CN105838738A - 一种携带ctag1b/ny-eso-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体及构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种携带CTAG1B/NY‑ESO‑1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体，其构建方法，包括以下步骤：（1）体外克隆CTAG1B/NY‑ESO‑1基因；（2）将pscAAV‑MCS载体和克隆基因分别用限制性内切酶EcoR I和Xba I进行双酶切，然后DNA连接得携带CTAG1B基因的重组载体pscAAV‑CTAG1B；（3）测序鉴定。本发明所用肿瘤抗原基因有表达范围广、特异性高的特点；自补型重组腺相关病毒scAAV6有安全性高、侵染能力强的特点；基于pscAAV‑CTAG1B重组载体的细胞免疫治疗能有效缓解CTAG1B/NY‑ESO‑1抗原阳性肿瘤患者病情，且副作用小。
Description
技术领域
本发明属于重组腺相关病毒载体技术领域，具体涉及一种携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体及构建方法和该载体在抗CTAG1B/NY-ESO-1抗原阳性肿瘤细胞免疫疗法中的应用。
背景技术
肿瘤是全球范围内危害人们身体健康和生命的重大疾病之一。肿瘤治疗方式主要包括手术、放疗、化疗、靶向治疗以及免疫治疗等，这些治疗方式能一定程度抑制肿瘤的生长，但是通常也伴随着一定的副作用。对于靶向治疗和免疫治疗来说，靶点(即肿瘤抗原)的选取尤为重要，关乎到疗效的高低和副作用的大小程度。CTAG1B/NY-ESO-1是一种癌/睾丸抗原(cancer-testis antigen)，其基因位于X染色体上Xq28区域。但CTAG1B/NY-ESO-1仅在睾丸组织中表达，而在其他成体组织中不表达。在肿瘤细胞中，由于表观遗传因素的改变而导致CTAG1B/NY-ESO-1的异常表达。NY-ESO-1是在1990s年代末由康奈尔大学(位于纽约，NewYork)的研究人员在食管癌(esophageal cancer)中发现的，并因此而命名。除了在食管癌中表达外，CTAG1B/NY-ESO-1在黑色素瘤、滑膜肉瘤、胃癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、卵巢癌以及膀胱癌等多种肿瘤中均有表达。CTAG1B/NY-ESO-1的表达量还与肿瘤恶性程度相关，并且可作为肿瘤治疗预后的指标之一。
CTAG1B/NY-ESO-1是一个潜在的肿瘤免疫治疗靶点，它广泛并且特异地表达于多种肿瘤组织中，同时它还具有良好的免疫原性。等在黑色素瘤肿瘤患者体内检测到了NY-ESO-1的特异性抗体，并从外周血中筛选到了能够特异识 别NY-ESO-1：157–165，157–167和155–163表位的CD8+T细胞株。一项临床试验表明使用NY-ESO-1：157–165，157–167和155–163肽段作为疫苗能够诱导抗原特异性的CD8+T细胞，并抑制肿瘤的生长和转移。然而针对NY-ESO-1特征性抗原表位的疫苗具有一定的局限性，治疗效果也十分有限。Hunder等发明了一种体外分离和扩增特异性靶向NY-ESO-1的自体CD4+T细胞的技术，并成功用于治疗了一例复发性、转移性的黑色素瘤肿瘤患者。该技术利用NY-ESO-1：157-170表位制成的肽段激活DC细胞，然后DC细胞与T细胞共培养诱导抗原特异性的T细胞。该方法的缺点在于：1、抗原肽段的半衰期有限，使用抗原段激活DC细胞需要反复添加；2、抗原肽段诱导的活化T细胞多样性有局限，与体内天然存在的NY-ESO-1特异性的T细胞有差异。Rosenberg等研发了靶向NY-ESO-1的TCR-T细胞免疫治疗方法，将特异识别NY-ESO-1：157-165的TCR基因克隆至慢病毒或逆转录病毒载体上，然后制备病毒感染T细胞，通过基因工程的手段改造T细胞使其表达特异性的TCR受体，该方法在临床试验中也取得了一定的进展。但是TCR-T细胞免疫治疗具有MHC限制性的特点，即肿瘤患者必须是NY-ESO-1和HLA-A*0201双阳性才能使用该治疗方式。CTAG1B/NY-ESO-1是一个很好的靶点，但是上述的靶向该抗原的免疫治疗方法都有值得改进的地方。
