CN109957548A - 一种基因修饰的树突状细胞疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术及医药领域，提供一种经修饰的树突状细胞(dendritic cell，DC)，利用慢病毒载体负载MG‑7Ag抗原模拟表位串联序列感染树突状细胞，使目的抗原序列整合至树突状细胞基因组，本发明提供一种外周血单核细胞来源树突状细胞体外快速培养方案，本发明还提供一种活性成分为经该修饰的树突状细胞疫苗。该疫苗用于针对肿瘤的预防和主动免疫治疗。本发明的MG‑7Ag抗原序列修饰DC疫苗具有经DC‑CTL共培养后可获得高纯度CTL细胞和高效的靶细胞杀伤能力，共培养上清中含有高浓度的IFNγ分泌。肿瘤攻击后，DC‑CTL组小鼠成瘤体积明显小于对照组，这一DC疫苗在MG‑7Ag阳性肿瘤的免疫治疗方面有巨大的潜在价值。

Description

一种基因修饰的树突状细胞疫苗

发明领域

本发明涉及生物技术及医药领域，具体地，本发明涉及一种基因修饰的树突状细胞及包含该修饰树突状细胞的疫苗。

发明背景

树突状细胞(dendritic cells，DC)是人体内功能最强的专职抗原提呈细胞，它能激活CD8+细胞毒性T细胞(CTL)和CD4+辅助性T细胞(Th)，在抗肿瘤、抗病毒等免疫应答过程中发挥重要作用。大多数研究表明体内肿瘤抑制了DC的成熟而非直接抑制DC的功能。研究发现，恶性肿瘤组织内树突状细胞的数量、功能与肿瘤组织原发灶、转移灶中瘤细胞向周围组织浸润的程度以及患者的临床分期呈负相关，而大部分实体肿瘤内浸润树突状细胞的数量越多则患者的预后越好(J Surg Oncol，2007，95(2)：123-128)。肿瘤患者体内的树突状细胞存在分化成熟障碍，导致其在表达细胞因子、表面抗原、激活T细胞增殖并诱导CTL生成等方面均存在不同程度的功能缺陷，包括CD8⁺T细胞增加、CD4⁺T细胞降低、CD4⁺/CD8⁺比例降低以及自然杀伤细胞数量下降等。所以体外诱导功能性DC用于免疫治疗有着重要的临床应用价值。

DC广泛分布与人体多个部位，如血液以及肝脾、淋巴结、肺、肾、胃肠道等组织间质，约占外周血单个核细胞总数0.5-1％。DC亚群分类复杂，骨髓源DC(mDC)和淋巴源DC(pDC)是外周血DC的两种主要类型。DC可以经由单核细胞分化生成，分离PBMC中的单核细胞体外培养，GM-CSF和IL4诱导生成未成熟DC(Curr Protoc Immunol 2005；Chapter 22：Unit22F 4)。未成熟DC可以通过不同的成熟诱导成分分化成熟，DC的成熟状态是决定DC疫苗有效性的一个关键因素。未成熟DC致敏T细胞能力有限，并且还可能诱导T细胞耐受。另外成熟DC的迁移能力更强，能更有效的迁移至次级淋巴组织的T细胞区，进而诱发免疫反应。

体外培养和诱导DC方法的建立，为DC疫苗的研制提供技术平台，在体外培养DC，荷载抗原并诱导细胞成熟，把这种经过修饰的DC回输体内，有多种修饰策略用于DC疫苗的开发和研究中。采用肿瘤细胞或细胞裂解物、凋亡的肿瘤细胞、肿瘤细胞溶解物、肿瘤蛋白、重组表达肿瘤抗原优势表位肽、肿瘤多肽混合物等负载抗原方式致敏DC制成肿瘤疫苗，但受已确认肿瘤抗原限制或因混合抗原包含机体正常抗原诱发自身免疫性疾病。DC回输机体虽可诱导特异性免疫应答，但多数MHC限制性抗原肽的半衰期只有数小时，需要反复多次回输诱导高水平持久免疫应答。

将肿瘤抗原编码基因修饰DC制备成疫苗可以延长抗原提呈时间，产生多表位抗原长期有效诱导T细胞免疫应答。以慢病毒载体进行基因转移具有很高的转导效率，介导抗原基因高效持续表达，诱发的免疫应答也更持久，也有利于表达抗原通过内源性抗原途径直接激活CD8⁺T细胞。

MG-7Ag是经MG-7抗体筛选获得的胃癌敏感特异性抗原，它几乎不表达于正常组织，对胃癌有较高的敏感性和特异度，胃癌中阳性率高达82.8％(CANCER，2000，88(2)：280-285)，并在肺癌、结直肠癌和乳腺癌中有较高表达。

