CN103014064A - Itr同向排列的aav载体构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明具体涉及一种ITR同向排列的AAV载体pSDAV2，该表达载体主要由两个同向排列的AAV2的ITR、筛选基因表达框和外源基因表达框组成，其中外源基因表达框中含有多克隆位点MCS，用于表达外源基因的插入。将报告基因插入pSDAV2载体，筛选获得细胞株，利用“一个细胞株/一株辅助病毒”策略包装重组AAV病毒，发现ITR同向排列不仅能够明显提高包装获得重组AAV病毒中双链AAV病毒的比例，还能增强包装携带基因的体内外表达效率。总之，本发明提出并构建了一种ITR同向排列的AAV载体，为重组AAV病毒的包装特别是重组双链AAV病毒的包装提供了新的选择。

Description

ITR同向排列的AAV载体构建及其应用

本发明属于生物技术发明领域。本发明具体涉及一种ITR同向排列的AAV载体pSDAV2，该表达载体主要由两个同向排列的AAV2的ITR、筛选基因表达框和外源基因表达框组成，其中外源基因表达框中含有多克隆位点MCS，用于表达外源基因的插入。将报告基因插入pSDAV2载体，筛选获得细胞株，利用“一个细胞株/一株辅助病毒”策略包装重组AAV病毒，发现ITR同向排列不仅能够明显提高包装获得重组AAV病毒中双链AAV病毒的比例，还能增强包装携带基因的体内外表达效率。总之，本发明提出并构建了一种ITR同向排列的AAV载体，为重组AAV病毒的包装特别是重组双链AAV病毒的包装提供了新的选择。

背景

腺相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)属于微小病毒科(Parvovirus)，其基因组为一条单链DNA分子。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态，而不产生子代病毒。

目前已发现多种AAV病毒，从基因组组成和血清学上可以分为不同的亚型(WuZJ，Asokan A，Samulski RJ.Adenoassociated virus serotypes：vector toolkit for humangene therapy.Mol Ther，2006，14(3)：316-327.)。虽然不同的基因组亚型之间，核苷酸序列存在一定的差异，但不同亚型之间的基因组大小和结构是相似的。以AAV2为例，其基因组大小为4675nt，分为反向末端重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)区、rep基因区和cap基因区。ITR区为基因组5’和3’末端两个长度为145nt的反向末端重复序列，包含AAV2基因组的复制起点，与AAV2复制、整合或包装等功能相关，为AAV2病毒基因组中的顺式作用元件。rep基因区和cap基因区为两个功能基因区，编码AAV2生活周期中需要的各种调节蛋白和结构蛋白，为AAV2产毒性复制提供各种反式作用因子。rep基因区编码AAV复制和病毒基因表达等所必需的调节蛋白，根据分子量大小的不同可分为：Rep78、Rep68、Rep52、Rep40等4种形式。cap基因区编码3种结构蛋白，VP1、VP2、VP3，共同组装成AAV病毒的外壳。

AAV是基因治疗的理想载体之一。大量的高质量的重组AAV(RecombinantAAV，rAAV)病毒的制备是AAV载体用于基因治疗的前提和基础。rAAV病毒制备的过程中主要解决的3个问题是，AAV载体质粒的设计和构建，各种反式作用因子(即rep和cap基因编码的各种蛋白)的反式提供和辅助病毒的选择和提供。针对这3个问题，不同的研究者提出了不同的解决方案，形成了多种rAAV病毒的制备系统。目前国际上普遍采用的是Xiao(Xiao X，Li J，Samulski RJ.Production ofhigh-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.J Virol，1998，72(3)：2224-2232.)等提出的三质粒共转染系统。这三个质粒分别为AAV载体质粒，rep-cap表达质粒和辅助质粒。三个质粒分别解决rAAV病毒制备过程中的3个问题。AAV载体质粒包含AAV2的两个ITR序列，且在两个ITR之间插入外源启动子、多克隆位点和polyA加尾信号序列，用于外源表达基因的克隆。rep-cap表达质粒通过编码和表达AAV病毒产毒性复制的各种调节蛋白和结构蛋白，反式提供rAAV病毒包装过程中所需的各种因子。辅助质粒携带了5型腺病毒的E2A、E4ORF6和VA RNA基因，可替代腺病毒，为rAAV病毒的产毒性复制提供辅助功能。在国内rAAV病毒制备应用较为广泛的方法为两个中国专利(专利号：98120033.8，99119038.6)组合报道的“一种病毒感染一个载体细胞株”法系统。专利(专利号：98120033.8)报道了一种携带rep-cap基因表达框的1型单纯疱疹病毒(Herpessimplex virus type 1，HSV1)，这株病毒不仅具有辅助病毒的功能，还可以反式提供各种rAAV病毒产毒性复制所需的各种反式作用因子。专利(专利号：99119038.6)则报道了一系列通用型腺相关病毒载体，应用这些载体可以构建稳定携带AAV载体的细胞株，将专利(专利号：98120033.8)中的辅助病毒感染AAV载体细胞株，制备获得大量的rAAV病毒。

