CN1616109A - MG7－Ag模拟表位构建胃癌特异性多表位基因疫苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了以胃癌MG7－Ag模拟表位为基础构建的多表位DNA疫苗及其方法。本发明利用HSP70为载体，GGGS为间隔序列，构建含有4个串联不同的MG7－Ag模拟表位与HSP70的融合基因疫苗。经Western blotting鉴定表明融合基因在小鼠骨髓瘤SP2/0细胞中成功表达，并保持了亲本蛋白各自的活性。质粒免疫接种后，融合基因疫苗可诱导小鼠产生抗MG7－Ag特异性抗体以及一定数量的特异性CTL分泌IFNγ，多表位疫苗免疫组优于单表位疫苗组和其他对照组。肿瘤攻击后，疫苗免疫组小鼠成瘤体积明显小于对照组。这一基因疫苗在胃癌的免疫治疗研究，胃癌特异性疫苗的研制方面将具有巨大的潜在价值。

Description

MG7-Ag模拟表位构建胃癌特异性多表位基因疫苗的方法

                        技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及利用噬菌体随机肽库所筛选出的MG7-Ag模拟表位构建胃癌特异性多表位基因疫苗的方法。

                        背景技术

胃癌是严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤，目前胃癌的治疗手段主要有手术切除和化疗，但均不能有效解决肿瘤转移、复发等问题。免疫治疗是肿瘤治疗的新方法，对机体正常细胞的副作用小，主要包括用外源性抗体治疗、用细胞因子调节免疫以及主动免疫治疗，用疫苗对患者的免疫系统产生特异性刺激。目前尚无有效的疫苗用于胃癌的主动免疫治疗。胃癌MG7抗原是本研究所在八十年代发现的特异性较高的肿瘤标志物，抗原分析表明其抗原决定簇位于糖链上。由于糖抗原免疫原性弱，纯化、制备困难，且不易诱导T细胞免疫反应。用分子模拟多肽替代糖抗原进行免疫治疗是解决问题的方法之一，并在动物模型中取得很好的效果。申请人的研究所用噬菌体随机肽库技术筛选得到了MG7抗原的模拟肽表位，抗体竞争结合抑制实验证明模拟肽表位可以有效地模拟天然抗原，计算机辅助分析显示模拟表位可与HLA分子结合，这为胃癌疫苗的研究奠定了基础。

DNA疫苗制备便捷、能诱发针对结构复杂的天然蛋白的免疫反应，并可同时引起体液免疫反应和细胞免疫反应，不涉及活性载体(如病毒)和复杂的生化技术。由于这些特点，DNA疫苗一直引起研究者的兴趣。重组DNA技术已非常成熟，因此在质粒DNA疫苗的操作方面没有大的技术障碍。临床实验也证明人体对质粒耐受良好。但在人体肌注免疫时，应用需要1mg～5mg质粒才能引起免疫反应，给商品化生产及应用带来困难。因此，如何增强DNA疫苗的效率备受关注。

1.佐剂的应用

细胞因子作为免疫佐剂增强DNA疫苗的效果，近年已有广泛研究。巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是应用最广的细胞因子之一，其他的细胞因子和趋化因子还有INF-γ，IL-2，IL-4，IL-12，IL-18，MIG，IP-10，RANTES，MCP-3等。应用此类佐剂时，可以用重组的细胞因子蛋白或与DNA疫苗进行共转染。某些趋化因子除了有增强免疫反应的作用外，还具有抑制血管生成的作用，如MIG、IP-10和RANTES，在体内还可通过抑制肿瘤血管生成而起一定的抑瘤作用。佐剂是细胞因子除了共转染辅助分子CD154和CD80也可以增强疫苗的效果。

热休克蛋白(HSP)与肿瘤免疫的关系是近年研究热点之一。HSP可通过多种途径增强肿瘤特异性免疫：HSP具有蛋白伴侣功能，参与蛋白质的装配转运和降解；APC细胞表面存在HSP受体，纳摩水平的HSP肽复合物足以诱导很强的免疫反应，免疫后小鼠的CD8+T细胞能特异地识别肿瘤细胞(Proc Natl AcadSci USA 1995；92：11993-7)，从而降低免疫剂量；HSP本身具有免疫刺激剂的作用，可增加多种细胞因子的分泌(Fundamental Immunology，4th 1999.1237-1270)。