使用经噬菌体随机肽库筛选获得的MG-7Ag的模拟抗原表位序列，使用多表位串联方式，诱导各表位的特异性免疫反应，解决不同人群的适应性问题。采用GGGS作为间隔序列避免抗原表位之间的相互干扰和模拟表位序列临近氨基酸的对MHC分子的亲和影响。

发明内容

本发明目的在于针对MG-7Ag抗原的肿瘤特异性和广谱应用价值，提供一种慢病毒载体介导的MG-7Ag模拟表位串联序列修饰树突状细胞，并制备包含该修饰树突状细胞的疫苗，用于针对MG-7Ag阳性表达的肿瘤类型和个体。

本发明另一目的在于针对现有外周血源树突状细胞体外培养时间较长，提供一种短期可以获得高效DC的体外培养方案。

实现上述发明目的的技术方案是：合成MG-7Ag四表位串联序列，以GGGS为间隔序列，通过酶切、连接，转接到目的慢病毒载体。慢病毒包装纯化，并进行滴度检测。将分选富集的外周血单核细胞以3-5×10⁶cells/mL细胞密度重悬于KBM551、AIM-V、RPMI-1640任意一培养基，铺布培养瓶中在37℃5％CO₂培养箱孵育1h后更换分化诱导培养基。分化诱导48h后慢病毒感染诱导分化DC，分化诱导72h后加入成熟诱导因子诱导成熟。

作为优选，分化诱导培养基采用含1-3％自体血浆，300-1000U/mL rhIL-4、300-1000U/mL rhGM-CSF的AIM-V或RPMI-1640培养基加入铺布单核细胞的培养瓶中，然后培养48h，加入感染慢病毒，培养72h后更换新鲜培养基。

作为优选，分化诱导培养具体为：

1)将12mL的含2％自体血浆，1000U/mL rhIL-4、500U/mL rhGM-CSF的AIM-V或RPMI-1640培养基加入贴壁的单核细胞培养瓶中，置于37℃ 5％CO₂培养箱孵育。

2)培养72h后，300g离心8min收集分化的DC，更换新鲜的12mL的含2％自体血浆，1000U/mL rhIL-4、500U/mL rhGM-CSF的AIM-V或RPMI-1640培养基重悬，置于培养瓶，37℃5％CO₂培养箱孵育。

作为优选，成熟诱导培养基采用含有5μg/mL poly(I∶C)的分化培养基。

将上述携带MG-7Ag模拟表位串联序列的慢病毒感染体外培养的单核诱导树突状细胞即得到本发明的DC疫苗，对所得的DC疫苗进行相关免疫学分析以确定其疫苗的效力。所述免疫学效力分析包括DC成熟度检测，即DC表面CD11c、CD80、CD86、CD83分子表达水平检测，体外杀瘤率，细胞表型及细胞因子分泌检测。

所述DC疫苗细胞表面CD11c、CD80、CD86、CD83分子均高水平表达，DC-CTL所得CD3⁺CD8⁺T细胞纯度＞80％，DC-CTL相比于对照组有显著的杀瘤效果和IFNγ分泌量，因此本发明的DC疫苗具有良好的主动免疫治疗效果。

附图说明

图1所示是本发明实施例中MG-7Ag抗原模拟表位串联氨基酸和核苷酸序列。

图2所示是本发明实施例中第一个MG-7Ag抗原模拟表位氨基酸和核苷酸序列。

图3所示是本发明实施例中第二个MG-7Ag抗原模拟表位氨基酸和核苷酸序列。

图4所示是本发明实施例中第三个MG-7Ag抗原模拟表位氨基酸和核苷酸序列。

图5所示是本发明实施例中第四个MG-7Ag抗原模拟表位氨基酸和核苷酸序列。

图6所示是本发明实施例中DC表面细胞标志物表达检测情况。

图7所示是本发明实施例中DC培养上清IL-12p70分泌。

图8所示是本发明实施例中DC-CTL杀瘤效率情况。

图9所示是本发明实施例中DC-CTL共培养的细胞表型情况。

图10所示是本发明实施例中DC-CTL共培养的细胞因子分泌情况。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

一种经修饰的树突状细胞，慢病毒载体负载MG-7Ag抗原模拟表位串联序列感染树突状细胞，使目的抗原序列整合至树突状细胞基因组中。

1.MG-7Ag抗原模拟表位串联序列合成

携带Asc I/Xba I双酶切位点MG-7Ag抗原模拟表位串联序列合成，装载与PUC57质粒。

2.MG-7Ag抗原模拟表位串联序列慢病毒表达载体构建

慢病毒pLVX-shRNA表达载体购买自Clontech公司，双质粒经酶切获得目的序列和连接载体。目的序列凝胶纯化试剂盒回收后加P处理，载体序列去P处理后凝胶纯化试剂盒回收，两者进行连接反应，转化E.coli感受态细胞。

