CN106397602B - 一种分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于预防鸡马立克氏病的蛋白工程疫苗的制备方法及其应用。所述疫苗含有鸡马立克氏病病毒MDV主要结构蛋白糖蛋白B的亚单位、杀伤性T细胞表位、多个B细胞抗原表位以及鸡γ干扰素和纯化标签。所述疫苗生产制备工艺稳定，经过靶动物SPF鸡动物实验表明本发明所述的蛋白工程疫苗使用安全，能有效预防鸡马立克氏病病毒的感染。

Description

一种分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗

技术领域

本发明属于生物技术基因工程领域，主要涉及一种与分子佐剂共表达的用于预防鸡马立克氏病的融合蛋白。具体地，利用基因重组技术，将主要结构蛋白gB蛋白亚单位，杀伤性T细胞表位及多个B细胞抗原表位与分子佐剂多肽(IFN-γ)串联，并克隆入载体，转化宿主菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺得到共表达的免疫效果增强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗以及该疫苗在预防鸡马立克氏病中的应用。

背景技术

马立克病(Marek′s Disease，MD)是一种常见的鸡淋巴组织增生性疾病，具有高度传染性，感染鸡产生肿瘤或死亡，病理上以外周神经、性腺、虹膜、各种脏器和皮肤组织发生单核细胞浸润为主要特征。是危害养鸡业最为严重的传染病之一，给养禽业造成巨大的经济损失。本病可通过与病鸡或带毒鸡直接或间接接触经气源传播，在羽囊上皮细胞中复制的传染性病毒，随羽毛、皮屑排出，使污染鸡舍的灰尘成年累月保持传染性。MD存在于世界所有养禽国家和地区，其危害随着养鸡业的集约化而增大，鸡群中一旦发生此病，即可引起大批死亡，受害鸡群的损失以1％-30％不等，个别鸡群高达50％以上，尤其是出雏和育雏室的早期感染可导致很高的发病率和死亡率，是我国三大重点控制的疫病之一。

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus，MDV)属于α疱疹病毒亚科马立克病毒属(Mardivirus)禽疱疹病毒2型(Gallid herpesvirus)，是一种细胞结合型病毒。MDV分3个血清型：I型为致瘤的MDV；II型为不致瘤的MDV；III型为HVT。MDV基因组编码许多蛋白，作为病毒粒子的成分，这些结构蛋白根据它们在病毒粒子中的位置分为三组：衣壳蛋白、衣被蛋白和囊膜蛋白。其中糖蛋白B基因gB在疱疹病毒中是高度保守的，由UL27编码，长度为805aa，分子量理论值为95.5KD。MDV gB胞外区(22aa-682aa)含有抗原表位、穿膜、入胞及中和作用的区域，gB蛋白是一组分子量为gp100、gp60、gp49构成的糖蛋白复合物，是一种非分泌性的抗原，抗原位于感染细胞的膜表面和胞浆中，以及病毒颗粒的被膜上，以多种形式存在，它既可以引起体液免疫又可以引起细胞免疫，因而在MD基因工程疫苗研制中成为十分重要的保护性抗原。

疫苗接种是预防马立克氏病的关键，目前用于制造疫苗的病毒有三种：人工致弱的I型MDV(如CVI988)、自然不致瘤的II型MDV(如SB1、Z4)和III型MDV(HVT)(如FC126)。HVT属无毒力MDV，其最大的优势在于通过对培养细胞的超声破碎，可得到大量游离病毒，使用和运输比较方便，造价便宜，可以提供较好的免疫保护，但比某些其他血清型疫苗株要差一些。80年代初，美国开始将血清II型疫苗株(SB-1)与血清III型疫苗株(HVT)联合成二价苗使用，发现二价苗可比单价苗提供更好的免疫保护，随后又出现了三种血清型两两组合的各种二价苗及三价苗，如301B/1+HVT、814+HVT、Md11/75+SB-1+HVT等。多价苗是细胞结合型苗，病毒在细胞内能有效避免母源抗体的干扰，同时产生的免疫力较单价苗早，可以抵抗超强毒株的攻击，然而多价苗也存在一些隐患，血清II型病毒会明显增加某些品系鸡的淋巴性白血病的发病率和死亡率，且细胞结合型苗需在液氮条件下保存，给产品的保存、运输及使用带来诸多不便。随着强毒株、超强毒株的不断发现，现有传统疫苗已不能发挥有效的保护作用，迫切需要研发新型安全有效，便于储存及运输的疫苗。