重组腺相关病毒(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低、在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一。经过多年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。按照中和血清类型的不同，重组腺相关病毒可分为11种血清型，不同血清型的重组腺相关病毒表现出不同的组织 侵染能力。例如AAV2具有广谱的组织嗜性，如肝、肺、肌肉、神经系统等，但侵染效率一般；而AAV7更倾向于在骨骼肌中的侵染，而不能侵染其他组织。对于DC细胞的侵染而言，AAV2、AAV6的使用均有报道，但AAV6的侵染效率更胜一筹。重组腺相关病毒是一种单链DNA病毒，在宿主细胞内，其单链DNA需要首先转换为双链DNA才能进行表达，因而限制了其表达效率。自补型重组腺相关病毒(self-complementary，scAAV)则克服了这一障碍，通过在载体右端的IRT(Inverted Terminal Repeats)区域引入特定的缺失和突变，从而在病毒包装过程中可以形成双链的基因组。
但将CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因用于构建自补型重组腺相关病毒载体并将其用于抗CTAG1B/NY-ESO-1阳性肿瘤细胞免疫治疗中未见报道。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体及构建方法和应用。本发明采用了scAAV6-DC-CTL细胞免疫治疗技术，将肿瘤抗原基因CTAG1B/NY-ESO-1输入到树突状细胞(DC)中，通过DC细胞和T细胞共培养诱导出抗原特异性的杀伤性T细胞(CTL)，该方法安全性高，副作用小，靶向性强，能有效杀伤CTAG1B/NY-ESO-1抗原阳性的肿瘤细胞。
为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：
一种携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)体外克隆CTAG1B/NY-ESO-1基因；
(2)将pscAAV-MCS载体和CTAG1B/NY-ESO-1基因分别用限制性内切酶EcoR I和XbaI进行双酶切，然后进行DNA连接反应，得到携带CTAG1B基因 的重组载体pscAAV-CTAG1B；
(3)测序鉴定。
进一步地，步骤(1)中克隆CTAG1B/NY-ESO-1基因的方法为：从H1299肺癌细胞株中提取总RNA，逆转录得到总cDNA，然后以cDNA为模板，在正义链引物5’-CCTGAATTCCCCTGACCTTCTCTCTGA-3’(SEQID-1)和反义链引物5’-ACATCTAGACAGGCCCCCACAATGAAC-3’(SEQID-2)的引导下进行PCR反应，得到所述的CTAG1B/NY-ESO-1基因。
进一步地，上述所说的PCR扩增反应体系为：5xPrime STAR Buffer(Mg2+Plus)10μL、dNTP Mixture(2.5mM each)4μL、Primer F 1μL、Primer R 1μL、cDNA 2μL、Prime STARHS DNA Polymerase 0.5μL、dH2O 31.5μL。
进一步地，上述所说的PCR扩增反应条件为：98℃预变性5分钟，接着98℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存5分钟。
进一步地，步骤(2)中酶切反应体系为：1μg pscAAV-MCS质粒/CTAG1B/NY-ESO-1基因，1μL EcoR I，1μL XbaI，5μL 10×NEB Buffer以及适量去离子水，总体积为50μL；反应条件为：37℃，1.5小时。
上述任一项构建方法构建出的携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体。
上述所述的一种携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体在CTAG1B/NY-ESO-1抗原阳性肿瘤的细胞免疫疗法方面的应用。