双酶切体系如下：

目的序列加P处理体系如下：

连接载体去P反应体系如下：

连接反应体系如下：

3.连接产物转化

感受态细胞冰上解冻，加入目的连接产物，轻柔混匀，冰上反应30min，42℃热击60s，冰置2min。加入600μL的不含抗生素LB培养基，37℃摇床培养1h。取100μL菌液涂布LB氨苄平板，37℃培养箱培养过夜。

4.重组质粒克隆鉴定

从培养好的氨苄平板上挑取2-3个克隆，置于含氨苄的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜。收集菌体，用无内毒素质粒DNA提取试剂盒获得纯化重组质粒DNA，经Asc I/XbaI双酶切鉴定。双酶切验证反应体系如步骤2所述。并测序验证插入目的序列正确。

5.慢病毒包装

5.1 293FT细胞经Trypsin消化收集，10cm培养皿以5×10⁶细胞量布板，每10cm培养皿加入细胞重悬后的9mL培养基。

5.2准备两个5mL离心管，分为a管和b管，a管和b管分别加入1.5mL无血清Opti-MEM培养基，a管中加入8μg混合包装辅助质粒和6μg包装目的质粒，轻柔混匀；b管中加入36μL的Lipofectamine 2000试剂，轻柔混匀。

5.3混匀好的b管溶液轻柔加入a管中，轻柔混匀，室温孵育10min使形成DNA-Lipofectamine 2000复合物。

5.4将孵育好的DNA-Lipofectamine 2000复合物逐滴回旋加入10cm培养皿，轻柔回旋混匀。37℃、5％CO2培养箱培养过夜。

5.5培养过夜后，移去旧培养基，细胞比较容易脱落，沿壁小心加入12mL的DMEM+2％FBS病毒制备培养基，37℃、10％CO2培养箱培养过夜。

5.6转染后40h收集细胞培养上清，1500rpm离心5min，去除细胞碎片。上清经0.45μm PES滤器过滤。10cm培养皿沿壁小心添加12mL新鲜的DMEM+2％FBS制备培养基，37℃、10％CO2培养箱培养过夜。

5.7转染后62h收集细胞培养上清，2000rpm离心5min，去除细胞碎片。上清经0.45μm PES滤器过滤。

6.慢病毒滴度检测

6.1收集对数生长期HT1080细胞铺布96孔板，6×10³/孔细胞量布板，每孔100μLDMEM+10％FBS完全培养基。

6.2第二天用DMEM无血清培养基对荧光表达病毒液进行10倍梯度稀释，每个梯度重复3次。具体操作为：准备9个无菌离心管，制备8个梯度使用梯度，第一个离心管加入80μL的DMEM，取待测样本10μL，混匀。其后每个梯度离心管加入360μL的DMEM，依次取上一稀释梯度40μL样本加入，混匀。每个梯度依次以加入病毒原液量标记为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7。

6.3依次吸出各梯度孔90μL培养基，加入相应梯度稀释好的各梯度病毒液90μL。37℃、5％CO2培养箱培养过夜。

6.4 24h后加入DMEM+10％FBS完全培养基100μL。

6.5感染72h后，观察荧光表达情况，荧光细胞数随稀释梯度倍数增加而较少，梯度间细胞数同稀释倍数差一致。计数可见荧光的最大稀释倍数的上一稀释梯度的荧光细胞数，以此计算荧光表达病毒滴度。并以此滴度为参照检测目的序列病毒滴度。

6.6收集对数生长期HT1080细胞铺布6孔板，布板细胞数量为2×10⁵/孔，每孔2mLDMEM+10％FBS完全培养基。

6.7第二天用目的病毒液和荧光表达病毒液感染，荧光表达病毒液使用5μL和1μL两个梯度，目的病毒液使用1μL，分别使用1mL的无血清DMEM培养基稀释，混匀。从各细胞孔吸出1mL培养基，将稀释好的病毒液分别加入相应细胞孔，轻轻晃动混匀，37℃、5％CO2培养箱培养过夜。

6.8感染48h后，胰酶消化收集各细胞孔细胞，冷的PBS漂洗，收集细胞沉淀。

6.9收集细胞沉淀按照动物细胞基因组DNA抽提试剂盒步骤提取基因组DNA。

6.10使用5μL荧光表达病毒液感染细胞基因组DNA为标准品，按5倍梯度稀释6个梯度，并以未感染细胞基因组DNA补足稀释后模板量的变化。QPCR检测慢病毒LTR序列在基因组DNA上的整合拷贝数变化，计算目的病毒液滴度。