HSP肽复合物肿瘤疫苗在动物实验中已取得良好疗效，例如，从gp70-抗原阳性的B16黑色素瘤中提取的HSP70可保护小鼠免受gp70-抗原阳性的CT26结肠癌细胞的攻击(Biochem.Soc.Trans.25 1997，p.268S)。又如，从甲基胆蒽诱导的肉瘤MC57S中纯化的HSP70可诱导对肿瘤的免疫反应，现在HSP肽复合物的免疫治疗已进入II期临床试验，I期临床试验结果表明HSP肽复合物可使50％病人CD8+T细胞增加，部分病人NK细胞亦有增加趋势(Cancer Res.591999，2718-2723)。HSP融合蛋白也能诱导特异的抗融和蛋白的CTL反应。例如，用HSP70与人乳头瘤病毒16型的E7抗原融合后的DNA疫苗，E7特异性CD8+T细胞数目增加至少30倍，其免疫效果和抗瘤性明显增强且不依赖于Th细胞。

2.表位组建方式加强免疫效果的策略。

随着多种B、T、Th细胞表位在体外研究中的确定，产生了以表位为基础的DNA疫苗。这类疫苗对靶抗原的选择更精确，使免疫效果更有针对性，但抗原表位的结构小型，过于简单，可能造成抗原性减弱。为了克服这类问题，除了应用包括以上所述的各类佐剂对疫苗加以修饰外，多表位联合组建基因疫苗是近几年来研究的一个重要方向。串联后抗原的加长和复杂结构有利于其稳定性(Mol Immunol 1999；36，103-12)。还有研究表明，单一表位以同源串联可诱导增强Th1反应，从而促进细胞介导的免疫反应(Infection andImmunity，July 2000，3867-3872)。

研究认为，多个表位串联后，可诱导机体对各个表位产生特异性免疫反应。Ling-ling等人构建了针对不同病原体的多表位联合疫苗(包括5种病毒和1种细菌)，动物实验结果表明，机体产生了针对各个表位的免疫反应。在MHC多态性使疫苗的应用范围缩小，因为不同人群的MHC分子可能识别不同的抗原表位。多表位联合疫苗可帮助克服这一问题。此外，在病毒变异的情况下，多表位联合疫苗可使疫苗更有效。例如，Roshni等人构建了针对人类T细胞淋巴病毒1型的多价CTL表位串联的疫苗，结果证明其效果优于单个表位疫苗的免疫效果。在DNA疫苗中联合应用CTL表位、B细胞表位和Th细胞表位可增强免疫效能。因为可以诱导机体同时产生CTL反应和体液免疫反应，而Th细胞表位可激活Th细胞分泌细胞因子，进而更有效的活化CTL细胞和B细胞、提高APC呈递抗原的能力。在研制肿瘤DNA疫苗时，多表位联合疫苗允许机体对多个关键的肿瘤相关抗原产生特异性免疫反应，从而增进其抑制肿瘤的效能。例如，由于人乳头瘤病毒(HPV)的E6和E7抗原对于宫颈癌的发生及其恶性表型的保持都必不可少，Markwin等人研制了联合人乳头瘤病毒HPV的E6和E7抗原的基因疫苗，并包括CTL、Th和B细胞表位。疫苗使所有受试小鼠在肿瘤攻击实验中受到保护，并在融合泛素后效果加强(J.Immunol，2001，166：5366-5373)。

在构建多表位基因疫苗时，无论是单一表位的同源串联还是异源串联，相邻的表位或相邻的嵌合佐剂都可能对疫苗的免疫效果产生影响。其他影响因素还包括表位的插入顺序、插入位点以及表位重复次数等。Mireille等人在构建乳腺癌亚单位疫苗时，发现将融合的源于破伤风毒素的T细胞表位在重复4次后，疫苗诱发的CTL反应大大提高。

各个表位的侧翼序列对表位的抗原性也有重要影响，关系到细胞内蛋白酶对抗原肽的处理、表位的释放、抗原肽与MHC分子的结合、表位的呈递等。此外，表位之间添加间隔序列(linker/spacer)对于增强抗原呈递、避免各个抗原之间可能造成的干扰有重要作用(J Gene Virol，1999，80：2343)。有研究表明，对于同样序列的多表位联合疫苗，添加了spacer的疫苗比没有spacer的疫苗诱导的免疫效果高出50％(J.Immunol，2001，166：5366-5373)。Brian等人在研制针对HIV的多表位联合疫苗时发现，GPGPG序列作为spacer可以避免4个Th细胞表位之间的相互干扰，进一步提高疫苗的免疫效果(J.Immunol，2002，168：5499-5506)。Brian D.Livingston等研究认为K、R、Q、N、G、S、A、T可在单个插入后诱导较好的CTL反应。Shintaro Yagi等认为，在表位间插入L、V、等疏水氨基酸或多聚甘氨酸可避免多表位联合所造成的非特异性结合。

