JP7268055B2 - ヒトｄｃ細胞増幅方法及びヒトｄｃ細胞資源バンク - Google Patents

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Description

本発明は、2018 年4月23日に中国特許庁に提出された出願番号201810368646.3で、発明の名称が「インビトロでヒト成熟高活性樹状細胞を大量に増幅させる方法及びその応用」である中国特許出願の優先権を主張する。
本発明は、ヒト樹状細胞（dendritic cell、DC）を増幅させる方法、特にSTLV Taxタンパク質を用いるDC細胞増幅方法に関する。本発明はまた、この方法によって構築されたヒトDC細胞資源バンクに関する。
がんは、全人類にとってナンバーワンのキラーであり、人類の健康及び寿命に係る最大の脅威である。中国は、世界中でがん死亡人数が最も多く、腫瘍発症の増加が一番速い国である。関連資料（CA Cancer J Clin2016、66（2）：115-32 PMID：26808342）には、2015年に中国のがん発症人数が429万人で、死亡人数が281万人も達していることが示されている。免疫療法は、手術、放射線療法、化学療法に続く更なる革命的な新しい技術であり、抗がん治療において大きなポテンシャルを示している。T細胞機能を回復又は増強させ、ひいては腫瘍の殺傷を実現するという概念が実証され、抗PD1、PDL1、CTLA4などの免疫チェックポイントの抗体は臨床治療において治療効果が著しく、遺伝子操作されたCAR-T、TCR-T細胞は、個別のがん種又は症例において驚くほどの抗がん効果を示している。しかしながら、免疫チェックポイント抗体にしてもCAR-Tなどの細胞技術にしても、安全性、有効性、汎用性の面で大きく改善する余地があり、治療における免疫寛容や免疫逃避などの問題が解決されていないことを認めざるを得ない。
免疫療法は、がん研究を対象とするのみならず、ウイルスが原因となる病気においても重要な役割を果たす。ウイルスが生体に感染した後、急性又は慢性的に宿主細胞を攻撃し、炎症、組織や器官の損傷を引き起こし、さらには生命を脅かすことはよく知られている。一部のウイルスは宿主に感染すると、急速に感染するため致死率が極めて高く、例えば、SARSコロナウイルス、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、ジカ及びデング熱ウイルスなどが挙げられる。これらのウイルス感染症に有効な予防薬又は治療薬は未だにない。さらに、B型肝炎ウイルス（hepatitis B virus、HBV）、エイズウイルス（Human Immunodeficiency Virus、HIV）、ヒトパピローマウイルス（Human papillomavirus、HPV）、EBウイルス（Barr virus、EBV）などの慢性ウイルス感染症もあり、長期的に感染すると、様々ながんになりやすく、現在では、標的となる治療法も欠如している。したがって、致死的なウイルス感染に対抗できる免疫療法を見つけることが急務となっている。
外来の病原微生物（例えば、ウイルス）や体内の変異細胞（例えば、腫瘍）を認識して除去する最も重要なシステムとしての免疫系は、その機能及び活性の十分な発揮が、がんや前記ウイルス感染性症を治す鍵となる。免疫系では、その役割を果たす機能単位として、マクロファージ、Bリンパ球、Tリンパ球、ナチュラルキラー（NK）細胞及びDC細胞などを含む各種の免疫細胞である。このうち、Tリンパ球、NK細胞などは主に細胞性免疫を媒介し、Bリンパ球は、抗体を産生することで外来抗原の侵入を防御し、主に体液性免疫に関与し、一方、DC細胞は、プロの抗原提示細胞として細胞免疫と体液性免疫の両方に関与し、免疫系全体のキーノードであり、免疫系の機能の発揮に大きな影響を与えている。
DC細胞は抗原提示細胞（APC）として知られており、その主な役割の一つは、捕捉された抗原を認識してナイーブTリンパ球（naive T lymphocyte）に提示し、T細胞の活性化と増殖を促進し、特異抗原を認識して強い細胞傷害性を有するTリンパ球、すなわちCTL細胞（cytotoxic lymphocyte）を大量に産生することである。このような細胞は、がん細胞やウイルス感染細胞を直接殺傷する作用を持っている。同時に、DC細胞は、NK細胞の活性化にも関与しており、前者は多種な膜タンパク質の発現及びIL12、IL15などの因子の分泌によりNK細胞の増殖を促進し、NK細胞の活性を高めることができる。また、研究では、サイトカインはB細胞にIgG及びIgA抗体の産生を誘導し、DC細胞はB細胞と接触した後にIgG及びIgAの分泌を増加させることができることが明らかになった。DC細胞は、抗原を負荷した後にリンパ節の胚中心に移動し、そこのB細胞と相互作用し、B細胞の体液性免疫を調節することができる。総じて言えば、DC細胞は、種々のルートを通じて生体の免疫応答を調節しており、免疫療法において最も研究価値のある細胞の一種である。
DC細胞による免疫療法はこれまで臨床で数千回の試験が行われてきた。これらの臨床研究は両方の情報を提供する。第一に、DC細胞を癌ワクチンとして使用することは安全である。第二に，DC細胞は癌ワクチンとして有効であるが，その効用は不十分である。なぜなら、従来技術はDC細胞ワクチン使用における数量および活性の要求を満たすことが困難であるからである。まず、初代DC細胞は数量が少ないため、体外で培養増幅が困難な特徴があり、直接治療に応用できない。従って、現段階では、臨床的に採用されているDC細胞は単球が多種のサイトカイン刺激を経て転化したDC細胞機能を有する1種類の細胞である。しかし、大量の臨床データにより、このようなDC細胞の治療効果は良くないことを示した。その原因は、第一に、DC細胞の数量は限られており、100 mLの末梢血は約105～107個の細胞しか得られず、有効な治療量を達成することが困難である。第二に、現有の技術は患者或いは異体由来のDC細胞の活性を最適化できず、抗癌治療効果を影響する。第三に、腫瘍細胞溶解物処理或いはポリペプチドによるDC細胞の形質導入は腫瘍抗原を負荷する方法で効率が低下し、その有効抗原負荷多様性と持続性も制限される。
発明の開示
上述の問題を克服するために、一態様において、本発明は、増幅されるDC細胞を含む細胞試料を、サルSTLVウイルス由来のTaxタンパク質と接触させることを含むDC細胞増幅方法を提供する。
一部の実施形態では、前記接触は、前記Taxタンパク質の発現ベクターを前記増幅されるDC細胞に導入し、前記増幅されるDC細胞において前記Taxタンパク質を発現させることを含む。
一部の実施形態では、前記導入は、レンチウイルス・トランスフェクションによって行われる。
一部の実施形態では、前記サルSTLVウイルスは、STLV1、STLV2、STLV3及びSTLV4ウイルスから選択される。
一部の実施形態では、前記Taxタンパク質は、SEQ ID NO：1、2、3又は4で表されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態では、前記細胞試料は末梢血又は臍帯血である。
一部の実施形態では、前記増幅されるDC細胞は、a）前記細胞試料から単核細胞を分離する工程と、b）前記単核細胞をDC細胞に分化させるように誘導する工程によって得られる。
一部の実施形態では、工程b）は、前記単核細胞をPHA及びIL-2と順次又は同時に接触させること、又は前記単核細胞をGM-CSF及びIL-4と接触させることを含む。
一部の実施形態では、前記方法は、増幅されたDC細胞に、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原又はウイルス抗原の発現ベクターを導入することをさらに含む。
一部の実施形態では、前記腫瘍関連抗原はhTERTである。
一部の実施形態では、前記方法は、増幅されたDC細胞を、IL2含有培地で3週間～2ヶ月間培養し続けることをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法は、増幅されるDC細胞を前記細胞試料から分離する工程を含まない。
一部の実施形態では、前記方法は、増幅の成功率が80%以上である。
別の態様において、本発明は、上述の増幅方法によって得られるDC細胞を提供する。
一部の実施形態では、前記DC細胞は、CD11c+及びCD205+である。
一部の実施形態では、前記DC細胞は、CCR7+、HLA-DR+、並びにCD83、及び／又はCD40+、CD70+、4-1BBL+、CD80+、CD83+、CD86+である。
