CN112334573B - 人类dc细胞扩增方法和人类dc细胞资源库 - Google Patents

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Abstract

提供了扩增人类DC细胞的方法，其包括让包含待扩增DC细胞的细胞样品与来源于猿猴STLV病毒的Tax蛋白接触的步骤。还提供了该方法制备的经扩增DC细胞以及利用该方法构建的DC细胞资源库。

Description

人类DC细胞扩增方法和人类DC细胞资源库
本申请要求于2018年4月23日提交中国专利局、申请号为201810368646.3、发明名称为“在体外大量扩增人类成熟高活性树突状细胞的方法及其应用”的中国专利申请的优先权。
技术领域
本公开涉及扩增人类树突状细胞(dendritic cell，DC)的方法，尤其是利用STLVTax蛋白进行DC细胞扩增的方法。本发明还涉及利用该方法构建的人类DC细胞资源库。
背景技术
癌症是全人类的第一大杀手，是人类健康及寿命的最大威胁。中国是世界上癌症死亡人数最多、肿瘤发病增长最快的国家。相关资料(CA Cancer J Clin 2016；66(2)：115-32 PMID：26808342)显示，2015年中国癌症发病人数为429万，死亡人数高达281万。免疫治疗是继手术、放疗、化疗之后又一革命性的新技术，在抗癌治疗中展现出巨大潜力。以恢复或增强T细胞功能进而实现肿瘤杀伤的概念得到证实，抗PD1、PDL1、CTLA4等免疫检查点的抗体在临床治疗中疗效显著，基因工程改造后的CAR-T、TCR-T细胞在个别癌种或案例中展现出惊人的抗癌效果。但是，需承认，无论是免疫检查点抗体还是CAR-T等细胞技术，在安全性、有效性、通用性方面还有较大的提升空间，治疗中的免疫耐受和免疫逃逸等问题还有待解决。
免疫治疗不仅针对癌症研究，其在由病毒引起的疾病方面也发挥关键作用。众所周知，病毒感染机体后，以急性或慢性的方式侵害宿主细胞，导致炎症，组织器官损害，甚至危及生命。一些病毒感染宿主后传染迅速，致死率极高，例如SARS冠状病毒、流感病毒、埃博拉病毒、寨卡及登革热病毒等。这些病毒感染尚无有效的预防或治疗性药物可供使用。此外，还有一些慢性病毒感染，诸如乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)、艾滋病毒(HumanImmunodeficiency Virus，HIV)、人乳头状瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)等，长期感染易导致各类癌症，目前也缺乏针对性强的治疗方案。因此，寻找到可对抗致命性病毒感染的免疫治疗方法势在必行。
免疫系统作为识别和清除外来病原微生物(如病毒)以及体内变异细胞(如肿瘤)的最重要的系统，其功能和活性的充分展现是治愈癌症及上述病毒性感染疾病的关键。在免疫系统中，发挥作用的功能单元是各类型的免疫细胞，包括巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK)以及DC细胞等。其中，T淋巴细胞、NK细胞等主要介导细胞免疫；B淋巴细胞通过产生抗体来抵抗外来抗原的入侵，主要参与体液免疫；而DC细胞作为一种专职抗原递呈的细胞，同时参与了细胞免疫和体液免疫，是整个免疫系统的关键节点，对免疫系统功能的发挥影响巨大。
已知DC细胞作为抗原递呈细胞(APC)，其主要作用之一是识别并递呈捕获的抗原给幼稚型T淋巴细胞(naive T lymphocyte)，促使T细胞活化增殖，产生大量识别特异性抗原、具有强细胞毒性的T淋巴细胞，也即CTL细胞(cytotoxic lymphocyte)。该类细胞对于癌症细胞以及病毒感染细胞具有直接杀伤作用。同时，DC细胞还参与NK细胞的活化，前者通过表达多种膜蛋白以及分泌IL12、IL15等因子可促进NK细胞的增殖，增强NK细胞活性。并且，研究发现，细胞因子可诱导B细胞产生IgG和IgA抗体，DC细胞与B细胞接触后可增加IgG和IgA的分泌。DC细胞负载抗原后可迁移至淋巴结生发中心，与该处B细胞相互作用，调节B细胞体液免疫。总之，DC细胞通过多种途径调控机体免疫反应，是免疫治疗中最具有研究价值的一类细胞。
基于DC细胞的免疫疗法至今已经在临床上进行了上千次的试验。这些临床研究提供了两方面信息。第一，DC细胞作为癌症疫苗使用是安全的。第二，DC细胞作为癌症疫苗使用是有效的，但其效用还不够理想。原因在于，现有技术难以满足DC细胞疫苗使用中对数量和活性的要求。首先，原代DC细胞因数量稀少，体外难以培养扩增的特点，使其无法直接用于治疗。所以，现阶段临床上采用的DC细胞是由单核细胞经多种细胞因子刺激后转化成的具有DC细胞功能的一类细胞。然而，大量的临床数据显示，此类DC细胞疗效欠佳。究其原因，第一，DC细胞数量有限，100mL的外周血仅可获取约105～107个细胞，难以达到有效治疗剂量；第二，现有技术无法优化患者或异体来源的DC细胞的活性，影响抗癌疗效；第三，通过肿瘤细胞裂解物处理或多肽转导DC细胞以负载肿瘤抗原的方法效率低下，其有效抗原负载多样性和持续性也受到限制。
发明内容
为了克服上述问题，在一方面，本公开提供了一种扩增DC细胞的方法，其包括让包含待扩增DC细胞的细胞样品与来源于猿猴STLV病毒的Tax蛋白接触。
在一些实施方案中，所述接触包括将所述Tax蛋白的表达载体导入所述待扩增DC细胞内并让所述Tax蛋白在所述待扩增DC细胞中表达。
在一些实施方案中，所述导入通过慢病毒转染进行。
在一些实施方案中，所述猿猴STLV病毒选自STLV1、STLV2、STLV3和STLV4病毒。
在一些实施方案中，所述Tax蛋白包括SEQ ID NO：1、2、3或4所示的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述细胞样品为外周血或脐带血。
在一些实施方案中，所述待扩增DC细胞通过以下步骤获得：a)从所述细胞样品分离单个核细胞；以及b)诱导所述单个核细胞分化为DC细胞。
在一些实施方案中，步骤b)包括让所述单个核细胞依次或同时与PHA和IL-2接触，或者让所述单个核细胞与GM-CSF和IL-4接触。