GGGS是噬菌体呈现肽与噬菌体小膜蛋白pIII之间的连接短臂，用以避免呈现肽与噬菌体自身蛋白互干扰。根据申请人的实验室的研究，利用GGGS作为spacer可起到避免两个表位之间相互干扰，保持亲本蛋白各自活性的作用，也避免了改变临近氨基酸以尽量保持筛选出的模拟表位的性质。

还有研究表明，单一表位以同源串联可诱导增强Th1反应，而Th1型的CD4+T细胞主要分泌IL-2，IL-12和IFNγ，诱导细胞免疫。申请人采用HSP70基因为疫苗佐剂，与表位融合可增强疫苗的免疫效能；并利用GGGS作为spacer(间隔序列)，避免抗原表位与MHC分子非特异结合，促进抗原呈递的作用在利用其作为并利于蛋白酶水解释放表位的要求。

                        发明内容

本发明的目的在于提供一种利用MG7-Ag模拟表位构建胃癌特异性多表位基因疫苗的方法，并且获得具有抗瘤效应的基因疫苗，其效果优于单表位的基因疫苗。

实现上述发明目的的技术方案是：采用单一表位以同源串联形式，以HSP70为载体，GGGS为间隔序列，连续四次PCR，并以前一次PCR的产物作为下一次PCR的模版，将四个不同的模拟表位以及间隔序列连接起来；构建含有4个串联不同的MG7-Ag模拟表位与HSP70的融合基因疫苗，其串联表位的具体核苷酸以及氨基酸序列参见核苷酸和氨基酸序列。

其制备方法是首先构建多个MG7-Ag模拟表位与HSP70融合的基因疫苗，并利用Western blotting鉴定表明重组蛋白的表达保持了亲本蛋白各自的活性，采用肌肉注射和静脉注射两种方式免疫接种BALB/c小鼠，每隔2周加强免疫一次，共免疫3次。分别于初次免疫后2、4、6周收集血清，进行细胞ELISA。第6周时取小鼠脾细胞，用酶联免疫斑点法检测分泌IFNγ的特异性CTL。第6周时用表达有MG7-Ag的小鼠艾氏腹水瘤细胞对静脉接种的各组小鼠进行肿瘤攻击实验，25天后观察小鼠成瘤情况。

本发明利用分子生物学技术，采用单一表位以同源串联形式，将4个胃癌模拟表位的基因融合，多表位疫苗在串联多个表位后，抗原的加长和复杂结构有利于其稳定性，更利于被APC识别并加工、呈递；其次，由于各个MG7模拟抗原对原始碳水化合物表位的模拟能力不尽相同，多表位串联疫苗中联合使用多个模拟抗原，相对于单表位疫苗刺激机体免疫反应的能力可更完善。

本发明的方法构建的MG7-Ag模拟表位为基础的多表位基因疫苗，将会在临床的肿瘤免疫治疗，胃癌特异性疫苗的研制方面打下良好的基础。

                        附图说明

图1是4个串联的MG7-Ag模拟表位以及spacer的核苷酸和氨基酸序列。

以下结合附图对本发明作进一步的详细说明。

                      具体实施方式

胃癌特异性疫苗是胃癌免疫治疗的重要方向之一。本发明的方法是采用单一表位以同源串联形式，以HSP70为载体，GGGS为间隔序列，连续四次PCR，并以前一次PCR的产物作为下一次PCR的模版，将四个不同的模拟表位以及间隔序列连接起来；构建含有4个串联不同的MG7-Ag模拟表位与HSP70的融合基因疫苗。并利用细胞酶联免疫检测、酶联免疫斑点法、肿瘤攻击实验等检测了多表位基因疫苗的效能，证明该疫苗具有较好体内抗瘤效应。