別の態様において、本発明は、前記末梢血又は臍帯血の単核細胞と上述の増幅方法によって調製されたDC細胞とを混合培養することを含む、末梢血又は臍帯血単核細胞から腫瘍細胞又はウイルス感染細胞傷害活性を有する細胞培養物を調製する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、上述の方法によって調製される細胞培養物を提供する。
一部の実施形態では、前記細胞培養物は、CTL細胞、NK細胞及びNKT細胞を含む。
一部の実施形態では、前記CTL細胞は、Tα／β細胞及びTγ／δ細胞を含む。
別の態様において、本発明は、抗腫瘍又は抗ウイルス薬の調製における上述の細胞培養物の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、前記末梢血又は臍帯血単核細胞と上述の増幅方法で調製されたDC細胞とを混合培養し、混合培養された細胞からCD3+細胞を分離することを含む、末梢血又は臍帯血単核細胞からCTL細胞を調製する方法を提供する。
一部の実施形態では、前記CTL細胞は、Tα／β細胞及びTγ／δ細胞を含む。
別の態様において、本発明は、末梢血又は臍帯血単核細胞と上述の増幅方法で調製されたDC細胞とを混合培養し、混合培養された細胞からCD3+及びCD56+細胞を分離することを含む、末梢血又は臍帯血単核細胞からNKT細胞を調製する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、末梢血又は臍帯血単核細胞と上述の増幅方法で調製されたDC細胞とを混合培養し、混合培養された細胞からCD3－細胞及びCD56+細胞を分離することを含む、末梢血又は臍帯血単核細胞からNK細胞を調製する方法を提供する。
別の態様において、本発明は、上述の増幅方法によって、複数の被験者の細胞試料から各被験者に対応する増幅されたDC細胞をそれぞれ得することを含む、DC細胞資源バンクを構築する方法を提供する。
一部の実施形態では、前記被験者の数は、400よりも多い。
一部の実施形態では、前記方法は、前記増幅されたDC細胞の表面マーカー分子、前記増幅されたDC細胞の活性、及び前記増幅されたDC細胞のHLAタイピングを検出して記録することをさらに含む。
一部の実施形態では、前記活性の検出は、前記増幅されたDC細胞と末梢血単核細胞とを共培養し、得られた細胞の傷害活性を検出することによって行われる。
一部の実施形態では、前記方法は、前記各被験者に対応する増幅されたDC細胞を別々に凍結保存することをさらに含む。
一部の実施形態では、前記方法は、前記凍結保存されたDC細胞の活性の変化を定期的に検査して記録することをさらに含む。
別の態様において、本発明は、上述の方法によって構築されたDC細胞資源バンクを提供する。
別の態様において、本発明は、
1）前記被験者の末梢血又は臍帯血単核細胞のHLAタイピングを検出すること、
2）前記被験者の末梢血又は臍帯血単核細胞HLAとマッチするDC細胞を、前記DC細胞資源バンクから選択すること、及び
3）前記被験者の末梢血又は臍帯血単核細胞を、DC細胞と混合培養することを含む、被験者の末梢血又は臍帯血単核細胞から、腫瘍又はウイルス傷害活性を有する細胞培養物を調製する方法を提供する。
本発明で提供されるDC細胞増幅方法は、末梢血又は臍帯血の単核細胞からDC細胞を効率的且つ高選択的に増幅することができ、増幅されたDC細胞は、末梢血又は臍帯血単核細胞からCTL細胞、NK細胞及びNKT細胞の産生を誘導する能力を有する。本発明によって、構築されるヒトDC細胞資源バンクは、腫瘍又はウイルス感染性疾患の治療に有益な自己又は同種異形の高活性DC細胞株を提供することができる。
本発明のDC細胞資源バンクを構築するプロセスの概略図である。 本発明のDC細胞資源バンク内のあるDC細胞株（BJ1）のFACS表現型解析結果を示す図である。 本発明のDC細胞資源バンク内の別のDC細胞株（BJ7）のFACS表現型解析結果を示す図である。 本発明のDC細胞資源バンク内のあるDC細胞株（BJ8）がPBMCを誘導して産生したT細胞のFACS表現型解析結果を示す図である。 BJ8細胞株がPBMCを誘導して産生したTERT特異的T細胞の好骨腫細胞に対する殺傷効果の結果を示す図である。T細胞の抗原特異的殺傷効果を検出するために、TERTを発現しないU2OS細胞と、TERTタンパク質を発現するU2OS細胞をそれぞれ選択した。標的細胞の接種から2時間後、10:1、5:1、2:1、1:1のエフェクター／ターゲット比（E：T）でT細胞を添加し、4時間共培養した。T細胞及び死んだ標的細胞を吸引して除去した後に、測定を行った。 BJ8細胞株がPBMCを誘導して産生したTERT特異的T細胞の3株のメラノーマ標的細胞に対する殺傷効果の結果を示す図である。標的細胞の接種から2時間後、10:1、5:1、2:1、1:1のエフェクター／ターゲット比でT細胞を添加し、4時間共培養した。T細胞及び死んだ標的細胞を吸引して除去した後に、測定を行った。 BJ8細胞株がPBMCを誘導して産生したTERT特異的T細胞の別の3株の標的細胞に対する殺傷効果の結果を示す図である。標的細胞の接種から2時間後、10:1、5:1、2:1、1:1のエフェクター／ターゲット比でT細胞を添加し、4時間共培養した。T細胞及び死んだ標的細胞を吸引除去した後に、測定を行った。 本発明のDC資源バンク内のあるDC細胞株（BJ3）がPBMCを誘導して産生したCTL、NK細胞及びNKT細胞のFACS表現型解析結果を示す図である。該DC細胞株及びPBMCは、いずれもHLA-A2表現型を有する。 本発明のDC資源バンク内のあるDC細胞株（BJ19）がPBMCを誘導して産生したCTL、NK細胞及びNKT細胞のFACS表現型解析結果を示す図である。該DC細胞株及びPBMCは、いずれもHLA-A2表現型を有する。 本発明のDC資源バンク内のあるDC細胞株（BJ8）が別のPBMCを誘導して産生したCTL、NK細胞及びNKT細胞のFACS表現型解析結果を示す図である。該DC細胞株及びPBMCは、いずれもHLA-A0201及びHLA-A2402表現型を有する。 本発明のDC資源バンク内のあるDC細胞株（BJ9）がPBMCを誘導して産生した免疫細胞を、CD3磁気ビーズネガティブソーティングを通したら、大量のCD56+細胞（NK細胞）が得られたことを示す図である。 図11に示したNK細胞の、肺がん細胞A549に対する殺傷活性の結果を示す図である。 図11にしたNK細胞の、ヒトリガンドMICAを発現するマウスNIH3T3細胞に対する殺傷活性の結果を示す図である。
別途の記載がない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。
「増幅されるDC細胞」とは、本発明の方法を用いて増幅しようとする対象を指し、未熟DC細胞や成熟DC細胞を含んでもよい。「増幅されるDC細胞」は、精製されたDC細胞であってもよく、例えば、末梢血又は臍帯血中のDC細胞であってもよく、すなわち、増幅前に、DC細胞を他の細胞（例えば、T細胞、B細胞）から分離する必要はない。
「サルSTLVウイルス」とは、類人猿に存在する霊長類Tリンパ球ウイルス（Primate T-cell lymphotropic viruse、PTLV）の形態を指すが、現在は少数のサルやチンパンジーにしか発見されていない。PTLVウイルスには、サルウイルス（STLV）の他に、ヒトウイルス（HTLV）も含まれている。ヒトHTLVウイルス及びサルSTLVウイルスは、いずれも複数のサブタイプを有している。ヒトHTLVウイルスの中では、HTLV1とHTLV2が一般的である。HTLV1感染者の約5%は、ヒトT細胞白血病／リンパ腫や熱帯けいれん性麻痺を含む疾患に罹患し、HTLV2ウイルス感染は疾患とあまり関連しない。HTLV3及びHTLV4ウイルス感染と疾患との関係は未だに知られていない。サルSTLVウイルスのうち、STLV1ウイルス感染サルの1%がサル白血病を発症することが判明され、残りのSTLV2、STLV3、STLVウイルス感染はサルの疾患の原因となる報告は見られず、ヒトの疾患と関連している証拠もない。
「Taxタンパク質」とは、サルSTLVウイルスによってコードされるタンパク質を指し、NF-κB、AP1及び／又はSTATシグナル伝達経路を活性化できるドメインを有し、ウイルス遺伝子の発現、宿主細胞遺伝子の転写及び宿主細胞の形質転換を促進することができる。本発明者らは、サルSTLVウイルスのTaxタンパク質が、末梢血又は臍帯血由来の単核細胞（mononuclear cell）におけるDC細胞の増殖や活性化を選択的に促進でき、しかも成功率が80%以上にも達成できることを予期せぬ形で発見した。本発明の一部の実施形態では、該Taxタンパク質は、SEQ ID NO：1、2、3又は4で表されるアミノ酸配列を含む。