进一步地，携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体与突变型辅助载体pAAV6-RC6MUT和pHelper按摩尔比为1：1：1，共同 用于CTAG1B/NY-ESO-1抗原阳性肿瘤的细胞免疫疗法。
进一步地，所述的突变型辅助载体pAAV6-RC6MUT的构建方法为：将野生型载体pAAV6-RC6上的四个位点T251，T492，S563和S663分步突变为缬氨酸，得突变性辅助载体pAAV6-RC6MUT即pAAV6-RC6-T251V+T492V+S563V+S663V；其中反应体系为10xReactionbuffer(Mg2+Plus)5μL，10ng/μL Sample plasmid 2μL，10pmol/μL primer F 1μL，10pmol/μL primer R 1μL，dNTP mixture(2.5mM each)2μL，1μL Muta-direct Enzyme，38μL dH2O；反应条件为：95℃预变性30秒，95℃变性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸8分钟，共15个循环，最后4℃保存5分钟；点突变反应所用引物如下：
T251V-F：CCTTGCCCACCTATAACAGTCACCTCTACAAGCAAATC(SEQID-3)；
T251V-R：GATTTGCTTGTAGAGGTGACTGTTATAGGTGGGCAAGG(SEQID-4)；
T492V-F：CTAAAACAAAAACAGGTAACAACAACAGCAAC(SEQID-5)；
T492V-R：GTTGCTGTTGTTGTTACCTGTTTTTGTTTTAG(SEQID-6)；
S563V-F：TCACAGACGAAGAGGAAAGTAAAGCCACTAACCCCGTG(SEQID-7)；
S563V-R：CACGGGGTTAGTGGCTTTACTTTCCTCTTCGTCTGTGA(SEQID-8)；
S663V-F：CAGAGTTTTCGGCTACAAGTTTTGCTTCATTCATCACC(SEQID-9)；
S663V-R：GGTGATGAATGAAGCAAAACTTGTAGCCGAAAACTCTG (SEQID-10)。
将携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体用于抗肿瘤细胞免疫治疗，治疗过程为：将重组载体pscAAV-CTAG1B、突变型辅助载体pAAV6-RC6MUT和pHelper共转染到293AAV细胞中制备自补型重组腺相关病毒(scAAV6)，再使用scAAV6侵染单核树突状细胞(DC细胞)，感染复数MOI为20,000vgs/cell，48h后重复侵染一次，然后将DC细胞与T细胞按数量比为1:10共培养，诱导产生特异性的抗肿瘤活性T细胞(CTL)，一周后再用scAAV6侵染过的DC细胞去刺激T细胞，T细胞经大量扩增，并按照1-3×109cells/m2对CTAG1B/NY-ESO-1抗原阳性的肿瘤患者进行回输治疗。
本发明提供的一种携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体及构建方法和应用，具有以下有益效果：
(1)本发明的肿瘤抗原基因CTAG1B/NY-ESO-1具有表达范围广、特异性高的特点，是很好的免疫治疗靶点。
(2)本发明的自补型重组腺相关病毒scAAV6具有安全性高、侵染能力强的特点，尤其对于DC细胞具有很好的嗜性。
(3)本发明的靶向CTAG1B/NY-ESO-1的scAAV6-DC-CTL细胞免疫治疗方法能有效杀伤CTAG1B/NY-ESO-1抗原阳性的肿瘤细胞，能有效缓解CTAG1B/NY-ESO-1抗原阳性肿瘤患者的病情，且副作用很小。
附图说明
图1为PCR克隆CTAG1B/NY-ESO-1基因的琼脂糖电泳图。
图2为pscAAV-MCS质粒的结构示意图。
图3为重组载体pscAAV-CTAG1B的PCR鉴定结果图。
图4为重组载体pscAAV-CTAG1B的双酶切鉴定结果图；其中泳道1为载体pscAAV-MCS酶切结果图，泳道2为重组载体pscAAV-CTAG1B的酶切结果图。
图5为定量PCR测定scAAV6病毒基因组滴度的实验结果图。
图6为scAAV6-DC-CTL细胞免疫治疗的流程图。