这些rAAV病毒制备系统的提出促进了AAV载体在基因治疗等领域中的应用。但由于AAV病毒本身基因组为单链DNA分子，因此AAV病毒进入细胞后，需要先合成其互补链才能开始携带的外源基因的表达，导致外源基因表达的延后和效率降低，限制了rAAV载体的进一步应用。scrAAV(Self compl ementary rAAV)载体制备系统的提出解决了这一问题。通过缺失AAV载体中一个ITR的TRS(Terminalresolution site)序列，导致Rep蛋白不能对缺失TRS的ITR进行切割，因此包装获得rAAV病毒携带两个正常的ITR、缺失d序列的ITR和完全互补的外源基因表达框的两条单链(在rAAV 5000nt包装容量允许的范围内)，获得自身基因组可互补的rAAV(scrAAV)载体。scrAAV载体进入细胞后其基因组可以自身互补配对形成双链，不依赖于细胞合成其互补链，提高携带外源基因的表达速度和效率。虽然由于rAAV包装容量(不大于5000nt)的限制，scrAAV可携带的外源基因的表达框的大小不能大于2500bp，限制了scrAAV载体对某些较大外源基因表达框的携带，但是scrAAV可以显著地提高外源基因的表达效率，降低其在基因治疗中的用量，因此scrAAV载体在基因治疗中，特别是以较小基因(如hFIX、siRNA、miRNA和核酶等)为导入基因的基因治疗中仍具有广泛的应用前景。而且，近年来一些较小高效的顺式作用元件(如启动子、加尾信号等)的出现，有效地降低了其在外源基因表达框中的所占容量，扩大了scrAAV载体可携带外源基因的长度。

由于Rep蛋白不能完全识别并切割ITR中的TRS序列，因此当rAAV载体携带的外源基因表达框小于2500bp时，包装获得的rAAV载体也存在一定比例的scrAAV，但比例小于50％。为了提高包装获得rAAV载体中scrAAV的比例，常采用的策略是降低包装系统中的Rep蛋白表达量和对ITR中的TRS序列进行突变操作。在三质粒包装系统中，常采用将Rep基因的起始密码子由“ATG”突变为“ACG”和启动子远离Rep基因的方法降低Rep蛋白的表达水平。对ITR中TRS序列的突变操作则为对TRS序列中的D序列进行点突变和缺失突变，使Rep蛋白不能识别。经过这些改造，利用三质粒包装系统获得scrAAV载体的比例可达90％以上。虽然降低Rep基因的表达水平可以提高包装获得载体中scrAAV载体的比例，但是在不影响外源基因表达的情况下，改变ITR的结构使Rep蛋白不能识别，仍然是显著提高包装获得scrAAV载体比例的重要策略之一。