在一些实施方案中，所述方法还包括向经扩增的DC细胞内导入肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或病毒抗原的表达载体。
在一些实施方案中，所述肿瘤相关抗原为hTERT。
在一些实施方案中，所述方法还包括将经扩增的DC细胞在含IL2的培养基中继续培养3周至2个月。
在一些实施方案中，所述方法不包括从所述细胞样品中分离待扩增DC细胞的步骤。
在一些实施方案中，所述方法扩增的成功率不低于80％。
另一方面，本公开提供了通过上述扩增方法而获得的DC细胞。
在一些实施方案中，所述DC细胞为CD11c+和CD205+。
在一些实施方案中，所述DC细胞为CCR7+、HLA-DR+、和CD83，和/或CD40+、CD70+、4-1BBL+、CD80+、CD83+、CD86+。
另一方面，本公开提供了一种从外周血或脐带血单个核细胞制备具有肿瘤细胞或病毒感染细胞杀伤活性的细胞培养物的方法，包括让所述外周血或脐带血单个核细胞与上述扩增方法制备的DC细胞混合培养。
另一方面，本公开提供了通过上述方法制备的细胞培养物。
在一些实施方案中，所述细胞培养物包括CTL细胞、NK细胞和NKT细胞。
在一些实施方案中，所述CTL细胞包括Tα/β细胞和Tγ/δ细胞。
另一方面，本公开提供了上述细胞培养物在制备抗肿瘤或抗病毒药物中的应用。
另一方面，本公开提供了一种从外周血或脐带血单个核细胞制备CTL细胞的方法，其包括让所述外周血或脐带血单个核细胞与上述扩增方法制备的DC细胞混合培养，并从混合培养的细胞中分离CD3+细胞。
在一些实施方案中，所述CTL细胞包括Tα/β细胞和Tγ/δ细胞。
另一方面，本公开提供了一种从外周血或脐带血单个核细胞制备NKT细胞的方法，包括让所述外周血或脐带血单个核细胞与上述扩增方法制备的DC细胞混合培养，并从混合培养的细胞中分离CD3+和CD56+细胞。
另一方面，本公开提供了一种从外周血或脐带血单个核细胞制备NK细胞的方法，包括让所述外周血或脐带血单个核细胞与上述扩增方法制备的DC细胞混合培养，并从混合培养的细胞中分离CD3-和CD56+细胞。
另一方面，本公开提供了一种建立DC细胞资源库的方法，包括通过上述扩增方法从多个受试者的细胞样品分别获得对应于每个受试者的经扩增的DC细胞。
在一些实施方案中，所述受试者的数量大于400。
在一些实施方案中，所述方法还包括检测并记录所述经扩增的DC细胞的表面标志物分子、所述经扩增的DC细胞的活性、以及所述经扩增的DC细胞的HLA分型。
在一些实施方案中，所述活性的检测通过让所述经扩增的DC细胞与外周血单个核细胞共培养、并检测所获得的细胞的杀伤活性来进行。
在一些实施方案中，所述方法还包括将所述对应于每个受试者的经扩增的DC细胞分别冷冻保存。
在一些实施方案中，所述方法还包括定期检测并记录所述冷冻保存的DC细胞的活性变化。
另一方面，本公开提供了通过上述方法建立的DC细胞资源库。
另一方面，本公开提供了一种从受试者的外周血或脐带血单个核细胞制备具有肿瘤或病毒杀伤活性的细胞培养物的方法，包括：
1)检测所述受试者的外周血或脐带血单个核细胞的HLA分型；
2)从上述DC细胞资源库选择与所述受试者的外周血或脐带血单个核细胞HLA匹配的DC细胞；以及
3)将所述受试者的外周血或脐带血单个核细胞与所述DC细胞混合培养。
本公开提供的DC细胞扩增方法可以高效和高选择性地从外周血或脐带血的单个核细胞扩增DC细胞，所扩增的DC细胞具有从外周血或脐带血单个核细胞中诱导生成CTL细胞、NK细胞和NKT细胞的能力。本公开提供的人类DC细胞资源库可以为自体或异体提供高活性DC细胞株，有益于肿瘤或病毒感染疾病的治疗。
附图说明
图1为本发明构建DC细胞资源库的流程示意图。
图2显示了本发明DC细胞资源库内一个DC细胞株(BJ1)的FACS表型分析结果。
图3显示了本发明DC细胞资源库内另一个DC细胞株(BJ7)的FACS表型分析结果。
图4显示了经本发明DC细胞资源库内一个DC细胞株(BJ8)诱导一份PBMC产生的T细胞的FACS表型分析结果。
图5显示了BJ8细胞株诱导PBMC产生的TERT特异性T细胞对嗜骨瘤细胞的杀伤作用结果。分别选用不表达TERT和表达TERT蛋白的U2OS细胞，用以检测T细胞的抗原特异性杀伤作用。在靶细胞接种后两小时，按照10∶1、5∶1、2∶1、和1∶1的效靶比(E∶T)加入T细胞，共培养4小时。吸弃T细胞和死亡的靶细胞后进行检测。
图6显示了BJ8细胞株诱导PBMC产生的TERT特异性T细胞对三株黑色素瘤靶细胞的杀伤作用结果。在靶细胞接种后两小时，按照10∶1、5∶1、2∶1、和1∶1的效靶比加入T细胞，共培养4小时。吸弃T细胞和死亡的靶细胞后进行检测。
图7显示了BJ8细胞株诱导PBMC产生的TERT特异性T细胞对另三株靶细胞的杀伤作用结果。在靶细胞接种后两小时，按照10∶1、5∶1、2∶1、和1∶1的效靶比加入T细胞，共培养4小时。吸弃T细胞和死亡的靶细胞后进行检测。
图8显示了本发明DC资源库内一个DC细胞株(BJ3)诱导PBMC产生的CTL、NK和NKT细胞的FACS表型分析结果。该DC细胞株和PBMC都具有HLA-A2表型。
图9显示了本发明DC资源库内一个DC细胞株(BJ19)诱导PBMC产生的CTL、NK和NKT细胞的FACS表型分析结果。该DC细胞株和PBMC都具有HLA-A2表型。
图10显示了本发明DC资源库内一个DC细胞株(BJ8)诱导另一份PBMC产生的CTL、NK和NKT细胞的FACS表型分析结果。该DC细胞株和PBMC都具有HLA-A0201及HLA-A2402表型。
图11显示了本发明DC资源库内的一个DC细胞株(BJ9)诱导PBMC产生的免疫细胞经CD3磁珠阴性分选后获得大量CD56+细胞(NK细胞)。
图12显示了图11所示NK细胞对肺癌细胞A549的杀伤活性结果。
图13显示了图11所示NK细胞对表达人配体MICA的小鼠NIH3T3细胞的杀伤活性结果。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
“待扩增DC细胞”，指准备以本公开的方法进行扩增的对象，可以包括未成熟DC细胞和成熟DC细胞。“待扩增DC细胞”可以是经过纯化的DC细胞，也可以是例如处于外周血或脐带血中的DC细胞，即在扩增前无需将DC细胞与其他细胞(如T细胞、B细胞)分开。