7.慢病毒感染及验证

外周血来源单核细胞诱导DC第三天使用MOI为5的病毒量感染收集的DC细胞。DC培养第五天收集DC细胞QPCR检测mRNA水平MG-7Ag模拟表位串联序列表达。

实施例2

一种外周血单核细胞来源树突状细胞体外快速培养方案。

1.外周血来源单核细胞诱导DC体外培养

将分选富集的外周血单核细胞以3-5×10⁶cells/mL细胞重悬于AIM-V培养基，铺布培养瓶中在37℃5％CO₂培养箱孵育1h后更换含2％自体血浆，1000U/mL rhIL-4、500U/mLrhGM-CSF的AIM-V分化诱导培养基。分化诱导48h后慢病毒感染诱导分化DC，分化诱导72h后，300g离心8min收集分化的DC，更换新鲜的12mL含5μg/mL poly(I∶C)的2％自体血浆，1000U/mL rhIL-4、500U/mL rhGM-CSF的AIM-V培养基，置于培养瓶，37℃ 5％CO₂培养箱孵育24h后获得成熟DC。

2.成熟DC表面细胞标志物和IL-12p70检测

步骤1所获得的MG-7Ag-DC可以直接用作DC疫苗，用流式细胞术检测步骤1获得DC细胞表面CD11c、CD80、CD86、CD83分子表达，ELISA检测培养上清中IL-12p70的分泌。

实施例3

一种活性成分为经MG-7Ag模拟表位串联序列修饰的树突状细胞疫苗DC-CTL免疫功能。

1.DC-CTL体外杀瘤试验

1.1使用Ficoll分离自体外周血PBMC，收集分化诱导培养第五天的DC，DC和PBMC以1∶10的比例在含10％自体血浆的AIM-V培养基中共培养。

1.2培养第四天加入500U/mL rhIL-2，继续培养10天。期间补充AIM-V培养基使细胞密度维持1-2×10⁶/mL，吹打离散大细胞团。

1.3DC-CTL共培养第十四天收集细胞、计数，96孔中加入50μL AIM-V培养基重悬的5×10⁴、2.5×10⁴、5×10³三个梯度效应细胞，相应反应孔加入50μL AIM-V培养基重悬的靶细胞MKN45和KATO-3为5×10³，设6个重复。

1.4在37℃ 5％CO₂培养箱孵育16h，每孔加入10μL的CCK8试剂，37℃ 5％CO₂培养箱反应1h。

1.5在酶标仪上450nm检测OD值，根据效应细胞、靶细胞和反应孔OD值计算杀瘤效率。

2.DC-CTL细胞表型和细胞因子分泌

2.1收获DC-CTL共培养第十四天细胞，流式细胞术检测CD3⁺CD8⁺T细胞比例，收集共培养上清液，ELISA检测上清液中IFNγ分泌水平。

Claims (9)

1.一种经修饰的树突状细胞，其特征在于，包含利用慢病毒载体感染树突状细胞将MG-7Ag抗原模拟表位串联序列整合至所述经修饰的树突状细胞中。

2.如权利要求1所述经修饰的树突状细胞，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体。

3.如权利要求1所述经修饰的树突状细胞，其特征在于，所述MG-7Ag抗原模拟表位串联序列为如图1所示的序列。

4.如权利要求3所述MG-7Ag抗原模拟表位串联序列，其特征在于，使用四个筛选的MG-7Ag抗原模拟表位序列经GGGS串联整合，四个抗原模拟表位序列依次为如图2、图3、图4、图5所示的序列。

5.一种外周血单核细胞来源树突状细胞体外快速培养，其特征在于，可以在培养第五天收获成熟的树突状细胞：

6.如权利要求5所述的单核细胞源树突状细胞快速培养，使用低浓度自体血浆(1-3％)，使用300-1000U/mL rhIL-4、300-1000U/mL rhGM-CSF分化诱导因子，使用KBM551、AIM-V、RPMI-1640任意一款培养基诱导单核细胞分化。

7.如权利要求5所述的单核细胞源树突状细胞快速培养，使用1-10μg/mL的poly(I：C)作为树突状细胞成熟诱导因子，poly(I：C)刺激16-48h收集成熟树突状细胞。

8.一种用于肿瘤的预防和主动免疫治疗的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述树突状细胞疫苗的活性成分为权利要求1-7任一所述经修饰的树突状细胞。

9.如权利要求8所述的用于肿瘤的预防和主动免疫治疗的树突状细胞疫苗，其特征在于，所述肿瘤为MG-7Ag抗原高表达肿瘤类型或个体，如胃癌。