ITR是AAV病毒中重要的顺式作用元件，在AAV病毒基因组的复制、AAV病毒颗粒的包装等过程中都发挥作用。而且在天然状态下，AAV病毒基因组的两个ITR反向排列，这种排列方式保证了其基因组复制过程中的精确性和AAV病毒基因组整合入细胞基因组后的有效拯救。目前，常用的AAV载体都将两个ITR反向排列，并在两个ITR序列之间插入外源基因表达框。相反，在本发明中，我们提出了一种新的AAV载体即ITR同向排列的AAV载体，并在同向排列的两个ITR之间插入外源基因表达框。我们的研究表明ITR同向排列的AAV载体不仅不会影响rAAV病毒载体的包装和外源基因的体内外表达还可显著提高包装获得rAAV病毒中scrAAV载体的比例，为scrAAV载体制备提供了一种新的选择。同时，本发明提出的ITR同向排列的AAV载体，只是改变了原类型AAV载体中ITR的排列方向，并未对ITR的序列进行突变等操作，而是利用AAV病毒拯救复制过程中产生缺陷的ITR，使Rep蛋白在包装过程中不能切割，从而提高获得rAAV病毒中scrAAV载体的比例。利用AAV病毒本身的拯救复制机制，减少了操作的复杂性，使scrAAV载体的构建过程变得更加简单、方便。

发明概述

本发明的第一个技术特征是构建了一种两个ITR同向排列的AAV载体pSDAV2，并在两个同向排列的ITR之间插入外源基因的表达框，表达框内携带多克隆位点(Multiple cloning sites，MCS)，用于外源表达基因的插入。本发明的第二个技术特征是该载体可用于rAAV病毒的包装制备，且可显著提高包装获得rAAV病毒载体的scrAAV载体的比例，ITR的同向排列并不影响包装获得rAAV病毒外源基因的体内外表达特征。本发明的第三个特征是该载体还携带neo基因表达框，可用于筛选获得稳定表达外源基因的细胞株，获得的细胞株不仅可用于rAAV病毒载体的包装制备还可用作外源基因的蛋白表达生产细胞株。

发明详述

ITR在AAV病毒的基因组复制和病毒包装过程中均发挥了重要作用。在天然条件下，AAV病毒基因组中的两个ITR序列反向排列，有利于AAV病毒基因组复制的精确性。rAAV病毒包装系统中，AAV载体中的两个ITR序列保持了其在AAV病毒基因组中的反向排列顺序。相反，本发明提出并构建了一种ITR同向排列的AAV载体pSDAV2。在该载体中，两个ITR序列同向排列，且在两个ITR之间插入携带MCS位点的外源基因表达框，获得一种可插入外源基因的通用型表达载体pSDAV2。同时，该载体还携带neo基因表达框，用于筛选获得稳定表达外源基因的细胞株，该细胞株可进一步应用于rAAV病毒的制备和外源基因的表达产物的大量制备。在本发明中，我们主要研究了ITR同向排列对rAAV病毒包装的影响，包括三个方面的内容：1、ITR同向排列是否会影响rAAV病毒的包装过程；2、ITR同向排列的AAV载体pSDAV包装获得rAAV病毒中scrAAV病毒载体的所占比例；3、ITR同向排列对包装所获得rAAV病毒中外源基因的体内外表达特征的影响。

为此，我们首先合成了AAV2的ITR序列，并在其两端引入合适的酶切位点。然后，用合成的ITR序列替换本公司原有pAAV2neo载体中的一个ITR序列，使两个ITR序列同向排列，同时删除了pAAV2neo载体中的部分冗余序列，获得pSDAV2。此后，我们将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green flurocent protein，EGFP)克隆入pSDAV2载体，获得pSDAV2-EGFP。将pSDAV2-EGFP转染BHK21细胞，筛选获得EGFP稳定表达细胞株，包装获得rAAV病毒rAAV2-EGFP’。随后，我们用Sourthern Blot方法分析了rAAV2-EGFP’中scrAAV所占比例，并比较分析了rAAV2-EGFP’和rAAV2-EGFP(由原pAAV2neo载体为基本骨架，插入EGFP基因包装获得的病毒，参见专利申请号：200910009059.6，发明名称：AAV病毒反向感染技术及AAV病毒阵列，该申请的附图1)的体内外表达特征。这些结果表明ITR的同向排列不仅可以rAAV病毒的包装和包装获得rAAV病毒中报告基因EGFP的体内外表达效率，还可提高包装获得rAAV病毒中scrAAV病毒的比例。总之，本发明提出并构建的pSDAV2载体为scrAAV病毒载体的包装提供了一种新的选择。