1.技术方案及其路线

1.1以MG7-Ag模拟表位为基础的多表位基因疫苗的构建：

1.1.1串联4个表位：

以pcDNA3.1(+)质粒的209-785bp序列为模版，用primer5.0软件设计引物，通过多次PCR将多个胃癌MG7-Ag模拟表位融合基因与一段无关载体基因连接。小量胶回收试剂盒纯化回收第四次PCR产物，电泳定量，与PMD18-T载体16℃连接过夜。连接产物转化E coli DH5α感受态菌，经蓝白筛选法筛选，随机挑取12个白色菌落，质粒小量提取试剂盒提取质粒。EcoR I单酶切，1％琼脂糖凝胶电泳看有无约900bp片段释放，鉴定后的重组质粒测序。

1.1.2多表位串联真核表达载体的构建：

小量提取试剂盒测序正确的阳性克隆质粒，BamH I和EcoR I双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳，小量胶回收试剂盒纯化回收约900bp片段。BamH I和EcoRI双酶切pcDNA3.1B，0.7％琼脂糖凝胶电泳，回收约5.3kb片段。大小片段摩尔比1∶3，T4连接酶连接，转化E coli DH5α感受态细菌，氨苄抗性筛选，随机挑取阳性菌落，提取质粒，BamH I和EcoR I双酶切鉴定阳性克隆。HindIII单酶切，观察有无约660bp的无关载体片段释放。回收大片段，T4连接酶连接，转化E coli DH5α感受态细菌，氨苄抗性筛选，随机挑取阳性菌落，提取质粒，测序。

1.1.3 HSP70为载体蛋白的多表位串联DNA疫苗的构建：

含有人HSP70编码基因的质粒PC/P6由申请人的宁小萱博士赠与，其制备方法如下：收集人血液，利用试剂盒提取人基因组DNA，用primier 5.0软件设计针对人HSP70编码区的引物，并在引物两端添加酶切位点EcoR I和Xho I。以基因组DNA为模版，利用上述引物进行PCR反应。将所得PCR产物装入商品化载体中测序，如测序结果正确，即得到含有人HSP70编码基因的质粒PC/P6。

EcoR I、Xho I双酶切PC/P6，回收约2kb的片段。EcoR I、Xho I双酶切重组多表位串联真核表达载体，回收大片段。大小片段摩尔比1∶3，T4连接酶连接，转化E coli DH5α感受态细菌，氨苄抗性筛选，随机挑取阳性菌落，提取质粒，HindIII和Xho I双酶切鉴定。

1.1.4真核表达载体的转染及Western blot鉴定：

将重组质粒pcDNA3.1/4MG-HSP，pcDNA3.1/MG-HSP转化的E.coli DH5α菌株及以空载体pcDNA3.1转化的菌株，在LB培养基中于37℃培养18h，按照质粒提取说明分别提取pcDNA3.1/4MG-HSP，pcDNA3.1/MG-HSP和pcDNA3.1的DNA，经紫外分光光度仪测定OD260定量。按照LipofactaminTM Reagent脂质体转染说明转染小鼠SP2/0细胞。转染前一天，将细胞接种于6孔板，约2×10⁵/孔，第二天细胞达到80％融合，DNA定量后取各0.50ug，LipofactaminTM10ul，加无血清培养基800ul。转染5小时后加入含胎牛血清的1640培养液至正常水平。72小时后收集转染的细胞，含蛋白酶抑制剂的三去污裂解，细胞总蛋白质用Bradford方法蛋白定量；30μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，体积分数为10％的凝胶)，半干法将电泳产物转至硝酸纤维膜(0.22μm孔径)；丽春红染色，剪下相应蛋白电泳条带，10％脱脂奶粉室温封闭2h，加入鼠抗人HSP一抗或鼠抗人MG-7单抗，4℃过夜，TBS缓冲液洗膜三次，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育1h，洗膜三次，ECL显影。

1.2基因疫苗免疫小鼠后的效果观察

1.2.1免疫小鼠：

大量提取质粒pcDNA3.1(+)/4MG-HSP70、pcDNA3.1(+)/MG-HSP70、pcDNA3.1(+)/HSP70及空载体pcDNA3.1(+)，PEG8000纯化，备用。50只BALB/c小鼠，，雌性，4周龄，体重15-20g，随机分为5组，每组10只，采用肌肉注射，具体分组如下

第1组：pcDNA3.1B/4MG-HSP70(多表位串联疫苗组)

第2组：pcDNA3.1(+)/GC-HSP70(单表位疫苗免疫组)

第3组：pcDNA3.1(+)/HSP70(HSP对照组)