「腫瘍関連抗原」とは、腫瘍細胞では異常に高発現であるのに対し、正常組織細胞では低発現の抗原を指し、例えば、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（human telomerase reverse transcriptase、hTERT）、及びMAGEファミリーたんぱく質、NY-ESO-1、gp100、GPC3、AFPタンパク質などの腫瘍－精巣抗原（CTA）が挙げられる。「腫瘍特異的抗原」とは、腫瘍細胞内において遺伝子変異によりアミノ酸が変異したタンパク質を指し、例えばhRAS、kRASなどが挙げられる。
「HLAタイピング（HLA typing）」は、被験者又はその細胞の主要組織適合複合体（MHC）の表現型を同定することを指す。HLAタイピングを行う方法としては、例えば、従来の血清学的方法や細胞学的方法、及び近年開発されたPCR-RFLP、PCR-SSOなどのDNAタイピング方法等が挙げられる。一般的に使用されるタイピング部位としては、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQなどが挙げられる。本明細書に言うHLAタイピングの「マッチ」とは、タイピング部位の対立遺伝子の同一性を指し、CTL細胞を含む細胞群の産生を誘導するためにDC細胞と共培養される末梢血単核細胞（PBMC）とDC細胞との間のHLAタイピングの一致、及びCTL細胞とその殺傷細胞（例えば、腫瘍細胞）との間のHLAタイピングの一致などを含む。
「DC細胞資源バンク」とは、複数（例えば、400個以上、1,000個以上、10,000個以上、さらには100,000個以上）の別々に保存されたDC細胞株を含む細胞バンクを指す。これらの細胞株は、通常、健康な個体に由来する。該細胞株は、本発明の方法を用いて、健康な個体の末梢血（又は臍帯血）の単核細胞から得ることができる。本発明で提供されるDC細胞を増幅する方法は、各個体の単核細胞からDC細胞を選択的且つ効率的に増幅することができ、このようなDC細胞資源バンクの構築に非常に有利である。該細胞資源バンクには、これらの細胞株に加えて、HLAタイピング、DC細胞活性、表面マーカー、品質管理データ、保存記録など各細胞株の他の情報も保存されている。本発明のDC細胞資源バンクは、特に異体対象にHLA一致の活性DC細胞を提供するために使用することができ、臨床的にHLA適合性問題の解決に有利である。
「被験者」は、健康な個体、何らかの疾患に罹患しているか、又は疑われる個体（好ましくは、ヒト）を指す。この用語は、一般に、「健康なボランティア」、「患者」、「検出対象」、及び「治療対象」などを含むことができる。
一部の実施形態では、本発明は、サルSTLVウイルス由来のTaxタンパク質の使用に関するDC細胞増幅方法を提供する。上述のように、本発明者らは、このTaxタンパク質をDC細胞で発現させることにより、DC細胞の増殖と活性化を促進できることを見出した。該Taxタンパク質は、STLV1、STLV2、STLV3、又はSTLV4ウイルスに由来することが可能であり、それに応じて、例えばSEQ ID NO：1、2、3、又は4で表されるアミノ酸配列を有してもよい。なお、これらの配列中の1個又は複数のアミノ酸に対して保守的置換を行い、或いは、アミノ末端またはカルボキシ末端の1つまたは複数のアミノ酸残基を欠失させて得られるポリペプチドは、依然として類似の機能を有している可能性があるため、本発明の範囲に含まれるものとする。増幅されるDC細胞は、PBMC中の初代次DC細胞であってもよく、又はPBMC中の単球を誘導して形成される未熟DC細胞や成熟DC細胞（例えば、単球由来樹状細胞、MoDC）であってもよい。本発明に係る方法の高い選択性のために、一般に、増幅前にDC細胞を含む細胞試料に対してDC細胞分離操作を行う必要はない。DC細胞におけるTaxタンパク質の発現を達成するために、Taxタンパク質のコードヌクレオチドをDC細胞に様々な方法で導入することができる。これらの導入方法は、例えば、リポソーム及び他の正電荷トランスフェクション試薬を介したトランスフェクション、電気トランスフェクション、アデノウイルス又はレトロウイルスを介したトランスフェクションなどが挙げられる。本発明の実施形態では、レンチウイルストランスフェクションによってTaxのコードヌクレオチド配列を導入する方法が提供される（後述）。
増幅されたDC細胞にTaxコード遺伝子を導入する以外に、他の標的タンパク質のコードヌクレオチド配列、例えば、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原又はウイルス抗原（例えば、HBV抗原HBsAg、HBcAg、HBxAgなど、HCV抗原NS1、NS2、NS3、NS4、NS5など、E6、E7などのHPV抗原、EBNA1、LAMP2などのEBV抗原、Tax、HBZなどのHTLVウイルス抗原、GagなどのHIVウイルス抗原、SARS、Ebola、インフルエンザウイルスなどのコア保存性抗原など）のコード化ヌクレオチド配列を導入することもできる。これらの目的タンパク質を負荷したDC細胞は、ナイーブT細胞を、これらの目的タンパク質を発現する腫瘍細胞またはウイルス感染細胞に特異的なCTL細胞にするように誘導し、それによってCTL細胞の殺傷選択性及び殺傷効力を高めることができる。
一部の実施形態では、本発明は、末梢血または臍帯血単核細胞から腫瘍細胞またはウイルス感染細胞傷害活性を有する細胞培養物を調製する方法を提供し、末梢血または臍帯血単核細胞を、上述の対応する目的タンパク質(腫瘍抗原またはウイルス抗原)を担持したDC細胞と混合培養することを含む方法。この混合培養によって産生された細胞培養物は、CTL細胞（Tα／β細胞とTγ／δ細胞を含む）だけでなく、NK細胞とNKT（Natural Killer T）細胞をも含み、MHC制限性と非制限作用機序を通じて腫瘍細胞或いはウイルス感染細胞を死滅させることができる。患者に適用する場合、異なる作用機序が相乗的に作用し、より良い治療効果を提供することができる。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に開示されたDC細胞増幅方法を用いて、複数の被験者（典型的には健康な個体）の細胞試料から、各被験者に対応する増幅されたDC細胞（DC細胞株）をそれぞれ得することを含む、DC細胞資源バンクを構築する方法を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、1）該被験者の末梢血単核細胞のHLAタイピングを検出すること、2）本発明に係るDC細胞資源バンクから該被験者の末梢血単核細胞HLAとマッチしたDC細胞を選択すること、及び3）該被験者の末梢血単核細胞を該DC細胞と混合培養することを含む、被験者（通常は腫瘍患者又はウイルス感染患者）の末梢血単核細胞から腫瘍又はウイルス殺傷活性を有する細胞培養物を調製する方法を提供する。本発明のDC細胞資源バンクは、該方法における細胞HLAマッチングに大きな利便性を提供する。
以下、具体的な操作手順を参照しながら、本発明の具体的な実施形態をさらに詳しく説明する。
Taxタンパク質のウイルスベクター構築とレンチウイルスの産生
Taxタンパク質のコード化ヌクレオチドを、レンチウイルスベクターを介してDC細胞に導入し、DC細胞内で発現させる。
4種のSTLVウイルス由来のTax遺伝子をレンチウイルスベクターにクローニングする。Tax遺伝子に対応するアミノ酸配列については、SEQ ID NO：1～4を参照されたい。サードパーティサービスプラットフォームに委託してTax遺伝子のヌクレオチド配列を合成し、それをレンチウイルスベクターに挿入し、コンピテントセルを形質転換し、配列決定を確認した後、プラスミド精製キットを用いてプラスミドを抽出して精製し、組換え発現ベクターの高品質なプラスミド、即ちTaxプラスミドを得る。
得られたTaxプラスミドと混合パッケージングプラスミドをトランスフェクション試薬（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション試薬、リポソームトランスフェクション試薬、高分子ポリマートランスフェクション試薬など）によって293細胞（或いは293T細胞或いは293 FT細胞）にコトランスフェクトした。前記パッケージングプラスミドとしては、VSV-G、Gag-Pol及びRevの発現プラスミドが挙げられる。