“猿猴STLV病毒”，指灵长类T淋巴细胞病毒(Primate T-cell lymphotropicviruse，PTLV)在猿猴中的存在形式，目前仅在少数猴子和大猩猩体内发现。除猿猴类病毒(STLV)外，PTLV病毒还包括人类病毒(HTLV)。人类HTLV病毒和猿猴STLV病毒都具有多个亚型。在人类HTLV病毒中，HTLV1和HTLV2较为常见。HTLV1感染者中约有5％的人会患病，其中包含人T细胞白血病/淋巴瘤和热带痉挛性瘫痪，HTLV2病毒感染与疾病关联性不大。HTLV3及HTLV4病毒感染与疾病的关系还未可知。猿猴类STLV病毒中，已发现1％的STLV1病毒感染猿猴会发生猿类白血病，其余STLV2、STLV3和STLV4病毒感染未见有引起猿猴疾病的报道，也无证据表明它们与人类疾病有关。
“Tax蛋白”，指猿猴STLV病毒编码的一种蛋白，具有能够活化NF-κB、AP1和/或STAT信号通路的结构域，可以促进病毒基因的表达以及宿主细胞基因的转录和宿主细胞的转化。本发明人意外地发现，猿猴STLV病毒的Tax蛋白可以选择性地促进外周血或脐带血来源的单个核细胞(mononuclear cell)中DC细胞的增殖活化，并且成功率高达80％以上。在本公开的一些实施方案中，该Tax蛋白包括SEQ ID NO：1、2、3或4所示的氨基酸序列。
“肿瘤相关抗原”，指在肿瘤细胞中异常高表达、而在正常组织细胞中表达量较低的抗原，如人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)，肿瘤-睾丸抗原(CTA)，如MAGE家族蛋白、NY-ESO-1、gp100、GPC3、AFP蛋白等。“肿瘤特异性抗原”，指在肿瘤细胞中因基因突变进而致氨基酸发生变异的蛋白，如hRAS，kRAS等。
“HLA分型(HLA typing)”，指鉴定受试者或其细胞的主要组织相容性复合体(MHC)表型。进行HLA分型的方法例如包括传统的血清学方法和细胞学方法，以及近些年发展起来的DNA分型方法，例如PCR-RFLP，PCR-SSO等。常用的分型位点包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ等。本文中HLA分型的“匹配”指分型位点等位基因的一致，涉及DC细胞与准备与其共培养以诱导产生包括CTL细胞在内的细胞群的外周血单个核细胞(PBMC)的HLA分型匹配，以及CTL细胞与其杀伤细胞(如肿瘤细胞)的HLA分型匹配等。
“DC细胞资源库”，指包括多个(例如400个以上，1,000个以上，10,000个以上，甚至100,000个以上)分开保存的DC细胞株的细胞库。这些细胞株通常源于健康个体。该细胞株可以采用本公开的方法从健康个体的外周血(或脐带血)的单个核细胞得到。本公开提供的扩增DC细胞的方法可以选择性地和高效地从每个个体的单个核细胞扩增DC细胞，十分有利于这种DC细胞资源库的建立。该细胞资源库除了保存这些细胞株之外，还储存有每个细胞株的其它信息，例如HLA分型、DC细胞活性、表面标志物、质控数据、保存记录等等。本公开的DC细胞资源库尤其可用于为异体受试者提供HLA匹配的活性DC细胞，有利于临床上HLA配型问题的解决。
“受试者”，指健康个体、患有或者怀疑患有某种疾病的个体(优选人)。该术语通常可以包括“健康志愿者”“患者”、“检测对象”、以及“治疗对象”，等等。
在一些实施方案中，本公开提供了扩增DC细胞的方法，该方法涉及使用来自猿猴STLV病毒的Tax蛋白。如上文所述，本发明人发现，在DC细胞中表达该Tax蛋白，可以促进DC细胞的增殖和活化。该Tax蛋白可以来自STLV1、STLV2、STLV3、或STLV4病毒，相应地，可以具有如SEQ ID NO：1、2、3或4所示的氨基酸序列。需要指出的是，对这些序列中的一个或几个氨基酸进行保守性替换、或者删除氨基或羧基端一个或几个氨基酸残基所获得的多肽可能依然具有类似的功能，因此它们也应包括在本发明的范围内。待扩增DC细胞可以是PBMC中的原代DC细胞，或者是PBMC中单核细胞经诱导形成的未成熟DC细胞和成熟DC细胞(如单核细胞衍生的树突状细胞，MoDC)。由于本公开提供的方法的高选择性，通常无需在扩增前对包含DC细胞的细胞样品进行DC细胞分离操作。可以通过多种方式向DC细胞导入Tax蛋白的编码核苷酸，以实现Tax蛋白在DC细胞中的表达。这些导入方法例如包括脂质体及其它正电荷转染试剂介导的转染、电转、腺病毒或逆转录病毒介导的转染等。在本公开的实施例中，提供了采用慢病毒转染导入Tax的编码核苷酸序列的方法(见下文)。
除了向经扩增的DC细胞导入Tax编码基因之外，还可以导入其它目的蛋白的编码核苷酸序列，例如肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原或病毒抗原(例如HBV抗原HBsAg、HBcAg、HBxAg等；HCV抗原NS1，NS2，NS3，NS4，NS5等；HPV抗原如E6，E7等；EBV抗原如EBNA1，LAMP2等；HTLV病毒抗原如Tax，HBZ等；HIV病毒抗原如Gag等；SARS、Ebola、流感病毒等核心保守抗原等)的编码核苷酸序列。负载了这些目的蛋白的DC细胞可以诱导幼稚型T细胞成为特异于表达这些目的蛋白的肿瘤细胞或病毒感染细胞的CTL细胞，从而增强CTL细胞的杀伤选择性和杀伤功效。
在一些实施方案中，本公开提供了从外周血或脐带血单个核细胞制备具有肿瘤细胞或病毒感染细胞杀伤活性的细胞培养物的方法，该方法包括让外周血或脐带血单个核细胞与上文描述的负载了相应目的蛋白(肿瘤抗原或病毒抗原)的DC细胞混合培养。该混合培养产生细胞培养物不仅包括CTL细胞(包括Tα/β细胞和Tγ/δ细胞)，还包括NK细胞和NKT(natural killer T)细胞，可以通过MHC限制性和非限制性作用机制杀灭肿瘤细胞或病毒感染细胞。当应用于患者时，不同的作用机制可以协同作用，具有更好的治疗效果。
在一些实施方案中，本公开提供了制备DC细胞资源库的方法，其包括采用本文公开的DC细胞扩增方法从多个受试者(通常为健康个体)的细胞样品分别获得对应于每个受试者的经扩增的DC细胞(DC细胞株)。