第4组：pcDNA3.1(+)(空载体对照组组)

第5组：生理盐水组

具体方法为：质粒接种前24h用0.25％布比卡因100μl预处理，具体操作如下：75％酒精消毒接种部位，灭菌的100μl微量注射器以45°进针，刺入小鼠股四头肌，进针后一边缓慢注射药物一边不断小角度改变针头方向，使经处理的肌纤维面积尽可能增大，损伤尽可能小。布比卡因处理后24h，在同一预处理部位接种质粒，质粒用量为100μg/只，每隔2周加强免疫一次，共免疫3次，每次接种前24h均用0.25％布比卡因预处理。

1.2.2体液免疫反应的检测：

分别于初次免疫后2、4、6周收集免疫血清，进行体液免疫检测。免疫血清的收集方法如下：从小鼠尾静脉取血，收集于0.5ml离心管中，静置5min后，3000rpm离心3min，收集上层血清，-20℃保存备用。细胞ELISA检测时，收集处于对数生长期的人胃癌KATOIII细胞，置于50ml离心管，1000rpm离心5min，PBS(PH 7.4)洗涤3次。显微镜下进行细胞计数，调整细胞浓度，铺于96孔细胞培养板(每孔细胞密度为3×105)，1500rpm离心15min，弃上清，充分干燥后，每孔加入50μl PBS配制的0.25％戊二醛中固定15分钟，弃固定液，PBS洗涤5min×3次，用PBS溶液配制的10％脱脂奶粉封闭过夜，洗涤后每孔加入1∶200稀释的小鼠免疫血清50μl，以抗MG7-Ag抗体为阳性对照，37℃孵育1h，PBST溶液洗涤5min×4次，每孔加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶5000稀释)50μl，37℃孵育1h，PBST震荡洗涤5min×3次，然后用TMB显色10min，终止液终止反应，立即在酶联免疫检测仪上测定A450波长下的OD值。实验结果进行统计学分析。

1.2.3细胞免疫反应的检测：

1.2.3.1收集免疫后小鼠脾淋巴细胞：

初次免疫后第6周将免疫小鼠摘眼球放血处死，75％酒精浸泡5min，右侧卧位固定于12cm灭菌平皿上置超净台内，消毒眼科剪剪开皮肤，暴露腹膜，换另一眼科剪剪开腹膜，摘取小鼠脾脏，去除脂肪组织和结缔组织，剪碎，用无血清培养基冲洗后置于200目不锈钢网上，用无菌注射器针芯轻轻研磨脾脏，并用无血清培养基冲洗。收集脾细胞悬液，Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离小鼠的淋巴细胞。具体操作为，在离心管中加入适量淋巴细胞分离液，将等体积脾细胞悬液用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，保持清楚界面，离心2000rmp×20分钟。离心后管内分为三层，在上、中层界面处有一白色云雾层狭窄带，用弯头滴管插到云雾层，仔细吸取细胞。细胞用PBS洗三遍，去除Ficoll，再用含20％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞沉淀，台盼蓝染色排除法计数活细胞数目。将细胞移入96孔细胞培养板，调整细胞密度为1×10⁶/孔，加入含20％胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养。

移入含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基继续培养，并加入人工合成MG7-Ag模拟表位多肽至终浓度为50μg/ml。

1.2.3.2 ELISPOT检测

在室温下，PVDF板每孔用70％乙醇100μl孵育10分钟，倒掉乙醇，每孔用100μl PBS洗3次。捕获抗体(IFNγ特异性单抗)1∶100稀释于PBS，每孔加入稀释后抗体100μl，于4℃孵育过夜。孵育后用PBS洗一次，去除未结合的抗体。每孔加入2％牛奶100μl，室温孵育2小时。倒去牛奶后用PBS洗板一次。每孔加入体外预刺激后的脾细胞100μl(细胞数5×104)，于37℃CO2孵箱孵育15小时～20小时。倒去细胞悬液，每孔加入PBST100μl，4℃放置10分钟，再用PBST洗板3次。检测抗体(生物素化二抗)1∶100稀释于含1％BSA的PBS，每孔加入稀释后抗体100μl，于37℃CO2孵箱孵育1～1.5小时。倒去液体，PBST洗板3次。亲和素—碱性磷酸酶复合物1∶100稀释于含有1％BSA的PBS中，每孔加入100μl，于37℃CO2孵箱孵育1小时。倒去液体，PBST洗板3次，在吸水纸上轻拍板子，去除残留的液体。每孔加入BCIP/NBT缓冲液100μl，反应在室温下避光进行5分钟～20分钟，期间注意观察斑点的形成。用无菌水洗板3次，晾干后计数出现的斑点，并做统计学分析。