ウイルス（以下、Taxレンチウイルスという）は、2つの遠心分離法によって収集することができる。方法1：ウイルス上清を収集し、25,000rpm、4℃で2時間遠心分離する。方法2：ウイルス上清にPEG8000と適当な濃度のNaCl溶液を加え、常温又は4℃の条件で、1600g又は3000rpmで30～60分間遠心分離する。遠心分離後、上清を廃棄し、ウイルスペレットをRPMI1640培地又はウイルス保存に適した他の液体で再懸濁した後、超低温冷蔵庫内（－80℃）に凍結保存し、保存前又は使用前にMOI値を測定する。
腫瘍又はウイルスタンパク質含有ベクターの構築とレンチウイルスの産生
上述のTaxレンチウイルスの調製と同様の方法を用いて、腫瘍又はウイルスの抗原遺伝子を適切なレンチウイルスベクターにクローニングし、対応するレンチウイルスを産生する。
高活性DC細胞の増幅・培養
健常者又は患者から採取した末梢血（又は臍帯血）10mLを抗凝固管に入れ、cGMPグレードの実験室に送り、単核細胞の分離を行う。ここでは、密度勾配遠心分離法又は任意の既知の分離法を用いて単核細胞を分離することができる。密度勾配遠心分離法による単核細胞の分離の一般的な手順は、以下の通りである。
1）抗凝血管内の血液10mLを、生理食塩水或いはPBS緩衝液10mLを入れた50mLの遠心管に移し、軽く混ぜる。
2）Ficoll溶液又は他の類似製品溶液15mLを、別の50mLの無菌遠心管に添加する。
3）20 mLの希釈した血液を遠心管の壁に沿って、Ficoll液面にゆっくりと加える。
4）室温で、600g又は2000 rpmで、20～30分間遠心分離する。
5）ピペットを用いて、最上層の血漿を可能な限り多く吸引して除き、単核細胞層は希釈された血漿／Ficoll界面（バフィーコート）に位置している。
6）バフィーコートを慎重に収集し、生理食塩水又はPBS緩衝液を適量加えて、40mLの総体積を確保し、常温で600g又は2000 rpmで10分間遠心分離する。
7）上清を廃棄し、20mLの生理食塩水又はPBSを用いて細胞を再懸濁し、常温で600g又は2000rpmで10分間遠心分離する。
8）上清を廃棄し、血清含有培地を用いて細胞を再懸濁し、細胞を計数する。。
単離された末梢血又は臍帯血単核細胞は、増幅されるDC細胞を2つの方法によって培養することができる。
方法1：初代樹状細胞による成熟した高活性DC細胞の増幅について、大まかな手順は以下の通りである。
1）約2×106～1×107個の新鮮な末梢血又は臍帯血単核細胞を6ウェルプレートの1つのウェルに転移させ、5μg／mLの植物凝集素（Phytohaemagglutinin、PHA）を添加して細胞を刺激して培養する（このPHAの終濃度は、通常、約1μg／mL～約30μg／mLである）。
2）PHA処理の約24時間後、細胞を収集し、遠心分離して上清を除去し、2mLのRPMI1640培地で細胞を再懸濁・洗浄し、遠心分離する。
3）上清を廃棄し、血清含有PRMI1640再懸濁細胞を2mL添加し、新しい6ウェルプレートに転移させ、IL-2（終濃度：50～200単位／mL ）を添加して細胞を2～5日間培養し続ける。
4）細胞懸濁液を15 mLの遠心管に移し、1500 rpmで5分間遠心分離する。
5）上清を廃棄し、RPMI1640培地中で細胞を再懸濁し、細胞を計数する。
6）6ウェルプレートに2×106個の細胞を接種し、MOIが10～50のTaxレンチウイルス及び6～10μg ／mLのポリブレンをウェルに添加し、16～24時間共培養する。
7）細胞を収集し、遠心分離し、上清を廃棄する。
8）RPMI培養培地で細胞を再懸濁・洗浄させ、遠心分離し、上清を廃棄する。血清含有RPMI1640培地で細胞を再懸濁し、IL2（終濃度50～200単位／mL ）を添加した後、細胞を培養し続ける。
9）50～200単位／ mLのIL2を含む培地で細胞を培養し続ける。
10）IL2を含む培地で約3週間～2ヶ月間培養し続け、FACS検出によりCD83、CD80、CD86、CD70、CCR7、4-1 BBL、HLA-DRなどの分子の発現状況を解析し、成熟した高活性DC細胞が多数得られていることを確認する。
工程1）～3）の別の選択肢として、末梢血又は臍帯血単核細胞を、PHA及びIL2を含む培地で共刺激して培養し、次に、後続の工程を行うこともできる。
方法2：単球由来樹状細胞（MoDC）による成熟した高活性DC細胞の増幅
1）約2×106～1×107個の新鮮な末梢血又は臍帯血単核細胞を、6ウェルプレートの1つのウェルに転移させる。
2）GM-CSF及びIL-4を添加して5～7日間共培養する。
3）細胞懸濁液を15mLの遠心管に移し、1500rpmで5分間遠心分離する。
4）上清を廃棄し、RPMI1640培地で細胞を再懸濁し、細胞を計数する。
5）4×106個の細胞を6ウェルプレートに接種し、MOIが10～50のTaxレンチウイルス及び5～10μg ／mLのポリブレンをウェルに添加し、16時間共培養する。
6）細胞を収集し、遠心分離し、上清を廃棄する。
7）RPMI培地で細胞を再懸濁・洗浄し、遠心分離し、上清を廃棄する。血清含有RPMI1640培地で細胞を再懸濁し、IL2（50～200単位／mL）を添加した後、細胞を培養し続ける。
8）50～200単位／mLのIL2を含む培地で細胞を約3週間～2ヶ月間培養を続けた後、FACS検出によりCD83、CD80、CD86、CD70、CCR7、4-1BBL及びHLA-DRなどの分子の発現を分析し、成熟した高活性樹状細胞が多数得られていることを確認する。
増幅後のDCに対する免疫表現型の同定
その手順を簡単に説明すると、次の通りである。
1）DC細胞を収集し、室温で2000 rpmで3分間遠心分離し、上清を廃棄する。
2）PBS-EDTA緩衝液を添加して細胞を洗浄し、細胞団塊がなくなるまで細胞を軽く吹き付け、2000rpmで3分間遠心分離し、上清を廃棄し、この工程を1回繰り返す。
3） 4）ブロッキングバッファー（0.5%～3%の濃度範囲でBSA又はFBS又は他の由来の血清を含むことができる）を100μL／試料量で加え、細胞をフリックしてよく混合した後、氷上に10 分間置く。
5）各試料に1～5μLの抗体を加え、よく混合した後、遮光して30分間置き、抗体が均一にインキュベートされるように、その期間中に10分置きに1回よく混ぜる。
6）1500rpmで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
7）1mLのPBS-EDTA緩衝液を添加して細胞を洗浄し、再懸濁し、1500rpmで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
8）500μLのPBSを添加して細胞を再懸濁し、機器で検出する。
DC細胞資源バンクの構築
図1を参照すると、大量の個体から提供された細胞試料（末梢血又は臍帯血）からそれぞれDC細胞を増幅することによって、多数のDC細胞株を含むDC細胞資源バンクを構築する。このバンクを構築するプロセスについて、以下のように簡単に説明する。
1）細胞試料を提供しようとする個体をスクリーニングする。この個体は、健康な個体又は早期がん患者であり、伝染性疾患（例えば、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、エイズウイルス、梅毒感染症を除く）を有してはならない。出身地、性別、年齢、体調、病状などを含むこれらの個体の情報を記録する。
2）これらの個体から5～10mLの末梢血（又は分娩中の産婦の臍帯血10mL）を採取してヘパリン抗凝固管に入れる。
3）GMPグレードのクリーンな環境で末梢血又は臍帯血から単核細胞を分離する。
4）上記の方法を用いて、単核細胞から、一つの細胞群を大量に増幅させる。
5）DC細胞であることを確認するために、この細胞群に対して免疫細胞表現型解析を行い、補足として細胞形態の観察などを行う。
6）このDC細胞の一部を採取してHLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQタイピング検査を行う。
7）このDC細胞の一部を採取し、必要に応じて所望の抗原（例えば、腫瘍抗原又はウイルス抗原）を発現するように遺伝子操作を行う。抗原を負荷したDC細胞と、HLAがマッチした（1～12個のHLA部位がマッチし得る）末梢血又は臍帯血単核細胞とを共培養し、混合リンパ球反応（Mixed Lymphocyte Reaction、MLR）を行う。得られた細胞培養物をフローサイトメトリー及び磁気ビーズソーティングを行い、選別された細胞（例えば、CTL細胞、NK細胞）に対して細胞傷害活性試験を行う。