图7为scAAV6侵染树突状细胞的效率分析图，其中A为无病毒阴性对照，B为野生型scAAV6，C为突变型scAAV6。
图8为树突状细胞表面分子CD80、CD86流式分析结果图。
图9为流式细胞仪测定T细胞活化标志物OX40、4-1BB的分析结果图。
图10为CTL细胞体外杀伤H1299肿瘤细胞的分析结果图。
具体实施方式
实施例1 pscAAV-CTAG1B重组载体的构建及鉴定
一、材料及来源
1、pscAAV-MCS质粒：从美国Cell Biolabs公司购买。
2、H1299细胞：从中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库购买。
3、基因扩增引物：根据NCBI数据库中CTAG1B/NY-ESO-1基因的mRNA序列设计(NM_001327.2)。
二、携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体的构建
本实施例所提供的构建方法，是使用限制性内切酶将载体的多克隆位点切开，再运用DNA连接技术将CTAG1B/NY-ESO-1基因与载体进行连接反应，得到pscAAV-CTAG1B重组载体，具体过程包括以下步骤：
(1)获取总cDNA，具体方法为：采用Trizol试剂(Life technology公司)提取H1299细胞的总RNA，首先离心收集细胞(1×107cells)，加入1mLTrizol进行提取，RNA沉淀用50μLDEPC-H2O溶解，并测定其浓度；
以1μg RNA为模板，进行逆转录反应，逆转录反应体系(20μL)为：1μL Oligo(dT)18，2μL dNTP Mix(10mM each)，1μL Revert Aid M-MuL V，1μL RNase Inhibitor，4μL 5×Reaction Buffer，所用试剂盒为Thermo Scientifi公司购买，反应条件为42℃，1小时，得到cDNA，-20℃保存待用；
(2)PCR克隆CTAG1B/NY-ESO-1基因，具体方法为：以上述cDNA为模板，在引物1(SEQID-1)5’-CCTGAATTCCCCTGACCTTCTCTCTGA-3’和引物2(SEQID-2)5’-ACATCTAGACAGGCCCCCACAATGAAC-3’的引导下进行RCR扩增反应，得到CTAG1B/NY-ESO-1基因；
PCR扩增反应体系为：10μL 5xPrime STAR Buffer(Mg2+Plus)，4μL dNTP Mixture(2.5mM each)，1μL Primer F，1μL Primer R，2μL cDNA,0.5μL Prime STAR HS DNAPolymerase，31.5μL dH2O；
PCR扩增条件为：98℃预变性5分钟，98℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，共30个循环；最后72℃延伸10分钟，4℃保存5分钟，反应结束后，对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，在680bp的位置出现了一条特异性条带(如图1所示)，将该目的条带进行回收纯化处理；
(3)构建pscAAV-CTAG1B重组载体：分别对pscAAV-MCS质粒(如图2所示)和CTAG1B/NY-ESO-1基因进行限制性内切酶反应，纯化后进行酶连反应，所用限制性内切酶为EcoR I@HF和XbaI(购自NEB公司)，酶切反应体系为：1μg pscAAV-MCS质粒或CTAG1B/NY-ESO-1基因，1μL EcoR I@HF，1μL XbaI，5μL 10×NEB Buffer以及适量去离子水，总体积为50μL；反应条件为：37℃， 1.5小时，反应结束后使用AxygenTM AxyprepTM PCR Clean-up Kit试剂盒进行纯化处理，并测定浓度，最后使用T4 DNA连接酶进行连接反应，反应体系为：1μL T4DNALigase(购自TaKaRa公司)，2μL 10×ReactionBuffer，0.3pmol CTAG1B/NY-ESO-1基因片段，0.03pmol pscAAV-MCS质粒片段，以及适量的去离子水，总体积为20μL；反应条件为16℃，过夜；