研究表明，IFN-γ具有很强的免疫调节活性，其中最主要的是上调MHC分子的表达、促进抗原提呈(Gerotto M et a1.，2000)。此外，IFN-γ在机体肿瘤的发生、移植排斥和免疫检测过程中发挥重要的作用，能够抑制肿瘤病毒的增殖、促进肿瘤细胞的凋亡和激活先天免疫及特异性免疫应答，从而发挥抗肿瘤的作用。基于IFN-γ在免疫调节中的重要作用，使其作为疫苗佐剂成为可能，IFN-γ不仅能特异性地增强疫苗的免疫效果，而且能增强机体的抗感染能力，其主要表现在：诱导机体产生均一的免疫反应、延长抗体持续时间、使低浓度抗原被充分利用和降低机体的感染率。本发明提供了一种与分子佐剂共表达的用于免疫的融合蛋白，能有效预防鸡马立克氏病病毒的感染。

发明内容

本发明通过对MDV不同蛋白特性和功能的分析，选择糖蛋白B的亚单位，杀伤性T细胞表位及多个B细胞抗原表位作为疫苗框架结构，通过柔性Linker连接后与分子佐剂鸡γ干扰素串联，克隆入pRSETA载体后转化大肠杆菌，经过发酵、纯化、乳化等工艺，获得具有理想免疫原性的鸡马立克氏病蛋白工程疫苗。利用本发明制备的疫苗可以有效预防鸡马立克氏病病毒的感染。

在第一个方面，本发明提供了一种用于制备蛋白工程疫苗的融合蛋白，其含有鸡马立克氏病病毒主要结构蛋白糖蛋白B亚单位，杀伤性T细胞表位，B细胞抗原表位，分子佐剂鸡γ干扰素及纯化标签。所述鸡马立克氏病病毒糖蛋白B的亚单位是指具有免疫原性的鸡马立克氏病病毒糖蛋白B亚单位中主要多肽或其具有相同免疫原性的功能等价物，优选是SEQ ID No.4。所述的杀伤性T细胞表位、B细胞抗原表位指的是主要结构蛋白中的一部分多台或其具有相同免疫原性功能的等价物，优选是SEQ ID No.6、8、10、12。所述分子佐剂鸡γ干扰素是指鸡γ干扰素或其具有相同佐剂功能的功能等价物，优选是SEQ ID No.14。所述的融合蛋白或多肽或药学上可接受的盐以及表达抗原表位所需要的载体。载体也可以包括单独编码各抗原表位的序列，串联可以通过遗传工程方法进行。所述疫苗也包括非免疫活性物质，即为各多肽的连接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐剂活性，主要有纯化标签、接头肽、化学修饰部分、N端信号肽和C端多聚腺苷酸等。所述药学上可接受的盐是指无毒性、刺激和变态反应，适用于人或动物组织的盐。非活性物质和药学上可接受的盐为本领域技术人员所熟知。

在第二个方面，本发明提供了一种核苷酸分子，其编码本发明第一个方面所述的分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗多肽。本发明中核苷酸可以是RNA形式也可以是DNA形式，通过人工合成方式合成抗原表位串联序列，然后通过基因工程操作连接后克隆入表达载体，转化入大肠杆菌，经过筛选、发酵、纯化等工艺获得分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗多肽。在本发明中可以对该核苷酸进行常规的分子生物学操作，如：PCR、限制性内切酶酶切、连接等。优选本发明中的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