8）各個体由来の増幅されたDC細胞を、1～5 ×106個のDC細胞／凍結保存管で少なくとも4本凍結保存し、凍結保存の当日に無菌検査、マイコプラズマ、エンドトキシン、細胞生存率の測定を行う。品質検査に合格した後、－80℃に凍結したDC細胞を超低温液体窒素中に入れて長期保存する。
9）凍結保存後のDC細胞の一部を定期的に取り出し、解凍して凍結保存後の細胞の生存率を検出する。培養を拡大し、DC細胞の免疫表現型が変化したか否か、免疫細胞を刺激する活性が変化したか否かを検出する。
10）各DC細胞株毎の免疫表現型解析データ、HLAタイピング検出データ、細胞傷害活性及び品質管理関連データをまとめて記録し、該DC細胞のアーカイブを作成し、情報管理システムに記入する。
DC資源バンク内のDC細胞を用いて末梢血又は臍帯血単核細胞のCTL及びNK細胞の産生を誘導する
資源バンク内の活性DC細胞を、腫瘍もしくはウイルス感染者又は健康なボランティアからのPBMC（又は臍帯血単核細胞）と共培養して、混合リンパ球反応を行い、CTL及びNK細胞を産生する。
その手順を簡単に説明すると、次の通りである。
1）単核細胞のHLA表現型を検出する。
2）単核細胞と少なくとも1つのHLA-Aがマッチした細胞をDC細胞資源バンクから取り出し、蘇生させて培養して用意しておく。
3）単核細胞を培地で再懸濁した後、計数し、細胞濃度を2～5×106／ウェルとなるように調整し、6ウェルプレートに入れる。
4）HLAが単核細胞とマッチしたDC細胞を採取し、計数する。単核細胞：DC細胞の割合が500:1～100:1で適量のDC細胞をウェルに加える。6ウェルプレートを37℃、5% CO2の細胞培養箱にて一晩培養する。
5）翌日、6ウェルプレートに濃度が100～500単位／mLの組換えIL2溶液を加える。
6）DC細胞が完全になくなるまで培養を続ける。細胞の一部を採取し、誘導によって産生された免疫細胞の種類や免疫治療効果に関連する分子の発現状況を、フローサイトメトリーで分析する。操作方法は、上述のDC細胞免疫表現型の同定方法と同様である。
DC細胞の誘導により産生されたCTL細胞またはNK細胞の標的細胞に対する殺傷効果の測定
その手順を簡単に説明すると、次の通りである。
1）上述の工程で産生されたNK細胞とCTL細胞の混合物を、一定の量まで培養し続ける。
2）細胞を収集し、遠心管内で2500 rpmで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
3）5mLのPBSで細胞を再懸濁して洗浄し、2500rpmで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
4）0.5mLの培地で細胞を再懸濁して分散させ、100μLのCD3磁気ビーズを添加し、フリックしてよく混合する。
5）遠心管をシェーカーに載せ、室温で15分間ゆっくり振って、磁気ビーズと細胞を十分に結合させる。
6）遠心管にPBSを5mL加え、逆さにして混ぜる。遠心管をマグネットスタンドに載せて2分間静置する。
7）磁気ビーズから離れた側からピペットで細胞懸濁液を吸引し、全てを50mLの遠心管に移す。
8）マグネットスタンドから遠心管を取り外し、磁気ビーズを5mLのPBSで再懸濁する。遠心管をマグネットスタンドに載せて2分間静置する。
9）細胞懸濁液を、磁気ビーズから離れた側からピペットで吸引し、全て50mLの遠心管に移す。
10）工程8 ）及び9 ）を繰り返す。
11）前記50mLの遠心管内の細胞を遠心分離し、上清を廃棄する。5mLの培地で細胞を再懸濁し、100～500単位／mLのIL2因子を加え、培養瓶に移して培養を継続し、NK細胞を得る。
12）さらに、磁気ビーズに吸着された細胞を培地で再懸濁した後に、CTL細胞を培養する。
13）上記の工程の操作中に、標的細胞を蘇生させて継代培養する。
14）NK細胞又はCTL細胞を3～5日間培養し続けた後、標的細胞（ルシフェラーゼを発現するようにトランスフェクトしたもの）を採取して計数し、2.5～10×104個の細胞／ウェルで24ウェルプレートに接種し、培養箱に入れて2時間培養する。
15）良好に成長したNK又はCTL細胞を採取し、計数し、エフェクター／ターゲット比10:1、5:1、2:1、1:1で標的細胞のウェルに加え、4時間共培養する。
16）4時間後、培地の上清を吸引して廃棄する。全ての懸濁細胞が除去されるまでPBSでウェル内の細胞を洗浄する。
17）ウェルに100～200μLの溶解液を添加して標的細胞を溶解する。
18）溶解した後の各群の試料を収集し、12000rpmで1分間遠心分離する。
19）上清を20μL採取して96ウェルプレートに入れ、更にウェルにルシフェラーゼ基質溶液100μLを加える。
20）機器でルシフェラーゼ活性を検出し、殺傷状況を計算する。
実施例1.増幅されたDC細胞の表現型の同定
上述のような、Tax遺伝子を含むレンチウイルスの調製、単核細胞の分離、初期刺激（サイトカイン誘導）、並びにレンチウイルス・トランスフェクション、後期培養、及びスクリーニングの過程を含む方法により、本発明者は、各単核細胞から大量の細胞を豊富に収集した。これらの細胞をフローサイトメトリーによる免疫表現型解析を行ったところ、DC細胞関連のマーカー分子を発現していることを見出した。図2及び3は、DC細胞資源バンク内の異なる個体（BJ1とBJ7）からの2つのPBMCの増幅培養後に得られた細胞のFACS検出結果を示す。これらの細胞は、CD3陰性、CD14陰性、CD19陰性、CD56陰性を示し、T細胞、単球、B細胞、NK細胞の可能性を排除した。これらの細胞は、DC細胞関連のマーカー分子CD11c及びCD205を発現した。これらの細胞は、CCR7、HLA-DR、CD83などDC細胞成熟に関連するマーカー分子を発現した。同時に、これらの細胞は、CD40、CD70、4-1 BBL、CD80、CD83、CD86などDC細胞活性化に関連するマーカー分子も発現した。また、顕微鏡で観察したところ、個々の懸濁細胞の一部は表面に多数のスパイクがあった。培養中、細胞の一部は、壁に付着しながら成長する特徴を有し、典型的なDC細胞の形態を示した。したがって、複数の免疫表現型分子の解析と形態観察を組み合わせて、これらの細胞がDC細胞であることを確定した。
実施例2.本発明の方法によるDC細胞の増幅は高い成功率及び高い選択性を有する
ボランティアからの寄付により、本発明者らは、健常な成人6人の末梢血を7～9mLずつ採取した。採血から実験処理開始までの時間を3時間内に抑えた。上述のPBMC分離方法によって、6つの異なる由来の血液試料に対してPBMC分離を行った。バフィーコートの細胞を得た後、PBSで洗浄し、血清含有培地で再懸濁したら、PHA因子を加え刺激培養を開始した。翌日から、200単位／mL（最終濃度）のIL2タンパク質を細胞に添加して培養する。刺激培養から3日後、刺激を受けた細胞を、先に調製したSTLV3 Taxレンチウイルス懸濁液でトランスフェクトし、同時に、IL2を添加して培養し続ける。その後、細胞の増殖状況に応じてIL2含有培地を交換又は添加し、培養を続けた。3～4週間培養したところ、一部の細胞は成長速度が低下して次第に死滅し、残りの細胞は培養を継続した。培養を2ヶ月間続けた後、本発明者らは、細胞の一部を採取してフローサイトメトリー解析及び形態観察を行ったところ（実施例1に記載）、成長を続けた細胞がDC細胞であることを確認した。これら6つの末梢血試料のうち、1つは暫く培養したら徐々に死滅したが、残りの5つは4ヶ月以上も培養した。2ヶ月培養し、フローサイトメトリーによりDC細胞であることを確認した後、本発明者らは、増幅し続けている細胞の一部を凍結保存し始め、残りの部分の細胞は培養を継続した。その後、凍結保存された細胞を蘇生させて培養したところ、依然として良好な成長・増幅性を維持していることを見出した。したがって、本発明の方法により、6つの末梢血試料のうちの5つから、活性DC細胞を増幅させることに成功した（成功率83%）。残り1つの増幅の失敗は、操作ミスによるものではないかと判断した。この仮説を確認するために、本発明者らは、増幅に失敗した血液試料のドナーを見つけ、別の8mLの末梢血を寄付してもらった。本発明の方法で再び培養・増幅を行い、少なくとも4ヶ月以上の培養周期を経て増幅・活性化に成功した。したがって、本発明が提供するDC細胞増幅方法は、理論的にはDC細胞の増幅・活性化を効率的に達成することができ、成功率は100%に近い。