(4)转化及涂板：将上述连接产物5μL导入至100μL感受态细菌TOP10(天根生物科技公司)中，冰浴30分钟，再42℃热激90秒，然后冰上放置2分钟，最后加入400μL LB培养基，置于摇床中复苏45分钟，转速为150r/min；最后取100μL菌液涂在含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板上，37℃细菌培养箱培养过夜；
(5)质粒提取：挑取单克隆于5mL LB/Amp培养基，37℃摇床中培养16小时(转速200r/min)，然后收集细菌，使用E.Z.N.A.Endo-Free Plasmid Mini KitI试剂盒提取质粒。
三、重组载体的鉴定
1、PCR鉴定：以提取的质粒为模板，使用上述提到的引物1(SEQID-1)和引物2(SEQID-2)进行PCR反应，产物中出现CTAG1B/NY-ESO-1特异性片段则表明重组质粒构建成功。PCR扩增体系和反应条件与上述提及的一致，反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳(1.5％)，观察在680bp处是否出现一条特异性条带(如图3所示)。
由图3可知，在680bp处出现一条特异性条带，说明重组载体构建成功。
2、酶切鉴定：将提取的质粒进行双酶切反应，所用限制性内切酶为EcoR I@HF和XbaI，反应体系和条件如上所述。
结果如图4所示，重组质粒酶切后出现了两条条带，一个为质粒(约3.7kb)，另一个为CTAG1B/NY-ESO-1片段(680bp)。
3、DNA测序鉴定：将提取的质粒送样测序，测序引物为：
CMV-F：5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'(SEQID-11)；
Reverse：5'-TAAAGCATCGAGATCGCAGG-3'(SEQID-12)。
使用NCBI Blast进行序列比对，测序得到的序列与CTAG1B基因序列100％吻合，进一步证明构建的pscAAV-CTAG1B重组载体是正确的。
实施例2 自补型重组腺相关病毒的制备
一、材料及来源
1、实施例1中构建的pscAAV-CTAG1B重组载体。
2、辅助载体pAAV6-RC6MUT和pHelper：购自CellBiolabs公司。
3、293AAV细胞：购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。
4、Polyethylenimine(PEI)：购自Polysciences公司(Cat#23966)。
5、OPTI-MEM培养基：购自Life technology公司。
6、OptiPrepTM Density Gradient Medium(碘克沙醇)和Benzonase：购自Sigma公司。
二、自补型重组腺相关病毒(scAAV6)的制备及鉴定
制备方法是将重组载体pscAAV-CTAG1B和突变型辅助载体pAAV6-RC6MUT、pHelper共转染到293AAV细胞中，收集病毒颗粒并纯化鉴定，具体过程包括以下步骤：
(1)突变型辅助载体pAAV6-RC6MUT即pAAV6-RC6-T251V+T492V+S563V+S663V的构建，其具体方法是：将野生型载体pAAV6-RC6上的四个位点T251，T492，S563和S663分步突变为缬氨酸，反应体系为5μL 10xReaction buffer，2μL Sample plasmid(10ng/μL，total20ng)，1μL primer(F)(10pmol/μL)，1μL primer(R)(10pmol/μL)，2μL dNTP mixture(each2.5mM)，1μL Muta-direct Enzyme，38μL dH2O；反应条件为：95℃预变性30秒，95℃变性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸8分钟，共15个循环；最后4℃保存5分钟；其中点突变反应所用引物如下：
T251V-F：CCTTGCCCACCTATAACAGTCACCTCTACAAGCAAATC(SEQID-3)；
T251V-R：GATTTGCTTGTAGAGGTGACTGTTATAGGTGGGCAAGG(SEQID-4)；
T492V-F：CTAAAACAAAAACAGGTAACAACAACAGCAAC(SEQID-5)；