1.3肿瘤攻击实验

免疫6周后，用艾氏腹水瘤细胞对采用静脉免疫的各组小鼠(不包括生理盐水组)进行攻击实验。收集艾氏腹水瘤细胞，以1×10⁷/100μl/只接种于各组小鼠皮下，每组接种4只。肿瘤攻击25天后，颈椎脱臼法处死小鼠，取出瘤体，称重，比较各组小鼠成瘤情况。

攻击实验证实，该疫苗能诱导小鼠产生抗MG7-Ag特异性抗体以及一定数量的特异性CTL分泌IFNγ，肿瘤攻击后，疫苗免疫组小鼠成瘤体积明显小于对照组，多表位疫苗免疫组优于单表位疫苗组和其他对照组。

2.技术效果

本发明的方法采用筛选出的MG7-Ag模拟表位，用GGGS为spacer，以HSP70为疫苗佐剂，构建了胃癌特异性的多表位基因疫苗。该疫苗是一种含有串联的胃癌特异性模拟表位的DNA疫苗，经细胞酶联免疫检测，酶联免疫斑点法检测，以及肿瘤攻击实验证实，该疫苗能诱导小鼠产生抗MG7-Ag特异性抗体以及一定数量的特异性CTL分泌IFNγ，肿瘤攻击后，疫苗免疫组小鼠成瘤体积明显小于对照组，多表位疫苗免疫组优于单表位疫苗组和其他对照组。说明该疫苗能对动物产生针对胃癌的特异性保护作用，且多表位串联疫苗的效果优于单表位疫苗。该疫苗在胃癌的免疫治疗研究，胃癌特异性疫苗的研制方面将具有巨大的潜在价值。

根据申请人进行的资料检索，本发明的方法采用筛选的MG7-Ag模拟表位，以GGGS为spacer构建4个胃癌模拟表位串联的基因疫苗，目前尚无文献报道，因此本发明具有惟一性和自主的知识产权。

3.最佳实施方式

研制胃癌特异性多表位蛋白疫苗

将发明中构建的多表位基因疫苗的序列插入原核表达载体，进行原核表达，并利用His标签进行纯化。将纯化得到的蛋白疫苗免疫Balb/c小鼠，通过检测免疫后小鼠的体液免疫反应和细胞免疫反应，评价多表位蛋白疫苗的免疫效能。同时用带有MG7-Ag的肿瘤细胞制备荷瘤小鼠，用纯化后的蛋白注射小鼠后，观察肿瘤生长及小鼠一般状态，评价多表位蛋白疫苗对肿瘤的治疗效果。

              核苷酸和氨基酸序列

K   P   H   V   H   T   K   G   G   G   S

AAA CCA CAT CTA CAT ACA AAA GGA GGA GGA AGT

K   P   H   L   H   F   H   G   G   G   S

AAA CCA CAT CTT CAT TTT CAT GGA GGA GGA AGT

K   P   H   S   H   L   H   G   G   G   S

AAA CCA CAT AGT CAT CTT CAT GGA GGA GGA AGT

S   W   A   P   V   Y   A   R   A   N

AGT TGG GCT CCA GTT TAT GCT AGA GCT AAT

Claims (3)

1.一种MG7-Ag模拟表位构建胃癌特异性多表位基因疫苗的方法，其特征在于，采用单一表位以同源串联形式，以HSP70为载体，GGGS为间隔序列，连续四次PCR，并以前一次PCR的产物作为下一次PCR的模版，将四个不同的模拟表位以及间隔序列连接起来；构建含有4个串联不同的MG7-Ag模拟表位与HSP70的融合基因疫苗，其串联表位的具体核苷酸以及氨基酸序列如下：