一方、DC細胞はPBMC細胞数の1%のみを占め、T細胞は約58%、B細胞は約20%、NK細胞及び単球はそれぞれ約10%、NKT細胞は約1%を占めることが知られている。本発明者らが得た健康なボランティアの末梢血は7～9 mLに過ぎず、分離後、得られた0.8～1.5×107個のPBMC細胞を全て樹状細胞の増幅に用いたため、これらの細胞中のDC細胞の含有量を検出したり、DC細胞や単球を分離したりすることはしなかった。培養中、2つのグループの細胞が出現し、一方のグループは凝集して成長しやすく、他方のグループは培地中に個々に散在している。3週間～5週間培養すると、クラスター状になって成長していた細胞が増加し、個々に散在していた細胞が徐々に消失していくことが絶え間ない観察により分かった。したがって、本発明の方法で2ヶ月培養後に得られた細胞は、基本的には塊状の細胞であった。これらの細胞は、如何なる選別処理も受けることがなく、各種のマーカー分子及び形態学によって純粋なDC細胞であることが証明された。これは、異体の使用に特に重要であり、T細胞のような他の細胞の存在が移植片対宿主病を引き起こすことを防ぐことができる。
実施例3.増幅されたDC細胞が抗原特異的T細胞の産生を誘導する能力
正常な細胞のテロメアは、細胞分裂に伴って進行性短縮し、ある程度になると細胞は老化して死んでいく。テロメラーゼの活性化は、テロメアの長さを相対的安定に維持でき、それによって細胞は無限に増殖する能力を取得し、さらに発癌を進行させることができるようになるため、テロメラーゼ活性の異常は、腫瘍形成や発がんと密接に関係している。テロメラーゼは、テロメラーゼ逆転写酵素（hTERT）、テロメラーゼRNA、及びプソイドウリジン合成酵素から構成され、hTERTは、テロメラーゼ活性を制限する成分である。研究により、hTERTは、90%以上の腫瘍細胞で高発現し、腫瘍形成や発がんに重要な役割を果たすことが明らかになっている。また、hTERTは正常組織細胞ではほとんど発現しないため、非常に理想的な腫瘍の標的である。
これに基づいて、本実施例では、DC細胞の資源バンクからDC細胞株（BJ8、STLV4Taxタンパク質トランスフェクションによって調製され、HLA表現型はA0201+及びA2402+である）を選択し、レンチウイルスによるトランスフェクションを行ってhTERT（DC-hTERT）を連続的に発現させた。DC-hTERT細胞とHLA-AがマッチしたPBMCを選択し、MLRアッセイを行い、共培養刺激により大量の免疫細胞を産生した。後者はCD3磁気ビーズ選別により個々の細胞群を得たが、フローサイトメトリーによって検出されたように（図4）、このT細胞群は、主にCD8+T細胞であった。TCR受容体の種類によると、Tα／β細胞もTγ／δ細胞も含むことが区別された。Tα／β細胞は、MHC制限方式で標的細胞を殺傷する一方、Tγ／δ細胞は、MHC非MHC制限方式で細胞を殺傷することにより、協同攻撃の役割を果たすことができる。同時に、一部の細胞はCD56分子やNK細胞活性化に関連する受容体NKG2Dを発現し、このDC細胞株がCTL細胞の増幅を刺激しながら、NKT細胞の産生も誘導できることを示唆している。
実施例4.増幅されたDC細胞の誘導によって産生されたhTERT特異的T細胞の腫瘍細胞に対する殺傷効果
本実施例では、HLA-A0201+／A2402+のPBMC細胞を用いて、実施例3の親DC細胞及びDC-hTERTとそれぞれ共培養することにより、T細胞を産生させた。これらの2種類のT細胞はCD3磁気ビーズ選別後に、腫瘍細胞に対する殺傷効果を測定した。
まず、本研究では、T細胞の殺傷効果がhTERT特異的であることを確認する必要があった。そこで、本研究では、ヒト骨肉腫細胞U2OS (HLA-A2)を標的細胞として選択した。この標的細胞の大きな特徴は、バックグラウンドのTERTタンパク質の発現量が非常に低く、ほとんど検出されないことである。遺伝子工学により修飾されたU2OS／TERTは、hTERTタンパク質を発現することができる。研究では、親U2OS及びU2OS／TERTを標的細胞として選択し、hTERT特異的T細胞の殺傷効果を検出した。図5から分かるように、TERTタンパク質を発現しない親U2OS細胞に対しては、hTERT特異的T細胞の殺傷効果が非常に弱く、高いエフェクター／ターゲット比（10:1）でのわずかな殺傷は、T細胞中のTγδ細胞によるものである可能性がある。一方、TERTタンパク質の発現後に、U2OS細胞に対するT細胞の殺傷効果が明らかに増強されたことから、本発明の方法がhTERT特異的T細胞の産生を誘導したことが示唆されている。
次に、標的細胞として3つのメラノーマ細胞株を用い、対照として正常ヒト線維芽細胞NHF（HLA-A2／A2）を用いた（図6）。腫瘍細胞は、それぞれA375 (HLA-A0101 ／A0201)、SK-MEL-3（HLA-A2402）、SK-MEL-24（HLA-A1／A2）の3株であり、これら3株の細胞はいずれも、T細胞HLAとマッチしたHLAが1つしかなかった。図6に示す結果から分かるように、A375細胞は、TERT抗原特異的に誘導されないT細胞に対して感受性がなく、エフェクター／ターゲット比が10:1の条件下ではT細胞殺傷効果が20%に過ぎなかった。一方、TERT特異的T細胞は、A375腫瘍細胞に対する殺傷効果が90%以上にも達することができた。エフェクター／ターゲット比が1:1の条件下でも、hTERT特異的T細胞のA375に対する殺傷力は、50%以上であった。SK-MEL-3細胞株及びSK-MEL-24細胞株について、非特異性T細胞は、エフェクター／ターゲット比が1:1である場合、殺傷効果が40%未満であったが、hTERT特異的T細胞は、エフェクター／ターゲット比が1:1である場合、殺傷効果が90%以上にも達しており、hTERT特異的T細胞がより低いエフェクター／ターゲット比でTERT発現腫瘍細胞を標的とした殺傷効果を起こし得ることが示唆された。また、NHFに対するhTERT特異的T細胞の殺傷効果が非常に弱かったことから、TERT特異的T細胞は、腫瘍に対して選択的殺傷効果を有し、安全性が高いことが示唆された。
別の研究では、NL20細胞（遺伝子操作により無限に増殖できる気管支表皮細胞、HLA-A1／3）、H1299（肺がん細胞、HLA-A32／A24）、正常ヒト線維芽細胞（normal human fibroblasts、NHF，HLA-A2／A2）の3つの細胞株を研究対象として選択した。まず、NL20細胞はHLA-A0201分子を発現させ、HLAホモ型T細胞によって認識できるように、H1299細胞はHLA-A0201分子を発現させ、この細胞がHLAホモ型T細胞とより高いマッチ度を有するように（HLA-A0201とHLA-A2402の両方とマッチさせる）、NHF細胞はがん精巣抗原MAGEA3を発現させ、hTERT特異的T細胞がこの細胞に殺傷効果を持っているか否かを観察するように、3つの細胞株を遺伝子修飾した。図7に示す結果から分かるように、非抗原特異的T細胞は、エフェクター／ターゲット比が2:1である場合、NL20とNL20 ／A2.1細胞のいずれに対しても殺傷効果が10%未満と小さかった。一方、hTERT特異的T細胞は、エフェクター／ターゲット比が2:1である場合、NL20及びNL20／A2.1細胞の70%以上を殺傷することができ、特異的殺滅効果が強いことが示唆された。同時に、肺がん細胞H1299及びH1299／A2.1に対しては、非特異的T細胞は、エフェクター／ターゲット比が2:1である場合、ほとんど殺傷効果を示さなかったが、hTERT特異的T細胞は、エフェクター／ターゲット比が2:1である場合、殺傷効果が70%以上にも達成できた。H1299細胞では、HLA-A24のみがTとマッチし、H1299／A2.1では、HLA-A0201及びHLA-A24が共にT細胞とマッチしていたため、マッチ度のより高いH1299／A2.1に対するT細胞の殺傷効果はH1299に比べて強く、HLAのマッチ度が高いほどT細胞の殺傷力が高いことが示唆された。NHF／MAGEA3細胞では、腫瘍抗原MAGEA3を発現しているものの、エフェクターT細胞はhTERTに特異的であったため、明らかな殺傷効果は見られず、T細胞の殺傷特異性が高いことが示唆された。
実施例5.増幅されたDC細胞の刺激によってCTL、NK及びNKT細胞の産生を誘導する