T492V-R：GTTGCTGTTGTTGTTACCTGTTTTTGTTTTAG(SEQID-6)；
S563V-F：TCACAGACGAAGAGGAAAGTAAAGCCACTAACCCCGTG(SEQID-7)；
S563V-R：CACGGGGTTAGTGGCTTTACTTTCCTCTTCGTCTGTGA(SEQID-8)；
S663V-F：CAGAGTTTTCGGCTACAAGTTTTGCTTCATTCATCACC(SEQID-9)；
S663V-R：GGTGATGAATGAAGCAAAACTTGTAGCCGAAAACTCTG(SEQID-10)。
(2)细胞转染：使用聚醚酰亚胺(PEI)转染法将重组载体pscAAV-CTAG1B、突变型辅助载体pAAV6-RC6MUT和pHelper共转染到293AAV细胞中；转染前24小时，293AAV细胞传代至15cm dish中(密度3×105cells/mL)，培养基 (DMEM高糖，购自Hyclone)体积为22.5mL(不含抗生素)；转染前3-4小时换液(20mL)；转染体系包括：在1.7mL EP管中加入500μL OPTI-MEM(37℃预热)，然后按摩尔比1:1:1的比例加入如下质粒，13μg pHelper，8μg突变型辅助载体pAAV-RC6MUT，5μg重组载体pscAAV-CTAG1B，然后再加入110μL PEI(1mg/mL)，PEI与DNA的比例为4:1(v:w)；将DNA/PEI混合溶液简单地漩涡震荡混匀，然后室温放置15分钟后将DNA/PEI混合溶液逐滴加入培养皿中，并轻轻的旋转培养皿以便转染混合物能均匀的分布到培养基中(DMEM高糖，购自Hyclone)；
(3)病毒收集：将转染好的细胞置于CO2培养箱中37℃培养72小时，然后收集细胞，在乙醇+干冰和37℃水浴中反复冻融三次，在细胞裂解液中加入核酸酶Benzonase(终浓度50U/mL)，37℃孵育30分钟；3700g离心20分钟(4℃)收集上清，即为病毒粗提液；
(4)病毒的纯化：使用不连续的碘克沙醇密度梯度离心法(iodixanol gradients)纯化病毒粗提液；402,000g离心1小时(4℃)，收集病毒浓缩层液体；使用肝素亲和层析法进一步纯化scAAV6；
(5)病毒的鉴定：通过定量PCR的方法鉴定scAAV6的颗粒数(viral genomes，vgs)。以pscAAV-CTAG1B重组质粒作为标准品，测定质粒浓度并计算拷贝数：拷贝数(Copies/μL)＝质粒浓度(ng/μL)×10-9×6.02×1023(阿伏伽德罗常数)/质粒分子量。以107、106、105和104拷贝数质粒作标准曲线计算scAAV6的基因组滴度。所用引物为：
正义链引物：5’-GAGTGGCCAACTCCATCACT-3’(SEQID-13)；
反义链引物：5’-ACTCCCATTGACGTCAATGG-3’(SEQID-14)。
如图5所示，标准曲线能很好地拟合拷贝数和扩增循环数(CT)，而本发明的scAAV6样品的CT值为17.9，由此可计算出其拷贝数为7.6×1010(样品稀倍数为106)。
实施例3 pscAAV-CTAG1B重组载体导入树突状细胞的肿瘤杀伤实验
一、材料及来源
1、自补型重组腺相关病毒(scAAV6)：按实施例2进行制备。
2、AIM-V细胞培养基：购自Lonza公司。
3、细胞因子：GM-CSF、IL-4、IL-2和TNFα，均购自Peprotech公司。
4、CD3抗体(OKT3)：购自Life Technology公司。
5、CD80、CD86、OX40和4-1BB流式检测抗体：购自eBioscience公司。
二、scAAV6-CTAG1B侵染树突状细胞
如图6所示，本实施例pscAAV-CTAG1B重组载体导入树突状细胞的肿瘤杀伤实验的整个过程包括以下步骤：
1、取肿瘤患者外周血50-150mL，使用淋巴细胞分离液获取外周血单个核细胞(PBMC)，使用AIM-V培养基(含10％FBS)重悬，置于37℃细胞培养箱中培养2小时；
2、将悬浮细胞转移至新的培养皿，PBS洗涤三次，贴壁细胞即为单核细胞(monocyte)；悬浮细胞即淋巴细胞，使用含IL-2(20IU/mL)和OKT3(100ng/mL)的AIM-V培养基继续培养；
3、在单核细胞中加入制备好的自补型重组腺相关病毒(感染复数MOI：20,000vgs/cell)，同时加入GM-CSF(50ng/mL)和IL-4(100ng/mL)，37℃培养4小时；