附图说明：

图1pAAV2neo质粒图谱。图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH poly(A)是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；Amp是氨苄青霉素抗性基因。

图2pMD18T-R-ITR质粒图谱。图中ITR代表AAV2病毒基因组的反向末端重复序列；promoter是原核启动子，用于pMD18T-R-ITR中相关基因的转录。

图3pSDAV2-Pre质粒图谱。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH poly(A)是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；Amp是氨苄青霉素抗性基因。

图4pSDAV2质粒图谱。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；BGH poly(A)是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；Amp是氨苄青霉素抗性基因。

图5pSDAV2-EGFP质粒图谱。图中ITR代表AAV病毒基因组的反向末端重复序列；CMV promoter是人巨细胞病毒的启动子；EGFP是增强型绿色荧光蛋白基因；BGH poly(A)是牛生长激素基因的加尾信号序列；neo是新霉素抗性基因；Amp是氨苄青霉素抗性基因。

图6Southern blot检测包装获得rAAV2-EGFP’中scrAAV的比例结果。Southern blot检测包装获得rAAV2-EGFP’中scrAAV的比例，并与ITR反向排列的包装获得的rAAV2-EGFP比较。泳道1和3是rAAV2-EGFP提取基因组DNA分别上样5μL和10μL，碱性琼脂糖凝胶电泳后，southern blot检测结果；泳道2和4是rAAV2-EGFP’提取基因组DNA分别上样5μL和10μL，碱性琼脂糖凝胶电泳后，southern blot检测结果。

图7ITR同向排列AAV病毒拯救过程示意图。本图示意了ITR同向排列的AAV载体整合入细胞染色体中的拯救过程。拯救过程分为9步，图A至J中a、a’、b、b’、c、c’、d和d’分别表示ITR中的部分序列，其中a和a’、b和b’、c和c’、d和d’互补配对，使单链ITR能够自我折叠形成“T”字型结构。复制过程中，新合成的序列用粗线表示。具体的拯救过程为，首先ITR同向排列的AAV载体整合入细胞染色体，形成如图A所示的结构；然后ITR序列被AAV病毒的Rep蛋白识别、结合并d序列中产生切口，形成如图B所示的结构；在细胞内DNA损伤修复机制的作用下，切口发生移动，一端ITR完成复制，另一端ITR形成缺失部分d序列的单链(图C)；该单链中ITR序列自我折叠，形成“T”字型结构(图D)；在此基础上，进行自我复制，结构如图E所示。完成复制后，在Rep蛋白的作用，在d序列处再次产生切口(图F)，开始新一轮的复制过程。同样，完成ITR的复制过程后(图G)，新合成链(图G中粗线表示)中ITR序列再次自我折叠，形成“T”字型结构(图H)，开始再次复制过程，完成复制过程后的结构示意图如图I所示。图I中ITR序列进一步折叠形成，形成“T”字型结构，两个正常的ITR之间，包含一个缺失d序列的ITR，使包装获得的AAV病毒单链基因组中完全互补的序列，可互补配对形成双链(图J)。

图8rAAV2-EGFP和rAAV2-EGFP’分别感染B16F10、3LL和NIH/3T3细胞结果。图A和图D分别表示rAAV2-EGFP’和rAAV2-EGFP感染B16F10细胞48h后，荧光显微镜拍照结果；图B和图E分别表示rAAV2-EGFP’和rAAV2-EGFP感染3LL细胞48h后，荧光显微镜拍照结果；图C和图F分别表示rAAV2-EGFP’和rAAV2-EGFP感染NIH/3T3细胞48h后，荧光显微镜拍照结果。

图9rAAV2-EGFP’和rAAV2-EGFP体内表达特征比较结果。rAAV2-EGFP’和rAAV2-EGFP分别注射C57BL/6小鼠右后肢胫前肌，不同时间处死小鼠取右后肢胫前肌，冰冻切片后，荧光显微镜观察拍照，并在注射病毒6周后对小鼠右后肢胫前肌拍照。图A至D表示的是rAAV2-EGFP’注射C57BL/6小鼠1周、2周、6周和6个月后，处死小鼠取右后肢胫前肌，冰冻切片后，荧光显微镜观察拍照结果；图E表示的rAAV2-EGFP’注射C57BL/6小鼠6周后，右后肢胫前肌拍照结果；图F至H表示的是rAAV2-EGFP’注射C57BL/6小鼠1周、2周、6周和6个月后，处死小鼠取右后肢胫前肌，冰冻切片后，荧光显微镜观察拍照结果；图I表示的rAAV2-EGFP’注射C57BL/6小鼠6周后，右后肢胫前肌拍照结果。