在一些实施方案中，本公开提供了从受试者(通常为肿瘤患者或病毒感染患者)的外周血单个核细胞制备具有肿瘤或病毒杀伤活性的细胞培养物的方法，包括1)检测该受试者的外周血单个核细胞的HLA分型；2)从本公开提供的DC细胞资源库选择与该受试者的外周血单个核细胞HLA匹配的DC细胞；以及3)将受试者的外周血单个核细胞与该DC细胞混合培养。本公开的DC细胞资源库为该方法中的细胞HLA配型提供了极大便利。
以下结合具体操作步骤进一步详细说明本发明的具体实施方案。
Tax蛋白的病毒载体构建及慢病毒生产
采用慢病毒载体将Tax蛋白编码核苷酸导入DC细胞内并在其中表达。
将来自四种STLV病毒的Tax基因克隆到慢病毒载体上。Tax基因对应的氨基酸序列见SEQ ID NO：1至4。委托第三方服务平台全基因合成Tax基因的核苷酸序列，将其插入慢病毒载体，转化感受态细胞，经测序正确后，使用质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒，即Tax质粒。
将获得的Tax质粒与混合的包装质粒通过转染试剂(例如磷酸钙转染试剂、脂质体转染试剂、高分子聚合物转染试剂等)共转染293细胞(或293T细胞或293FT细胞)。所述包装质粒包括VSV-G、Gag-Pol和Rev的表达质粒。
可以通过两种离心方法收集病毒(下文称Tax慢病毒)。方法1：收集病毒上清液，以25,000rpm在4℃离心2小时。方法2：病毒上清液中加入PEG8000及适当浓度的NaCl溶液，常温或4℃条件下，1600g或3000rpm离心30～60min。离心后弃上清，病毒沉淀用RPMI1640培养基或其它适用于病毒保存的液体重悬后冻存于深低温冰箱内(-80℃)，保存前或使用前进行MOI值测定。
含肿瘤或病毒蛋白的载体构建及慢病毒生产
采用类似于上文制备Tax慢病毒的方法，将肿瘤或病毒的抗原基因克隆到合适的慢病毒载体上，生产相应的慢病毒。
扩增培养高活性DC细胞
将采集的健康人或患者外周血(或脐带血)10mL置于抗凝管内，送至cGMP级实验室内进行单个核细胞的分离。此处可采用密度梯度离心法或已知的任何可分离方法对单个核细胞进行分离。密度梯度离心法分离单个核细胞的大体步骤如下：
1)将抗凝管内10mL血液转移到装有10mL生理盐水或PBS缓冲液的50mL离心管内，轻轻混合；
2)取15mL Ficoll液或其它类似产品溶液加入到另一支无菌50mL离心管内；
3)将20mL稀释后的血液沿离心管壁轻轻加到Ficoll液面上；
4)室温条件下，600g或2000rpm离心20至30min；
5)使用移液管尽可能多地吸弃最上层血浆，单个核细胞层位于稀释后的血浆/Ficoll交界面(白膜层)；
6)小心收集白膜层，加入适量的生理盐水或PBS缓冲液保证总体积为40mL，600g或2000rpm常温离心10min；
7)弃上清，使用20mL生理盐水或PBS重悬细胞，600g或2000rpm常温离心10min；
8)弃上清，使用含血清培养基重悬细胞，并对细胞计数。
所分离的外周血或脐带血单个核细胞可以通过两种方式来培养扩增DC细胞。
方法1：通过原代树突状细胞扩增成熟高活性DC细胞，大体步骤如下：
1)转移约2×106～1×107个新鲜的外周血或脐带血单个核细胞至6孔板的1个孔内，加入5μg/mL植物血凝素(Phytohaemagglutinin，PHA)刺激并培养细胞(该PHA的终浓度通常在约1μg/mL至约30μg/mL)；
2)经PHA处理约24小时之后，收集细胞，离心弃上清，于2mL RPMI1640培养基中重悬洗涤细胞，离心；
3)弃上清，加入2mL含血清PRMI1640重悬细胞并转移至新的6孔板内，加入IL-2(终浓度50～200单位/mL)继续培养细胞2-5天；
4)将细胞悬液转移至15mL离心管内，以1500rpm离心5min；
5)弃上清，于RPMI1640培养基中重悬细胞，并对细胞计数；
6)接种2×106个细胞于6孔板内，向孔内加入MOI为10至50的Tax慢病毒和6至10μg/mL聚凝胺，共培养16至24小时；
7)收集细胞，离心，弃上清；
8)以RPMI培养基重悬洗涤细胞，离心，弃上清。以含血清RPMI1640培养基重悬细胞，加入IL2(终浓度50～200单位/mL)后继续培养细胞；
9)将细胞在含有50～200单位/mL IL2的培养基内继续培养；
10)将细胞在含有IL2的培养基中继续培养约3周至两个月，通过FACS检测分析CD83、CD80、CD86、CD70、CCR7、4-1BBL和HLA-DR等分子表达情况，证实获得了大量成熟高活性的DC细胞。
作为步骤1)至3)的另一选择，也可以让外周血或脐带血单个核细胞在含有PHA和IL2的培养基中共同刺激培养，接着进行后续步骤。
方法2：通过单核细胞衍生的树突状细胞(MoDC)扩增成熟高活性DC细胞
1)转移约2×106～1×107个新鲜的外周血或脐带血单个核细胞至6孔板的1个孔内；
2)加入GM-CSF以及IL-4共培养5-7天；
3)将细胞悬液转移至15mL离心管内，以1500rpm离心5min；
4)弃上清，以RPMI1640培养基重悬细胞，并对细胞计数；
5)接种4×106个细胞于6孔板内，向孔内加入MOI为10至50的Tax慢病毒和5-10μg/mL聚凝胺，共培养16小时；
6)收集细胞，离心，弃上清；
7)以RPMI培养基重悬洗涤细胞，离心，弃上清；以含血清RPMI1640培养基重悬细胞，加入IL2(50～200单位/mL)后继续培养细胞；
8)将细胞在含有50～200单位/mL IL2的培养基内继续培养约3周至两个月后，经FACS检测分析CD83、CD80、CD86、CD70、CCR7、4-1BBL和HLA-DR等分子的表达，证实获得了大量成熟高活性的树突状细胞。
对扩增后的DC的免疫表型鉴定
其步骤简述如下：
1)收集DC细胞，室温条件下2000rpm离心3min，弃上清；
2)加入PBS-EDTA缓冲液清洗细胞，轻轻吹打细胞至无团块，以2000rpm离心3min，弃上清，重复此步骤一次；
4)按照100μL/样本量加入封闭用缓冲液(可含0.5％～3％浓度范围内的BSA或FBS或其它来源的血清)，轻弹细胞混匀后，冰上放置10min；
5)每个样本加入1～5μL抗体，混匀后避光放置30min，期间每隔10min混匀一次，以确保抗体孵育均匀；