K    P    H    V    H    T    K    G    G    G    S

AAA  CCA  CAT  CTA  CAT  ACA  AAA  GGA  GGA  GGA  AGT

K    P    H    L    H    F    H    G    G    G    S

AAA  CCA  CAT  CTT  CAT  TTT  CAT  GGA  GGA  GGA  AGT

K    P    H    S    H    L    H    G    G    G    S

AAA  CCA  CAT  AGT  CAT  CTT  CAT  GGA  GGA  GGA  AGT

S    W    A    P    V    Y    A    R    A    N

AGT  TGG  GCT  CCA  GTT  TAT  GCT  AGA  GCT  AAT。

2.如权利要求1所述的MG7-Ag模拟表位构建胃癌特异性多表位基因疫苗的方法，其特征在于，其构建含有4个串联不同的MG7-Ag模拟表位与HSP70的融合基因疫苗包括以下步骤：

1)4个串联不同的MG7-Ag模拟表位

以pcDNA3.1(+)质粒的209-785bp序列为模版，用primer5.0软件设计引物，通过多次PCR将多个胃癌MG7-Ag模拟表位融合基因与一段无关载体基因连接；小量胶回收试剂盒纯化回收第四次PCR产物，电泳定量，与PMD18-T载体16℃连接过夜，连接产物转化E co1i DH5α感受态菌，经蓝白筛选法筛选，随机挑取12个白色菌落，质粒小量提取试剂盒提取质粒；EcoR I单酶切，1％琼脂糖凝胶电泳看有无约900bp片段释放，鉴定后的重组质粒测序；

2)多表位串联真核表达载体的构建

小量提取试剂盒测序正确的阳性克隆质粒，BamH I和EcoR I双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳，小量胶回收试剂盒纯化回收约900bp片段；BamH I和EcoRI双酶切pcDNA3.1B，0.7％琼脂糖凝胶电泳，回收约5.3kb片段；大小片段摩尔比1∶3，T4连接酶连接，转化E coli DH5α感受态细菌，氨苄抗性筛选，随机挑取阳性菌落，提取质粒，BamH I和EcoR I双酶切鉴定阳性克隆；HindIII单酶切，观察有无约660bp的无关载体片段释放；回收大片段，T4连接酶连接，转化E coli DH5α感受态细菌，氨苄抗性筛选，随机挑取阳性菌落，提取质粒，测序；

3)HSP70为载体蛋白的多表位串联DNA疫苗的构建

EcoR I、Xho I双酶切HSP70的质粒PC/P6，回收约2kb的片段，EcoR I、Xho I双酶切重组多表位串联真核表达载体，回收大片段；大小片段摩尔比1∶3，T4连接酶连接，转化E oli DH5α感受态细菌，氨苄抗性筛选，随机挑取阳性菌落，提取质粒，HindIII和Xho I双酶切鉴定；

4)真核表达载体的转染及Western blot鉴定

将重组质粒pcDNA3.1/4MG-HSP，pcDNA3.1/MG-HSP转化的E.coli DH5α菌株及以空载体pcDNA3.1转化的菌株，在LB培养基中于37℃培养18h，按照质粒提取说明分别提取pcDNA3.1/4MG-HSP，pcDNA3.1/MG-HSP和pcDNA3.1的DNA，经紫外分光光度仪测定OD260定量；按照LipofactaminTM Reagent脂质体转染说明转染小鼠SP2/0细胞；转染前一天，将细胞接种于6孔板，约2×10⁵/孔，第二天细胞达到80％融合，DNA定量后取各0.50ug，LipofactaminTM10ul，加无血清培养基800ul，转染5小时后加入含胎牛血清的1640培养液至正常水平；72小时后收集转染的细胞，含蛋白酶抑制剂的三去污裂解，细胞总蛋白质用Bradford方法蛋白定量；30μg蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳，半于法将电泳产物转至0.22μm孔径的硝酸纤维膜；丽春红染色，剪下相应蛋白电泳条带，10％脱脂奶粉室温封闭2h，加入鼠抗人HSP-抗或鼠抗人MG-7单抗，4℃过夜，TBS缓冲液洗膜三次，加入HRP标记的羊抗鼠二抗，37℃孵育1h，洗膜三次，ECL显影；经此鉴定后即可得到胃癌特异性多表位基因疫苗。

3.如权利要求2所述MG7-Ag模拟表位构建胃癌特异性多表位基因疫苗构建方法，其特征在于，所述质粒PC/P6的制备方法是：收集人血液，利用试剂盒提取人基因组DNA，用primier 5.0软件设计针对人HSP70编码区的引物，并在引物两端添加酶切位点EcoR I和Xho I；以基因组DNA为模版，利用上述引物进行PCR反应，将所得PCR产物装入商品化载体中测序，测序结果正确，即得到含有人HSP70编码基因的质粒PC/P6。