以下实施例对本发明的ITR同向排列的AAV构建及其应用作了详细说明，但并不意味着限制本发明的内容。

实施例1ITR同向排列的通用型AAV载体pSDAV2的构建

1、ITR序列的设计合成

首先，我们对本公司原有的AAV载体pAAV2neo(图1)进行了酶切位点分析，选择pAAV2neo载体中离CMV启动子较近的ITR为替换对象，并选择了HpaI和XhoI两个酶切位点用于切除替换的ITR序列。根据选定的用于切除ITR序列酶切位点，我们设计并合成携带ITR的序列R-ITR(委托Takara公司合成，大连，中国)，并将该序列克隆入pMD18T simple(委托Takara公司合成，大连，中国)，命名为pMD18T-R-ITR(图2)。合成R-ITR序列具体如下：

5’ctcgag

ttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcat

XhoI XbaI

ttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatct

ttggccactccct

                                                          NheI

ctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccgggcggcc

tcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct

3’

                                                          Hpal

在合成序列的两端分别引入XhoI和HpaI酶切位点，但与ITR的相对方向和原来相反，使替换后两个ITR同向排列。同时为了方便克隆操作，在ITR序列(即酶切位点NheI和HpaI之间的序列)的5’端引入长度为133bp的冗余序列(即XbaI和NheI之间的序列)。用合成序列替换原ITR相关序列后，XbaI和NheI消化、连接去除冗余序列。

2、pSDAV2载体的构建

为了构建ITR同向排列的AAV通用型载体pSDAV2，我们首先用HpaI和XhoI(NEB，美国)消化本公司原有的AAV载体pAAV2neo，切除ITR序列，琼脂糖凝胶电泳后，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen，北京，中国)回收长度为6787bp的载体片段。同时用HpaI和XhoI(NEB，美国)消化pMD18T-R-ITR，琼脂糖凝胶电泳后，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen，北京，中国)回收大小为296bp的片段。将该片段与回收的载体片段用T4DNA连接酶(NEB，美国)连接后，转化E.coli JM109感受态细胞(Takara，大连，中国)，挑取克隆，酶切鉴定正确后，获得pSDAV2-pre(图3)。在此基础上，用XbaI和NheI(NEB，美国)消化pSDAV2-pre，琼脂糖凝胶电泳后，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen，北京，中国)回收大小为6948bp的载体片段。载体片段T4DNA连接酶连接后，转化E.coli JM109感受态细胞(Takara，大连，中国)，挑取克隆，酶切鉴定正确后，获得pSDAV2(图4)。

实施例2pSDAV2-EGFP载体的构建

为了验证ITR同向排列的通用型载体pSDAV2的功能，我们先用KpnI和EcoRI(NEB，美国)消化pSDAV2载体，琼脂糖凝胶电泳后，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen，北京，中国)回收大小为6942bp的载体片段。同时，用KpnI和EcoRI(NEB，美国)消化pAAV2neo-EGFP(本公司构建并保存)，琼脂糖凝胶电泳后，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Tiangen，北京，中国)回收大小为756bp的EGFP基因片段。将EGFP基因片段和载体片段用T4DNA连接酶(NEB，美国)连接后，转化E.coli JM109感受态细胞(Takara，大连，中国)，挑取克隆，提取质粒，酶切鉴定正确，获得pSDAV2-EGFP(图5)。