腫瘍免疫療法が直面する問題の一つは、腫瘍の免疫逃避である。腫瘍組織の不均質という特徴に起因して、同じ組織内の腫瘍細胞は、異なる免疫特性を示すことができ、MHCの発現量は、高かったり低かったり、或いは全く発現しないこともある。この場合、MHC制限性キラーT細胞による単一の治療は、短期的には一定の効果を有するが、長期的には残存免疫細胞の脱出を阻止することができず、腫瘍の再発を引き起こす可能性がある。したがって、異なる殺傷メカニズムを有する免疫細胞による相乗的治療は、今後の免疫治療のトレンドとなる。本発明に係るDC細胞資源バンク内のDC細胞は、CTL細胞の活性化や増殖を刺激すると同時に、一定の割合（25%～90%）のCD56+細胞、すなわちNK細胞及びCD3 +CD56+であるNKT細胞の産生を誘導できるという大きな特徴を有する。この混合免疫細胞群を腫瘍治療に使用することにより、相乗効果が得られ、免疫逃避を防止する効果を達成できる。
本実施例では、DC細胞資源バンクから3つのDC細胞株を選択し、HLAとそれぞれマッチしたPBMCと混合培養した。
BJ3（STLV Taxトランスフェクションによって樹立された）というコードネームのDC細胞株は、1つのPBMC細胞（HLA-A2表現型）と混合培養し、両方ともHLA-A2表現型に属する。
BJ19（STLV3 Taxトランスフェクションによって樹立された）というコードネームのDC細胞株は、1つのPBMC細胞と混合培養し、両方ともHLA-A2表現型に属する。
BJ18（STLV4 Taxトランスフェクションによって樹立された）というコードネームのDC細胞株は、1つのPBMC細胞と混合培養し、両方ともHLA-A0201及びHLA-A2402表現型に属する。
培養後に得られた細胞培養物をFACS分析を行い、その結果をそれぞれ図8～図10に示す。図から分かるように、MLRアッセイの誘導によって産生された細胞は、主にCD8+T細胞、CD56+NK細胞、CD3+CD56+のNKT細胞である。CD3+CD8+のT細胞は2つのグループがあり、一方のグループは蛍光強度が強く、CD8の発現が比較的に高いことに対応し、他方のグループは蛍光強度が弱く、CD8の発見が比較的に低いことに対応している。誘導によって産生されたT細胞は、主にTα／β細胞であり、免疫抑制を引き起こすPD1、CTLA4などの因子を含まないか、又はわずかに含んだ。
実施例6.増幅されたDC細胞の誘導によって生産されたNK細胞による標的細胞の殺傷効果
本明細書に記載の方法により、DC資源バンク内の1つのDC細胞株（BJ9）を用いてPBMCの増幅を誘導した後、CD3+及びCD56+という2つの細胞群を産生した。CD3磁気ビーズネガティブソーティングを行った後、大量のCD56+細胞、すなわちNK細胞が得られた（図11）。NK細胞は、腫瘍細胞に対してMHC非拘束性殺傷効果を生じ得る。研究では、本発明者は、肺がん細胞A549を研究対象として選択し、得られたNK細胞の当該細胞に対する殺傷効果を観察した。その結果は、図12に示すように、エフェクター／ターゲット比が1:1である場合、NK細胞のA549細胞に対する殺傷効果は40%以上にも達した。NK細胞の活性化は、NK細胞上の活性化受容体NKG2Dと標的細胞上のリガンドMICAなどとの相互作用に主に依存していることは、先行研究により示されている。マウスとヒト免疫細胞の違いを考慮すると、理論的にはマウス由来細胞はヒトNK細胞に対して感受性が低く、NK細胞の作用機序を研究するための理想的なモデルである。本実施例では、研究対象としてマウス線維芽細胞NIH3T3を用いた。ヒトNK細胞のリガンドMICAを発現させるように遺伝子修飾を行い、NK細胞がそれに対して特異的に殺傷するか否かを観察した。その結果を図13に示すが、3T3-Luc細胞はルシフェラーゼ酵素を発現し、3T3-Luc／hMICA細胞はルシフェラーゼ及びヒトMICAタンパク質（hMICA）を同時に発現している。この結果から、ヒトNK細胞は、そのリガンドであるMICAを認識することにより、マウス由来NIH3T3細胞に対して強い特異的殺傷効果を示したことが分かった。例えば、エフェクター／ターゲット比が1:1である場合、3T3-Luc／hMICA細胞に対する殺傷効果は、約60%にも達したのに対し、3T3-Luc細胞に対する殺傷効果は10%未満であった。
なお、本明細書に記載の一部の実施形態は、STLV3及びSTLV4ウイルス由来のTaxタンパク質を用いて実施されたが、他のサブタイプのウイルス（STLV1、STLV2）のTaxタンパク質を用いた場合でも、同様の結果が得られた（図示されていない）。
以上の説明から分かるように、本発明に係るDC細胞の増幅方法によれば、cGMP環境下での初代DC細胞のインビトロでの大規模培養を実現し、治療時の数の限界を突破すること、全てのDC細胞が高度に活性化された状態にあることを確保すること、必要に応じて、任意の腫瘍又はウイルス抗原を効率的かつ安定に提示し、高い抗原負荷率及び多数の適応症を有する特性を実現するために、DC細胞を容易に遺伝子操作することを確保すること、任意の個体のDC細胞でも効果的に増幅すること、すなわち、株の樹立効率が高いことを実現すること、少量の末梢血又は臍帯血（≦10mL）を採取するだけで、大量のDC細胞を効率的に増幅できること、増幅されたDC細胞を永久的に凍結保存でき、蘇生後も活性を維持できること、を実現できる。
安全性の面では、サルSTLV Taxタンパク質がヒト疾患を引き起こす可能性は報告されていないため、交差感染のリスクは極めて低い。また、このSTLV Taxたんぱくは、ヒトにとって外因性タンパク質であり、高い免疫原性を有し、免疫アジュバントのような機能も発揮し、ヒト免疫細胞活性を刺激し、抗腫瘍効果や抗ウイルス効果を強化することができる。
したがって、本発明の方法に基づき、本発明者らは、健常人群又は早期がん患者群由来のDC細胞を、本発明に係るDC細胞増幅方法により、その増殖能及び機能を達成するために改変し、同時に、各DC細胞のデータ情報（HLAタイピング、DC細胞の成熟・活性化に関連する分子の発現状況、インビボ活性やインビトロ活性などを含む）を取得する、ヒトDC細胞資源バンクを提供する。このヒトDC細胞資源バンクは、極めて大きい利用価値を有する。第一に、自己由来DC細胞機能の強化の目標を達成し、将来のがん又はウイルス感染症の治療又は予防に役立つことができる。例えば、DC資源バンクは、健常人群又は非感染性疾患の早期がん患者の血液試料を採取してDC細胞を活性化させ、品質検査に合格した後、超低温環境で保存する。このDC資源バンクは、将来、疾患又は予防のために自己由来DC細胞の使用が必要とされる場合に、数が十分で且つ高い活性を有するDC細胞を提供することができる。次に、HLAマッチング方法を用いて、DC細胞の同種異体使用は資源共有化を実現させる。このDC細胞資源バンク内の全てのDC細胞は、厳密な技術でスクリーニングされており、如何なる感染性病原体も保有していない。がん又は急性ウイルス感染症の患者が自分の免疫細胞の機能が低下して使用できなくなる場合、HLAマッチングした後、DC細胞資源バンク内で患者に適したDC細胞株をすぐに見つけることができ、このDC細胞株は、蘇生・継代後に患者に迅速に適用でき、貴重な時間を稼ぐことができる。第三に、このDC細胞資源バンクは、国家的又は世界的な公共衛生や医療技術の分野にDC細胞資源を提供することができ、それは、いくつかの既知又は未知の急性爆発性ウイルス感染症を研究し、克服するための効果的な武器である。
STLVウイルスTaxタンパク質アミノ酸配列：
SEQ ID NO：1 STLV1 Taxたんぱく質
MAHFPGFGQSLLFGYPVYVFGDCVQGDWCPITGGLCSARLHRHALLATCPEHQITWDPIDGRVIGSALQFLIPRLPSFPTQRTSKTLKVLTPPTTPKTPNIPPSFLQAMRKYSPFRNGYMEPTLGQHLPTLSFPDPGLRPQNLYTLWGGSVVCMYLYQLSPPITWPLLPHVIFCHPGQLGAFLTNVPYKRIEELLYKISLTTGALIILPEDCLPTTLFQPARAPVTLTAWQNGLLPFHSTLTTSGLIWTFTDGTPMISGPCPKDGQPSLVLQSSSFIFHKFQTKAYHPSFLLSHGLIQYSSFHNLHLLFEEYANVPISLLFNEKEANDTDHEPQISPGGLEPPSEKHFRETEV
SEQ ID NO：2 STLV2 Taxたんぱく質