6)以1500rpm离心5min，弃上清；
7)加入1mL PBS-EDTA缓冲液清洗细胞，重悬，以1500rpm离心5min，弃上清；
8)加入500μL PBS重悬细胞，上机检测。
DC细胞资源库的建立
参见图1，通过从大量个体提供的细胞样品(外周血或脐带血)分别扩增DC细胞，建立包括众多DC细胞株的DC细胞资源库。建库过程简述如下：
1)筛选准备提供细胞样品的个体。该个体为健康受试者或癌症早期患者，不应具有传染性疾病(例如排除乙肝病毒、丙肝病毒、艾滋病病毒、梅毒感染者)。记录这些个体的信息，包括出生地、性别、年龄、身体状况、疾病状况等；
2)从这些个体采集5～10mL外周血(或产妇临产时采集10mL脐带血)置于肝素抗凝管内；
3)在GMP级别的洁净环境中从外周血或脐带血分离单个核细胞；
4)采用上文描述的方法从单个核细胞扩增出大量的一个类群的细胞；
5)对这个类群的细胞进行免疫细胞表型分析，辅以细胞形态观察等，以确证其为DC细胞；
6)取该DC细胞的一部分进行HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ等分型检测；
7)取该DC细胞的一部分根据需要进行基因工程修饰，使其表达所需抗原(如肿瘤抗原或病毒抗原)；将负载抗原的DC细胞与HLA匹配(可匹配1至12个HLA位点)的外周血或脐带血单个核细胞共培养，进行混合淋巴细胞反应(Mixed Lymphocyte Reaction，MLR)；将得到的细胞培养物进行流式表型分析和磁珠分选，分选后的细胞(如CTL细胞、NK细胞)进行细胞杀伤活性测试；
8)对源自每个个体的经扩增DC细胞按照1～5×106个DC细胞/支冻存管冻存至少4支，冻存当日进行无菌检查、支原体、内毒素、细胞活率测定。质量检测合格后，将-80℃冻存的DC细胞放入深低温液氮中长期保存；
9)定期取冻存后的部分DC细胞，解冻，检测冻存复苏后的细胞存活率；扩大培养，检测DC细胞免疫表型是否发生改变，刺激产生免疫细胞的活性是否改变；
10)汇总并记录每个DC细胞株的免疫表型分析数据、HLA分型检测数据、细胞杀伤活性以及质控相关数据，形成该DC细胞的档案，录入信息管理系统。
使用DC资源库中DC细胞诱导外周血或脐带血单个核细胞产生CTL和NK细胞
将资源库中的活性DC细胞与来自肿瘤或病毒感染者或健康志愿者的PBMC(或脐带血单个核细胞)共培养进行混合淋巴细胞反应，以产生CTL及NK细胞。
其步骤简述如下：
1)检测单个核细胞的HLA表型；
2)从DC细胞资源库内调取与单个核细胞至少有一条HLA-A相匹配的细胞，复苏，培养，备用；
3)单个核细胞经培养基重悬后，计数，调整细胞浓度为2～5×106/孔，置于6孔板内；
4)取与单个核细胞HLA匹配的DC细胞，计数。按照单个核细胞：DC细胞比例为500∶1～100∶1的比例加入适量的DC细胞至孔内。将6孔板置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜；
5)次日，向6孔板内加入浓度为100～500单位/mL的重组IL2溶液；
6)继续培养至DC细胞全部消失。取部分细胞，经流式细胞术分析诱导产生的免疫细胞类型及与免疫疗效相关的分子表达情况，操作方法类似于上文DC细胞免疫表型鉴定方法。
DC细胞诱导产生的CTL细胞或NK细胞对靶细胞杀伤作用测定
其步骤简述如下：
1)将上文描述步骤产生的NK细胞和CTL细胞的混合物继续培养至一定数量。
2)收集细胞，在离心管内以2500rpm离心5min，弃上清；
3)使用5mL PBS重悬洗涤细胞，以2500rpm离心5min，弃上清；
4)用0.5mL培养基重悬分散细胞，加入100μL CD3磁珠，轻弹混匀；
5)将离心管置于摇床上，室温条件下慢速摇晃15min，使磁珠和细胞充分结合；
6)向离心管内添加5mL PBS，颠倒混匀。将离心管置于磁力架上静置2min；
7)用移液管从远离磁珠的一侧吸取细胞悬液，全部转移至一50mL离心管内；
8)将离心管从磁力架上取下，用5mL PBS重悬磁珠。将离心管置于磁力架上静置2min。
9)用移液管从远离磁珠的一侧吸取细胞悬液，全部转移至所述50mL离心管内；
10)重复步骤8)和9)；
11)将所述50mL离心管内细胞离心，弃上清。以5mL培养基重悬细胞，加入100～500单位/mL IL2因子，转移至培养瓶内继续培养，获得NK细胞；
12)另将磁珠吸附的细胞用培养基重悬后培养CTL细胞；
13)在以上步骤操作期间复苏靶细胞，培养传代；
14)继续培养NK细胞或CTL细胞3～5天后，取靶细胞(经转染以表达荧光素酶)，计数，按照2.5～10×104个细胞/孔接种于24孔板内，置于培养箱内培养2小时；
15)取长势良好的NK或CTL细胞，计数，按照效靶比10∶1、5∶1、2∶1、1∶1加入靶细胞孔内，共培养4小时；
16)4小时后，吸弃培养基上清。以PBS洗涤孔内细胞至所有悬浮细胞被清除干净；
17)向孔内加入100～200μL裂解液裂解靶细胞；
18)收集裂解后的各组样品，以12000rpm离心1min；
19)取20μL上清液至96孔板内，再向孔内加入荧光素酶底物溶液100μL。
20)上机检测荧光素酶活性，计算杀伤情况。
实施例1.经扩增的DC细胞的表型鉴定
通过上文描述的方法，包括含Tax基因的慢病毒制备、单个核细胞的分离、初步刺激(细胞因子诱导)以及慢病毒转染、后期培养及筛选过程，我们从每份单个核细胞中富集得到大量的细胞。这些细胞经流式细胞术进行免疫表型分析，发现它们表达DC细胞相关的标记分子。图2和图3显示了DC细胞资源库中两份不同个体(BJ1和BJ7)的PBMC经扩增培养后获得的细胞的FACS检测结果。这些细胞表现为CD3阴性、CD14阴性、CD19阴性、CD56阴性，排除其为T细胞、单核细胞、B细胞、NK细胞的可能；这些细胞表达DC细胞相关标记分子CD11c和CD205；这些细胞表达CCR7、HLA-DR、CD83等与DC细胞成熟有关的标记分子；同时，这些细胞还表达CD40、CD70、4-1BBL、CD80、CD83、CD86等与DC细胞活化相关的标记分子。并且，通过显微镜可以观察到一些单个悬浮细胞在表面有许多突刺；在培养过程中，部分细胞有贴壁生长的特点，且展现经典DC细胞的形态。因此，综合多种免疫表型分子的分析和形态观察，确定这些细胞为DC细胞。