实施例3rAAV2-EGFP’病毒的制备

将质粒pSDAV2-EGFP用Lipofectamine 2000(Invitrogen，美国)转染BHK21细胞，转染过程参见Lipofectamine 2000说明书。具体的转染过程如下：转染前1d，BHK21细胞接种于24孔细胞培养板(1x10⁵个细胞/孔)；转染前4h，培养BHK21细胞用10％FBS DMEM(Invitrogen，美国)换液(300μL/孔)。转染时按如下过程配制转染液，以每孔为例具体说明。取50μL OPTI-MEM(Invitrogen，美国)加入2μL Lipofectamine 2000，同时，取50μL OPTI-MEM(Invitrogen，美国)加入0.8μg的pSDAV2-EGFP质粒，分别轻弹混匀，室温放置5min。然后将两种液体混合，轻弹混匀，室温静置20min，加入培养细胞中，并前后左右晃动混匀。转染后细胞于5％CO₂ 37℃孵箱中培养过夜，第二天待细胞密度至90％以上，将细胞消化转移至6孔细胞培养板中，并用G418终浓度为800μg/ml的10％FBS DMEM培养基选择培养15d，获得稳定表达EGFP细胞株BHK21/EGFP，并挑取12个单细胞克隆，依次编号为C1-C12。利用伍志坚(Wu ZJ，Wu XB，Hou YD.Contruction of arecombinant herpes simplex virus which can provide packaging function for recombinantadeno-associated virus.Chin Sci Bull，1999，44(8)：715-719.)等报道的方法包装获得rAAV2-EGFP’病毒，吴小兵(Wu XB，Dong XY，Wu ZJ，et al.A novel method forpurification of recombinant adeno-associated virus vectors on a large scale.Chin Sci Bull，2001，46(6)：485-489.)等报道的方法浓缩纯化病毒，斑点杂交法检测包装获得rAAV2-EGFP’病毒滴度，结果表明单细胞克隆C6包装效率最高，选用C6克隆用于rAAV2-EGFP’病毒的大量制备。

实施例4Southern blot检测包装获得rAAV2-EGFP’中scrAAV的比例

为了检测用pSDAV2-EGFP包装获得rAAV2-EGFP’中scrAAV的比例，我们对包装获得的rAAV2-EGFP’进行了southern blot分析。首先，我们提取rAAV2-EGFP’病毒基因组，并同时提取pAAV2neo-EGFP包装获得rAAV2-EGFP病毒基因组作为对照。然后，提取的rAAV2-EGFP和rAAV2-EGFP’病毒基因组上样，行碱变性琼脂糖电泳，虹吸法转移至带正电的尼龙膜上，地高辛标记的CMV探针杂交，碱磷酶标记抗地高辛抗体孵育结合，BCIP/NBT检测试剂盒显色，结果如图6所示。从图的结果可知，虽然rAAV2-EGFP中也存在一定的双链形式，但单链形式占90％以上；相反，rAAV2-EGFP’则主要以双链形式为主，占60％以上。这表明ITR同向排列的AAV载体不仅不影响rAAV病毒的包装，还可以显著地提高包装获得rAAV病毒中双链形式比例。这种提高rAAV病毒中双链形式包装比例的策略不同于直接改变AAV载体中的TRS序列，而是改变天然AAV病毒中两个ITR序列的排列顺序(反向排列)，使两个ITR序列在AAV载体pSDAV2中正向排列。pSDAV2载体整合入染色体后，在rAAV病毒本身的天然拯救过程中，产生D序列缺失的ITR序列，包装获得双链rAAV病毒。

rAAV病毒的拯救过程如图7所示。pSDAV2整合入细胞染色体后的结构如图A所示，a、b、c、d和a’、b’、c’、d’分别表示ITR中的部分序列，其中a和a’，b和b’，c和c’，d和d’两两完全互补。Rep蛋白识别并结合ITR中的TRS序列(d序列)，并产生切口，在细胞内DNA修复相关酶的作用下，替换其中一个ITR序列，并删除另一个ITR的d序列，在Rep蛋白的作用下，折叠形成如图所示的ITR二级结构。然后，以其中一个ITR形成的二级结构为引物，开始DNA的复制过程。待DNA复制过程完成后，形成的双链d序列，又被Rep蛋白识别结合并产生切口，开始DNA的重新复制。复制完成后，在Rep蛋白的作用下，ITR重新折叠形成其二级结构，DNA进一步复制，如此反复，形成正常ITR和d序列缺失ITR间隔依次排列的多个重复AAV病毒基因组。由于Rep蛋白只能识别并切割正常ITR序列，因此在包装过程中形成携带两个正常ITR序列、缺失d序列ITR序列和完全互补两条单链序列的自身互补的AAV(Self complementary AAV，scAAV)病毒颗粒。