MAHFPGFGQSLLYGYPVYVFGDCVQADWCPVSGGLCSTRLHRHALLATCPEHQLTWDPIDGRVVGSPLQYLIPRLPSFPTQRTSKTLKVLTPPTTPVSPKIPPAFFQSMRKLSPYRNGCLYPTLGDQLPSLAFPDPGLRPQNIYTTWGRTVVCLYLYQLSPPMTWPLIPHVIFCHPKQLGTFLTNVPLKRLEELLYKIFLHTGAIIVLPEDTLPTTLFQPVRAPCVQTAWDTGLLPYHSLITTPGLIWTFNDGSPMISGPCPKPGQPSLVVQSSLLIFEKFQTKAFHPSYLLSHQLIQYSSFHNLHLLFEEYTNIPXSYLFNEKEADDSDSDPGPSNLGAAQGESSA
SEQ ID NO：3 STLV3 Taxたんぱく質
MAHFPGFGQSLLYGYPVYVFGDCVQADWCPISGGLCSARLHRHALLATCPEHQITWDPIDGRVVSSALQYLIPRLPSFPTQRTTRTLKVLTPPTTATTPKVPPSFFHAVRKHTPFRNNCLELTLGEQLPAMSFPDPGLRPQNVYTMWGSSVVCLYLYQLSPPMTWPLIPHVIFCHPEQLGAFLTRVPTKRLEELLYKIFLSTGAILILPENCFPTTLFQPTRAPAIQAPWHTGLLPCQKEITTPGLVWTFTDGSPMISGPCPKEGQPSLVVQSSTFIFQQFQTKANHPAFLLSHKLIHYSSFHSLHLLFEEYTTVPFSLLFNEKGANVNDDEPQDEPQPPTRGQIAESSV
SEQ ID NO：4 STLV4 Taxたんぱく質
MAHFPGFGQSLLYGYPVYVFGDCVQADWCPISGGLCSPRLHRHALLATCPEHQITWDPIDGRVVGSPLQYLIPRLPSFPTQRTSKTLKVLTPPTTPVTPKVPPSFFQSVRRHSPYRNGCLETTLGEQLPSLAFPEPGLRPQNVYTIWGKTIVCLYIYQLSPPMTWPLIPHVIFCNPRQLGAFLSNVPPKRLEELLYKLYLHTGAIIILPEDALPTTLFQPVRAPCVQTTWNTGLLPYQPNLTTPGLIWTFNDGSPMISGPCPKAGQPSLVVQSSLLIFERFQTKAYHPSYLLSHQLIQYSSFHHLYLLFDEYTTIPFSLLFKEKEGDDRDNDPLPGATASPQGQN

Claims (27)

  1. 増幅されるヒトDC細胞を含む細胞試料をサルSTLV3ウイルス由来でSEQ ID NO：3で表されるアミノ酸配列を含むTaxタンパク質と接触させることを含む、ヒトDC細胞増幅方法。
  2. 前記接触は、前記Taxタンパク質の発現ベクターを前記増幅されるヒトDC細胞に導入し、前記増幅されるヒトDC細胞において前記Taxタンパク質を発現させることを含む、請求項1に記載の方法。
  3. 前記導入は、レンチウイルス・トランスフェクションによって行われる、請求項2に記載の方法。
  4. 前記細胞試料は、末梢血又は臍帯血である、請求項1～3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 前記増幅されるヒトDC細胞は、
    a）前記細胞試料から単核細胞を分離する工程と、
    b）前記単核細胞をヒトDC細胞に分化させるように誘導する工程によって得られる、請求項4に記載の方法。
  6. 工程b）は、前記単核細胞をPHA及びIL-2と順次又は同時に接触させること、又は前記単核細胞をGM-CSF及びIL-4と接触させることを含む、請求項5に記載の方法。
  7. 増幅されたヒトDC細胞内に、腫瘍関連抗原、腫瘍特異的抗原又はウイルス抗原の発現ベクターを導入することをさらに含む、請求項1～6のいずれか1項に記載の方法。
  8. 前記腫瘍関連抗原はhTERTである、請求項7に記載の方法。
  9. 増幅されたヒトDC細胞を、IL2含有培地で3週間～2ヶ月間培養し続けることをさらに含む、請求項1～8のいずれか1項に記載の方法。
  10. 前記方法は、増幅されるヒトDC細胞を前記細胞試料から分離する工程を含まない、請求項1～9のいずれか1項に記載の方法。
  11. 前記方法は、DC細胞の増幅成功率が80%以上である、請求項1～10のいずれか1項に記載の方法。
  12. 請求項1～11のいずれか1項に記載の方法によって得られるヒトDC細胞であって、前記ヒトDC細胞は、サルSTLVウイルス由来でSEQ ID NO：3で表されるアミノ酸配列を含むTaxタンパク質を発現する、ヒトDC細胞。
  13. ヒトDC細胞は、CD11c+及びCD205+である、請求項12に記載のヒトDC細胞。
  14. ヒトDC細胞は、CCR7+、HLA-DR+、並びにCD83、及び／又はCD40+、CD70+、4-1BBL+、CD80+、CD83+、CD86+である、請求項12又は13に記載のヒトDC細胞。
  15. 末梢血又は臍帯血単核細胞から、腫瘍細胞又はウイルス感染細胞傷害活性を有する細胞培養物を調製する方法であって、前記末梢血又は臍帯血単核細胞と、請求項1～11のいずれか1項に記載の方法で調製されたDC細胞とを混合培養することを含み、前記ヒトDC細胞は、サルSTLVウイルス由来でSEQ ID NO：3で表されるアミノ酸配列を含むTaxタンパク質を発現する、方法。
  16. 末梢血又は臍帯血単核細胞からCTL細胞を調製する方法であって、前記末梢血又は臍帯血単核細胞と、請求項1～11のいずれか1項に記載の方法で調製されたヒトDC細胞とを混合培養し、混合培養した細胞からCD3+細胞を分離することを含み、前記ヒトDC細胞は、サルSTLVウイルス由来でSEQ ID NO：3で表されるアミノ酸配列を含むTaxタンパク質を発現する、方法。
  17. 前記CTL細胞は、Tα／β細胞及びTγ／δ細胞を含む、請求項16に記載の方法。
  18. 末梢血又は臍帯血単核細胞からNKT細胞を調製する方法であって、前記末梢血又は臍帯血単核細胞と、請求項1～11のいずれか1項に記載の方法で調製されたヒトDC細胞とを混合培養し、混合培養した細胞からCD3+及びCD56+細胞を分離することを含み、前記ヒトDC細胞は、サルSTLVウイルス由来でSEQ ID NO：3で表されるアミノ酸配列を含むTaxタンパク質を発現する、方法。
  19. 末梢血又は臍帯血単核細胞からNK細胞を調製する方法であって、前記末梢血又は臍帯血単核細胞と、請求項1～11のいずれか1項に記載の方法で調製されたヒトDC細胞とを混合培養し、混合培養した細胞からCD3-及びCD56+細胞を分離することを含み、前記ヒトDC細胞は、サルSTLVウイルス由来でSEQ ID NO：3で表されるアミノ酸配列を含むTaxタンパク質を発現する、方法。
  20. ヒトDC細胞資源バンクを構築する方法であって、請求項1～11のいずれか1項に記載の方法により、複数の被験者の細胞試料から、各被験者に対応する増幅されたヒトDC細胞をそれぞれ取得することを含み、前記ヒトDC細胞は、サルSTLVウイルス由来でSEQ ID NO：3で表されるアミノ酸配列を含むTaxタンパク質を発現する、方法。
  21. 前記被験者の数は400よりも多い、請求項20に記載の方法。
  22. 前記増幅されたヒトDC細胞の表面マーカー分子、前記増幅されたヒトDC細胞の活性、及び前記増幅されたヒトDC細胞のHLAタイピングを検出して記録することをさらに含む、請求項20又は21に記載の方法。
  23. 前記活性の検出は、前記増幅されたヒトDC細胞と末梢血単核細胞とを共培養し、得られた細胞の傷害活性を検出することによって行われる、請求項22に記載の方法。
  24. 前記各被験者に対応する増幅されたヒトDC細胞を別々に凍結保存することをさらに含む、請求項20～23のいずれか1項に記載の方法。
  25. 前記凍結保存されたヒトDC細胞の活性の変化を定期的に検査して記録することをさらに含む、請求項24に記載の方法。
  26. 請求項20～25のいずれか1項に記載の方法によって構築された、ヒトDC細胞資源バンク。
  27. 被験者の末梢血又は臍帯血単核細胞から、腫瘍又はウイルス傷害活性を有する細胞培養物を調製する方法であって、
    1）前記被験者の末梢血又は臍帯血単核細胞のHLAタイピングを検出すること、
    2）前記被験者の末梢血又は臍帯血単核細胞HLAとマッチするヒトDC細胞を、請求項26に記載のヒトDC細胞資源バンクから選択すること、及び
    3）前記被験者の末梢血又は臍帯血単核細胞を、ヒトDC細胞と混合培養すること、
    を含む方法。
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