4、去除步骤3中旧的培养基，补充含GM-CSF(50ng/mL)、IL-4(100ng/mL)和TNFα(50ng/mL)的AIM-V培养基，继续培养5天，即可收获成熟的树突状细胞。
使用scAAV6-GFP侵染树突状细胞进行侵染效率分析，结果如图7所示，荧光显微镜拍照显示突变型scAAV6的侵染效率为70％，而野生型scAAV6的侵染效率为30％，野生型scAAV6具有更高的转染效率。
5、将成熟的树突状细胞与T淋巴细胞共培养(DC细胞与T细胞的数量比为1：10)，培养基为含IL-2(20IU/mL)的AIM-V；7天后再用scAAV6侵染过的DC细胞去刺激T淋巴细胞；
6、树突状细胞表面分子CD80、CD86的检测，使用流式细胞仪进行定量分析，以确定树突状细胞的功能。
如图8所示，树突状细胞表面CD80、CD86的表达均显著升高，阳性率分别为76.2％和79.3％。
三、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)体外杀伤实验
1、成熟的树突状细胞与T淋巴细胞共培养(细胞数量比1：10)结束后，使用流式细胞仪分析细胞表面OX40、4-1BB分子的表达性。
如图9所示，流式测定的结果为表面分子OX40、4-1BB的表达阳性率分别59.2％、49.1％，这表明树突状细胞与T细胞共培养后，可刺激T细胞的激活。
2、使用51Cr(铬-51)释放实验方法检测CTL细胞与肿瘤细胞共培养一定时间后肿瘤细胞的死亡率。具体实验步骤为：
A、标记靶细胞：取培养对数生长期的靶细胞(H1299)4×106/mL，加入 100-200uCi51Cr，37℃水浴2小时，每隔15min振摇一次；然后用含5％FBS的RPMI-1640(购自Hyclone)培养液洗涤三次，除去游离的51Cr；
B、CTL与肿瘤细胞共培养：标记后的靶细胞按照1×103/well的密度铺在96孔板中，然后加入CTL细胞(CTL细胞与肿瘤细胞数量比为10:1或20:1)，37℃5％CO2培养，共培养时间为4小时(数量比为10:1时)或6小时(数量比为20:1时)；
C、测定：每孔吸出50μL培养上清置于检测管中，在γ-计数仪上测定上清液的每分钟放射性活性(cpm值)；杀伤活性＝(实验孔cpm平均值-自然释放孔cpm平均值)/(最大释放孔cpm平均值-自然释放孔cpm平均值)；
如图10所示，使用scAAV6-DC-CTL可有效杀伤CTAG1B/NY-ESO-1抗原阳性的H1299细胞，CTL和肿瘤细胞数量比为10:1和20:1时对应的杀伤率分别为63.7％和81.1％。
Claims (9)
1.一种携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)体外克隆CTAG1B/NY-ESO-1基因；
(2)将pscAAV-MCS载体和CTAG1B/NY-ESO-1基因分别用限制性内切酶EcoR I和Xba I进行双酶切，然后进行DNA连接反应，得到携带CTAG1B基因的重组载体pscAAV-CTAG1B；
(3)测序鉴定。
2.根据权利要求1所述的携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤(1)中克隆CTAG1B/NY-ESO-1基因的方法为：从H1299肺癌细胞株中提取总RNA，逆转录得到总cDNA，然后以cDNA为模板，在正义链引物5’-CCTGAATTCCCCTGACCTTCTCTCTGA-3’和反义链引物5’-ACATCTAGACAGGCCCCCACAATGAAC-3’的引导下进行PCR扩增反应，得到所述的CTAG1B/NY-ESO-1基因。
3.根据权利要求2所述的携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，PCR扩增反应体系为：含Mg2+的5xPrime STAR Buffer 10μL、浓度为2.5mM的dNTP Mixture 4μL、Primer F 1μL、Primer R 1μL、cDNA 2μL、Prime STARHS DNA Polymerase 0.5μL、dH2O31.5μL。