实施例5rAAV2-EGFP’转导细胞表达特点研究

为了研究rAAV2-EGFP’转导细胞的表达特点，我们将rAAV2-EGFP和rAAV2-EGFP’分别以1x10⁵vg/细胞(viral genome，vg)转导B16F10、3LL和NIH/3T3细胞。48h后，荧光倒置显微镜(Nikon TE-300)观察EGFP表达情况并拍照，如图8所示。结果表明，在三种细胞中，转导rAAV2-EGFP’均比转导rAAV2-EGFP细胞的EGFP表达效率高，这说明scrAAV能够有效地提高外源基因在细胞内的表达水平。而且，B16F10为肝癌来源细胞系，3LL为肺癌来源细胞系，NIH/3T3为成纤维细胞，在三种不同来源的细胞，均呈现相似的表达规律，这进一步说明scrAAV提高外源基因在细胞内表达水平的普遍性。

实施例6rAAV2-EGFP’转导小鼠肌肉表达特点研究

为了研究rAAV2-EGFP’的体内表达特点，rAAV2-EGFP和rAAV2-EGFP’分别以1x10¹⁰vg/只注射于6-8周龄C57BL/6小鼠(中国医学科学院实验动物学研究所，北京，中国)右后肢胫前肌。注射rAAV2-EGFP’和rAAV2-EGFP不同时间(1周、2周、6周和6个月)后，分别取注射右后肢胫前肌，冰冻切片，荧光倒置显微镜(NikonTE-300)观察EGFP表达情况并拍照，如图9A-D和图9F-H所示。同时，对注射6周后的整个右后肢胫前肌拍照，如图9E和图9I所示。结果表明体内的实验结果与体外的一致，rAAV2-EGFP’转导小鼠胫前肌的效率明显比rAAV2-EGFP高，这再次证明scrAAV能够有效提高外源基因在体内的表达效率。

名词及缩写词解释

1、AAV：adeno-associated virus，腺相关病毒。

2、ITR：inverted terminal repeat，倒转末端重复。

3、AAV2病毒：2型AAV病毒(adeno-associated virus serotype 2)。

4、pAAV2neo质粒：是一种携带了AAV2病毒ITR的质粒DNA。所述的AAV载体质粒一般由AAV2ITR、启动子、目的基因或阻断序列、ployA、AAV2 ITR以及E.coli质粒骨架组成。质粒骨架上携带了neo基因的表达单位。

5、CMV promoter：人巨细胞病毒的启动子。

6、BGH poly(A)：牛生长激素基因的加尾信号序列。

7、Neo：氨基糖转移酶基因。

8、Amp：氨苄青霉素抗性基因。

Claims (8)

1.ITR同向排列的AAV载体，其技术特征在于：两个AAV2 ITR同向排列且ITR间包含一个外源基因表达框，用于外源基因的插入。

2.如权利要求1所述，该载体可用于重组AAV病毒的制备，且明显提高重组AAV病毒中scrAAV(Self complementary rAAV)的比例，scrAAV比例达到60％以上。

3.如权利要求2所述，包装获得rAAV病毒可明显提高外源基因在体内外的表达强度。

4.如权利要求1所述，外源基因表达框中的启动子可以是CMV、CAG、TTR、SV40等多种启动子，并根据不同的需要进行选择。

5.如权利要求1所述，外源基因可以是蛋白编码基因、shRNA、siRNA、miRNA等多种基因。

6.如权利要求1所述，该载体整合入细胞染色体后，病毒包装拯救过程中可产生d序列缺失的ITR。

7.如权利要求1所述，该载体可应用于以HSV1为辅助病毒的rAAV载体包装系统。

8.如权利要求1所述，该载体包含neo基因表达框，可用于筛选获得外源基因的稳定表达细胞株。

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