实施例2.本发明方法扩增DC细胞具有高成功率和高选择性
通过志愿者捐赠，我们获取了6份健康成年人的外周血，每份7至9mL。从血液采集到开始实验处理的时间控制在3小时内。通过上文描述的分离PBMC的方法，对这6份不同来源的血样进行PBMC分离。取得白膜层细胞后，经PBS洗涤，含血清培养基重悬后，加入PHA因子开始刺激培养。于第二日开始，向细胞中加入200单位/mL(终浓度)的IL2蛋白进行培养。在刺激培养3天后，用早前制备的STLV3 Tax慢病毒悬液转染刺激后的细胞，同时加入IL2继续培养。之后，根据细胞生长状况更换或添加含IL2的培养基继续培养，在培养3-4周时，会有部分细胞生长速度下降并逐渐死亡，剩余的细胞继续培养。在持续培养两个月后，我们收集部分细胞进行流式细胞术分析以及形态观察(如实施例1中所描述)，确证了继续生长的细胞为DC细胞。这6份外周血样品中，有一份在培养一段时间后逐渐死亡，其余5份细胞则一直培养长达4个月以上。在培养2个月并经过流式鉴定确证其为DC细胞后，我们开始冻存部分持续扩增的细胞，剩余部分细胞继续培养。后续，我们将冻存过的细胞复苏后进行培养，发现其仍然维持很好的生长扩增能力。因此，通过本发明的方法成功地从6份外周血样品中的5份扩增出活性DC细胞(成功率83％)。我们判断另一份扩增失败可能是操作失误所致。为证实该假设，我们找到扩增失败的血液样品的捐赠者，请其再次捐赠了8mL外周血。采用本发明的方法再次进行培养扩增，在经历至少4个月以上的培养周期后，扩增活化成功。由此，理论上，本公开提供的DC细胞扩增方法能够高效地实现DC细胞的扩增活化，成功率接近100％。
另一方面，已知DC细胞仅占PBMC细胞数量的1％，T细胞约占58％，B细胞约占20％，NK细胞和单核细胞分别约10％，NKT细胞约1％。我们获得的健康志愿者外周血仅7～9mL，经分离后，获得0.8～1.5×107个PBMC细胞全部用于扩增树突状细胞用，并未检测这些细胞中DC细胞的含量或者对DC细胞或单核细胞进行分离。在培养过程中，会出现两个类群的细胞，一群易于聚集成团生长，另一群则单个散布在培养基中。通过不间断观察发现，在培养3周至5周后，成团生长的细胞会增加，而单个散在的细胞逐渐消失。所以，在按本发明方法培养2个月后，我们所得到的细胞基本上都是成团细胞，该细胞未经任何分选处理，通过多种标记分子和形态学证明这群细胞是纯系DC细胞。这对于异体使用尤其重要，可以防止还存在的其它细胞如T细胞引起移植物抗宿主病。
实施例3.经扩增的DC细胞诱导产生抗原特异性T细胞的能力
正常细胞内端粒随细胞的分裂而进行性缩短，当达到一定程度，细胞就衰老而亡。端粒酶激活可使端粒长度保持相对稳定，从而使细胞获得无限增殖的能力，进一步发生癌变，因此端粒酶活性的异常与肿瘤发生、发展密切相关。端粒酶由端粒酶逆转录酶(hTERT)、端粒酶RNA和一种假尿嘧啶合成酶组成，而hTERT是端粒酶活性的限制性组分。研究发现，hTERT在90％以上的肿瘤细胞中高表达，在肿瘤发生发展中起重要作用。又因其在正常组织细胞中几乎不表达，所以hTERT是非常理想的肿瘤靶点。
基于此，本实施例从DC细胞资源库中选取一株DC细胞(BJ8，由STLV4 Tax蛋白转染后建成，HLA表型为A0201+和A2402+)，经慢病毒转染使其持续表达hTERT(DC-hTERT)。选择与DC-hTERT细胞HLA-A相匹配的PBMC，经MLR试验，共培养刺激产生大量免疫细胞。后者经CD3磁珠分选后获得单独类群的细胞，通过流式细胞术检测可知(图4)，此群T细胞主要是CD8+T细胞；根据TCR受体类型区分既含有Tα/β细胞，又含有Tγ/δ细胞。Tα/β细胞以MHC限制性方式杀伤靶细胞，而Tγ/δ细胞以非MHC限制性方式杀伤细胞，可起到协同攻击的作用；同时，部分细胞表达CD56分子和与NK细胞活化相关的受体NKG2D，提示该株DC细胞在刺激CTL细胞扩增的同时，还能诱导产生NKT细胞。
实施例4.经扩增的DC细胞诱导产生的hTERT特异性T细胞杀伤肿瘤细胞的作用
本实施例采用HLA-A0201+/A2402+的PBMC细胞分别与实施例3的亲本DC细胞和DC-hTERT共同培养产生T细胞。这两种T细胞经CD3磁珠分选后检测其对肿瘤细胞的杀伤作用。
首先，本项研究需证实T细胞杀伤作用是hTERT特异性的。因此，本项研究选择人嗜骨瘤细胞U2OS(HLA-A2)作为靶细胞。该靶细胞的一大特点是本底TERT蛋白表达量很低，几乎检测不到。经基因工程修饰后的U2OS/TERT可表达hTERT蛋白。研究选用亲本U2OS和U2OS/TERT作为靶细胞，检测hTERT特异性T细胞对其的杀伤效果。由图5可知，对于不表达TERT蛋白的亲本U2OS细胞，hTERT特异性T细胞对其杀伤作用很弱，高效靶比(10∶1)作用下的轻微杀伤可能是由T细胞中的Tγδ细胞导致的。而在表达TERT蛋白后，T细胞对U2OS细胞的杀伤作用明显增强，提示本方法诱导产生了hTERT特异性的T细胞。
接着，采用三株黑色素瘤细胞作为靶细胞，以正常人成纤维细胞NHF(HLA-A2/A2)作为对照(图6)。三株肿瘤细胞分别是A375(HLA-A0101/A0201)、SK-MEL-3(HLA-A2402)以及SK-MEL-24(HLA-A1/A2)，这三株细胞都仅有一条HLA与T细胞HLA相匹配。由图6显示的结果可知，A375细胞对无TERT抗原特异性导向的T细胞不敏感，10∶1效靶比条件下T细胞杀伤作用仅20％；而TERT特异性T细胞对A375肿瘤细胞的杀伤作用可达90％以上。即使在1∶1效靶比条件下，hTERT特异性T细胞对A375的杀伤能力都超过50％。对于SK-MEL-3和SK-MEL-24两株细胞，非特异性T细胞在效靶比为1∶1时，杀伤作用小于40％，而hTERT特异性T细胞在效靶比为1∶1时杀伤作用可达90％以上，提示hTERT特异性T细胞可在较低效靶比时即可对表达TERT的肿瘤细胞产生有针对性的杀伤；并且，hTERT特异性T细胞对NHF的杀伤作用非常小，提示TERT特异性T细胞对肿瘤产生选择性杀伤作用，安全性高。