4.根据权利要求2所述的携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，PCR扩增反应条件为：98℃预变性5分钟，98℃变性20秒，60℃退火30秒，72℃延伸60秒，共30个循环； 最后72℃延伸10分钟，4℃保存5分钟。
5.根据权利要求1所述的携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体的构建方法，其特征在于，步骤(2)中酶切反应体系为：1μg pscAAV-MCS质粒/CTAG1B/NY-ESO-1基因，1μL EcoR I，1μL XbaI，5μL10×NEB Buffer以及适量去离子水，总体积为50μL；反应条件为：37℃，1.5小时。
6.根据权利要求1-5任一项所述的构建方法构建出的携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体。
7.根据权利要求6所述的携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体在CTAG1B/NY-ESO-1抗原阳性肿瘤的细胞免疫疗法方面的应用。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，携带CTAG1B/NY-ESO-1肿瘤抗原基因的自补型重组腺相关病毒载体与突变型辅助载体pAAV6-RC6MUT和pHelper按摩尔比为1：1：1，共同用于CTAG1B/NY-ESO-1抗原阳性肿瘤的细胞免疫疗法。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的突变型辅助载体pAAV6-RC6MUT的构建方法为：将野生型载体pAAV6-RC6上的四个位点T251，T492，S563和S663分步突变为缬氨酸，得到突变性辅助载体pAAV6-RC6MUT；其中反应体系为含Mg2+的10xReaction buffer 5μL，10ng/μL Sample plasmid 2μL，10pmol/μL primer F 1μL，10pmol/μL primer R 1μL，浓度为2.5mM的dNTP mixture 2μL，1μL Muta-direct Enzyme，38μL dH2O；反应条件为：95℃预变性30秒，95℃变性30秒，55℃退火60秒，72℃延伸8分钟，共15个循环；最后4℃保存5分钟；点突变反应所用引物如下：
T251V-F：CCTTGCCCACCTATAACAGTCACCTCTACAAGCAAATC；
T251V-R：GATTTGCTTGTAGAGGTGACTGTTATAGGTGGGCAAGG；
T492V-F：CTAAAACAAAAACAGGTAACAACAACAGCAAC；
T492V-R：GTTGCTGTTGTTGTTACCTGTTTTTGTTTTAG；
S563V-F：TCACAGACGAAGAGGAAAGTAAAGCCACTAACCCCGTG；
S563V-R：CACGGGGTTAGTGGCTTTACTTTCCTCTTCGTCTGTGA；
S663V-F：CAGAGTTTTCGGCTACAAGTTTTGCTTCATTCATCACC；
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Denomination of invention: A self complementary recombinant adeno-associated virus vector carrying ctag1b / NY-ESO-1 tumor antigen gene and its construction method and Application Effective date of registration: 20210507 Granted publication date: 20190621 Pledgee: Agricultural Bank of China Limited by Share Ltd. Chengdu Wenjiang branch Pledgor: CHENGDU KANGJING BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2021980003309 |
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