-Intron A-Cap-WPRE。
3.根据权利要求2所述的一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中，电转条件为200Ω,2.5kV,25μF。
4.根据权利要求2所述的一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中，用限制性内切酶Pac I线性化的条件为37℃，2h。
5.根据权利要求2所述的一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤S3中，挑取单克隆的方法是：电转化后，涂琼脂板时，同时设立5个梯度的涂菌量，分别为20μL、40μL、60μL、80μL和100μL菌量，在37℃细菌培养箱中放置18h，挑取单克隆菌落，单克隆菌落大小约为中等的菌落，太大或太小均不能挑取，每个梯度挑取10个单克隆重复，共计50个单克隆。
6.根据权利要求2所述的一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中，转染HEK293细胞方法按照优化后的LipofectamineTM 2000转染程序进行转染。具体转染方法如下：(1)将DNA质粒溶于50μL无血清无抗生素的Medium培养液中，轻轻混匀，并在室温下孵育5min；(2)将适量LipofectamineTM 2000溶于50μL无血清无抗生素的Medium培养液中，混匀并在室温下孵育5min；(3)将上述两种混合物混合(总体积100μL)，轻轻混匀，在室温下孵育20min(不能出现雾状沉淀)；(4)上述操作同时，将待转染细胞用PBS清洗两次，在每孔(24孔板)中加入100μL无血清无抗生素的Medium培养液，待DNA质粒/Lipofectamine复合物混合20min后，立即加入待转染细胞孔中，并混匀，然后将细胞于37℃，5％CO2细胞培养箱中培养，约4h后更换为含2％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM细胞培养液，继续培养，并定期用显微镜观察细胞生长情况。
7.根据权利要求2所述的一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤S4中，细胞病变指细胞肿胀、变圆、脱落，但形态完整。
8.根据权利要求2所述的一种优化的猪圆环病毒2型重组腺病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤S5中，离心的条件为3000g，10min。
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李德龙和童德文: "表达PCV2 Cap蛋白的腺病毒载体构建及优化", 《中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十九次学术研讨会论文集》 *

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN107446895A (zh) * 2017-07-24 2017-12-08 西北农林科技大学 分泌型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法
CN107446895B (zh) * 2017-07-24 2020-05-12 西北农林科技大学 分泌型猪圆环病毒2型重组腺病毒及其构建方法
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