另一项研究中，选用NL20细胞(经基因改造后能够无限增殖的支气管表皮细胞，HLA-A1/3)、H1299(肺癌细胞，HLA-A32/A24)、和正常人类成纤维细胞(normal humanfibroblasts，NHF，HLA-A2/A2)三株细胞作为研究对象。先对三株细胞进进行了基因修饰，使NL20细胞表达HLA-A0201分子，可以被HLA同型T细胞所识别；使H1299细胞表达HLA-A0201分子，使该细胞与同HLA型T细胞匹配度更高(HLA-A0201和HLA-A2402都匹配)；使NHF细胞表达癌症睾丸抗原MAGEA3，观察hTERT特异性T细胞是否对该细胞产生杀伤作用。由图7显示的结果可知，非抗原特异性T细胞在效靶比为2∶1时，无论对NL20还是NL20/A2.1细胞的杀伤作用均很小，不足10％。而hTERT特异性T细胞在效靶比为2∶1时，即可杀伤70％以上的NL20及NL20/A2.1细胞，提示特异性杀伤作用强。同时，对于肺癌细胞H1299及H1299/A2.1，非特异性T细胞在效靶比为2∶1时，几乎没有杀伤作用；而hTERT特异性T细胞效靶比为2∶1时，杀伤作用可致70％以上。由于H1299细胞仅有HLA-A24与T匹配，而H1299/A2.1中HLA-A0201及HLA-A24都与T细胞匹配，致使T细胞对匹配度更高的H1299/A2.1的杀伤作用强于H1299，提示HLA匹配度越高，T细胞杀伤能力越强。对于NHF/MAGEA3细胞，虽然其表达肿瘤抗原MAGEA3，但因效应T细胞是hTERT特异性的，所以对其也无明显杀伤作用，提示T细胞杀伤的特异性高。
实施例5.经扩增的DC细胞刺激诱导产生CTL、NK及NKT细胞
肿瘤免疫治疗所面临的困境之一是肿瘤免疫逃逸。因肿瘤组织的异质性特点，同一组织内肿瘤细胞可展现不同的免疫特征，MHC表达量可高可低，甚至完全不表达。在此种情况下，单一采用MHC限制性杀伤的T细胞进行治疗，在短期内具有一些效果，但长期看来，可能无法阻止残留免疫细胞逃逸，导致肿瘤复发。因此，具有不同杀伤机制的免疫细胞进行协同治疗是未来免疫治疗的一种趋势。本公开提供的DC细胞资源库中的DC细胞所具有的一大特点为：可在刺激CTL细胞活化增殖的同时，还能诱导产生一定比例(25％～90％)的CD56+细胞，即为NK细胞及CD3+CD56+的NKT细胞。将这群混合的免疫细胞用于肿瘤治疗，可以达到协同作用，起到防止免疫逃逸的效果。
本实施例从DC细胞资源库中选取三株DC细胞，分别与HLA匹配的PBMC混合培养：
代号为BJ3(由STLV3 Tax转染后建成)的DC细胞株和一份PBMC细胞混合培养，二者都属HLA-A2表型。
代号为BJ19(由STLV3 Tax转染后建成)的DC细胞株和一份PBMC细胞混合培养，二者都属HLA-A2表型。
代号为BJ8(由STLV4 Tax转染后建成)的DC细胞株和一份PBMC细胞混合培养，二者都属于HLA-A0201及HLA-A2402表型。
对培养后获得的细胞培养物进行FACS分析，结果分别显示在图8至图10中。从图中可看出，经MLR试验诱导产生的细胞主要是CD8+T细胞和CD56+NK细胞以及CD3+CD56+的NKT细胞。CD3+CD8+的T细胞有两个类群，一群荧光强度明亮，对应CD8相对高表达，另一群荧光强度较弱，对应CD8相对低表达。诱导产生的T细胞主要为Tα/β细胞，并且不含或仅含少量能够引起免疫抑制的PD1、CTLA4等因子。
实施例6.经扩增的DC细胞诱导产生的NK细胞对靶细胞的杀伤作用
通过本文描述的方法，利用DC资源库内一株DC细胞(BJ9)诱导PBMC扩增后，产生CD3+和CD56+的两群细胞。经过CD3磁珠阴性分选后，可获得大量CD56+的细胞，即为NK细胞(图11)。NK细胞可对肿瘤细胞产生非MHC限制性的杀伤作用。研究中，我们选择肺癌细胞A549作为研究对象，观察所获得的NK细胞对该细胞的杀伤作用。结果如图12所示，在效靶比为1∶1时，NK细胞对A549细胞的杀伤作用达40％以上。已有研究表明，NK细胞的活性主要依赖NK细胞上活化受体NKG2D与靶细胞上配体MICA等相互作用而完成。鉴于小鼠和人免疫细胞的差异，理论上鼠源细胞对人的NK细胞不敏感，是一个比较理想的研究NK细胞作用机制的模型。本实施例以小鼠成纤维细胞NIH3T3为研究对象，对其进行基因修饰后使其表达人NK细胞的配体MICA，观察NK细胞是否会对其产生特异性杀伤。结果显示在图13中，其中3T3-Luc细胞表达荧光素酶，3T3-Luc/hMICA细胞同时表达荧光素酶和人MICA蛋白(hMICA)。从结果可知，人源NK细胞通过识别其配体MICA，对鼠源NIH3T3细胞产生强烈的特异性杀伤作用。例如，在效靶比为1∶1时，对3T3-Luc/hMICA细胞杀伤作用就高达约60％，而对3T3-Luc细胞的杀伤作用不到10％。
需要指出的是，本文中提供的一些实施例是采用来自STLV3和STLV4病毒的Tax蛋白进行的，但采用其它亚型病毒(STLV1、STLV2)的Tax蛋白也具有类似的结果(未示出)。
由以上描述可知，采用本公开提供的DC细胞扩增方法，可以实现：原代DC细胞在cGMP环境下的体外规模化培养，突破治疗时数量限制；保证所有DC细胞处于高度活化状态；确保DC细胞易于进行基因工程改造以根据需要高效且稳定递呈任何肿瘤或病毒抗原，实现高抗原负载率和多适应症特点；有效扩增任何个体的DC细胞，即建株效率高；仅采集少量外周血或脐带血(≤10mL)即可有效扩增大量DC细胞的目的；能够永久冻存扩增的DC细胞，复苏后仍保持活性。
在安全性上，猿类STLV Tax蛋白致人疾病的可能性未见报道，因此交叉感染的风险极小。另外，该STLV Tax蛋白相对于人体属于外源蛋白，具有高免疫原性，也可以发挥类似于免疫佐剂的功能，能够刺激人体免疫细胞活性，加强抗肿瘤或抗病毒作用。
因此，在本发明方法的基础上，我们提供了人类DC细胞资源库，即通过本发明提供的DC细胞扩增方法，将健康人群或早期癌症患者人群来源的DC细胞进行改造，实现其增殖潜能和功能；同时，获取每份DC细胞的数据信息(包括HLA分型，与DC细胞成熟活化相关的分子表达情况，体内外活性等)。该人类DC细胞资源库具有极大的应用价值。首先，其可以实现自体DC细胞功能强化目标，为将来治疗或预防癌症或病毒感染性疾病服务。例如，该DC资源库接受健康人群或非传染性疾病的癌症早期患者的血样为其提取并活化DC细胞，质检合格后储存于深低温环境中。当未来因疾病或预防目的需要使用自身DC细胞时，该DC资源库可提供数量充足且活性强的DC细胞。其次，采取HLA配型的方式，实现DC细胞异体使用，资源共享。该DC细胞资源库中的所有DC细胞都可以经严格技术筛查，而不携带任何传染性病原体。癌症或急性病毒感染患者因自身免疫细胞功能低下无法使用时，在经过HLA配型后，可迅速在该DC细胞资源库内匹配到适合患者的DC细胞株，该DC细胞株经复苏传代后可以很快应用于患者，为其争取宝贵的时间。第三，该DC细胞资源库可以为国家乃至全球的公共卫生和医疗科技领域提供DC细胞资源，它是研究并攻克某些已知的或未知的急性爆发性病毒感染性疾病的有效武器。
STLV病毒Tax蛋白氨基酸序列：
SEQ ID NO：1 STLV1 Tax蛋白
Figure GWB0000003592050000181
SEQ ID NO：2 STLV2 Tax蛋白
Figure GWB0000003592050000182
SEQ ID NO：3 STLV3 Tax蛋白
Figure GWB0000003592050000183
SEQ ID NO：4 STLV4 Tax蛋白
Figure GWB0000003592050000184
Figure GWB0000003592050000191

Claims (26)

1.一种扩增DC细胞的方法，包括让包含待扩增DC细胞的细胞样品与来源于猿猴STLV3病毒的Tax蛋白接触；
其中所述接触包括将所述Tax蛋白的表达载体导入所述待扩增DC细胞内并让所述Tax蛋白在所述待扩增DC细胞中表达。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述导入通过慢病毒转染进行。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述Tax蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞样品为外周血或脐带血。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述待扩增DC细胞通过以下步骤获得：
a)从所述细胞样品分离单个核细胞；以及
b)诱导所述单个核细胞分化为DC细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中步骤b)包括让所述单个核细胞依次或同时与PHA和IL-2接触，或者让所述单个核细胞与GM-CSF和IL-4接触。
7.如权利要求1所述的方法，还包括向经扩增的DC细胞内导入肿瘤相关抗原、肿瘤特异性抗原或病毒抗原的表达载体。
8.如权利要求7所述的方法，所述肿瘤相关抗原为hTERT。
9.如权利要求1所述的方法，其中还包括将经扩增的DC细胞在含IL2的培养基中继续培养3周至2个月。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述方法不包括从所述细胞样品中分离待扩增DC细胞的步骤。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述方法扩增的成功率不低于80％。
12.通过权利要求1至11中任一项的方法获得的DC细胞，其中所述DC细胞表达所述Tax蛋白。
13.如权利要求12所述的DC细胞，其为CD11c+和CD205+。
14.如权利要求12或13所述的DC细胞，其为CCR7+、HLA-DR+、和CD83，和/或CD40+、CD70+、4-1BBL+、CD80+、CD83+、CD86+。
15.一种从外周血或脐带血单个核细胞制备具有肿瘤细胞或病毒感染细胞杀伤活性的细胞培养物的方法，包括让所述外周血或脐带血单个核细胞与权利要求1至11任一项的方法制备的DC细胞混合培养，其中所述DC细胞表达所述Tax蛋白。
16.一种从外周血或脐带血单个核细胞制备CTL细胞的方法，包括让所述外周血或脐带血单个核细胞与权利要求1至11任一项的方法制备的DC细胞混合培养，并从混合培养的细胞中分离CD3+细胞，其中所述DC细胞表达所述Tax蛋白。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述CTL细胞包括Tα/β细胞和Tγ/δ细胞。
18.一种从外周血或脐带血单个核细胞制备NKT细胞的方法，包括让所述外周血或脐带血单个核细胞与权利要求1至11任一项的方法制备的DC细胞混合培养，并从混合培养的细胞中分离CD3+和CD56+细胞，其中所述DC细胞表达所述Tax蛋白。
19.一种建立DC细胞资源库的方法，包括通过权利要求1至11任一项的方法从多个受试者的细胞样品分别获得对应于每个受试者的经扩增的DC细胞，其中所述DC细胞表达所述Tax蛋白。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述受试者的数量大于400。
21.如权利要求19或20所述的方法，还包括检测并记录所述经扩增的DC细胞的表面标志物分子、所述经扩增的DC细胞的活性、以及所述经扩增的DC细胞的HLA分型。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述活性的检测通过让所述经扩增的DC细胞与外周血单个核细胞共培养、并检测所获得的细胞的杀伤活性来进行。
23.如权利要求19所述的方法，还包括将所述对应于每个受试者的经扩增的DC细胞分别冷冻保存。
24.如权利要求23所述的方法，还包括定期检测并记录所述冷冻保存的DC细胞的活性变化。
25.通过权利要求19至24任一项所述的方法制备的DC细胞资源库。
26.一种从受试者的外周血或脐带血单个核细胞制备具有肿瘤或病毒杀伤活性的细胞培养物的方法，包括
1)检测所述受试者的外周血或脐带血单个核细胞的HLA分型；
2)从权利要求25所述的DC细胞资源库选择与所述受试者的外周血或脐带血单个核细胞HLA匹配的DC细胞；以及
3)将所述受试者的外周血或脐带血单个核细胞与所述DC细胞混合培养。
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