在第三个方面，本发明提供了一种载体，其含有本发明第二方面所述的核苷酸分子。本文中的术语“重组表达载体”、“表达载体”，有时仅称为“载体”，在此可以交互替换使用，是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其他各种病毒载体。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。总之，只要能在宿主细胞中稳定复制，任何质粒和载体都可以使用。优选表达载体包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标志，如His、Leu、Trp等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。在一优选实施方式中，所述表达载体为大肠杆菌表达载体，本领域技术人员可利用DNA重组技术等一系列技术，构建含本发明所述编码融合蛋白的DNA序列、合适的转录和翻译调控序列、启动子及选择性标记基因等特定元件的表达载体。上述载体可用来转化、转染合适的宿主细胞，以获得所需要的融合蛋白。

在第四个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其特征在于已用本发明第三方面所述的核酸分子转化或转染。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。

在第五个方面，本发明提供了制备本发明第一个方面所述融合蛋白的方法，其包括以下步骤：用本发明第四个方面的宿主细胞表达本发明第一个方面的融合蛋白，并分离所述的融合蛋白。获得的工程细胞可以通过常规方法培养、诱导来表达所需的融合蛋白，包括发酵过程和纯化工艺。上述表达的蛋白可在细胞内、细胞膜上或分泌到细胞周质、细胞外。根据需要，可利用融合蛋白的物理的、化学的以及其他生物学特性，进行分离纯化。方法包括但不限于：裂菌(超声波裂菌、渗透压裂菌)，离心，盐析，分子筛色谱，离子交换色谱，吸附色谱(亲和层析、金属螯合层析)，反向色谱，高效液相色谱，毛细管电泳，制备性等点聚焦以及常规的变性、复性处理等，这些方法均是本领域技术人员所熟知的。

在第六个方面，本发明提供了一种用于免疫的蛋白工程疫苗，其包括本发明第一个方面所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体，能预防鸡马立克氏病病毒的感染。对于本领域普通技术人员来说，已经有很多公知的方法能将蛋白质或多肽活性成分与药学上可接受的载体制备成药物组合物。本文中使用的药学上可接受的载体指无毒的填充剂、稀释剂、佐剂或其他制剂辅料。根据本领域的公知技术，可以根据治疗目的、给药途径的需要将药物组合物制成各种剂型，优选该组合物为单位剂量形式，如片剂、胶囊、粉剂、乳液剂、注射剂、喷雾剂型或作为饲料添加剂的剂型。优选该药物组合物为注射剂型或喷雾剂型，这些组合物包括不同缓冲液内容(如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液)、相应的离子强度和pH值，以及其他物质(如聚乳酸、甘露醇等)。也优选该药物组合物为疫苗组合物，优选进一步含有佐剂，如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、CpG序列等。

在第七个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述的融合蛋白在制备预防鸡马立克氏病的药物中的应用。在第八个方面，本发明提供了本发明第五个方面所述的药物组合物在制备预防鸡马立克氏病的药物中的应用。在本发明的一个优选实施方式中，通过对试验动物以特定剂量肌肉注射给药，有效地保护了试验动物。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1为含有融合蛋白编码基因的表达载体pRSETA-MDV-IFN-γ的示意图。

图2显示了重组表达载体pRSETA-MDV-IFN-γ用EcoR I+HindIII酶切后的电泳结果，其中M为DNAMarker，泳道1为空质粒，泳道2为质粒酶切图，泳道3为未酶切对照。

图3为融合蛋白编码基因表达产物SDS-PAGE鉴定结果，其中M为分子量Marker，从上至下依次为94.0KD、66.2KD、45.0KD、33.0KD、26.0KD、20.0KD、14.4KD，泳道1为纯化样品，泳道2为诱导样品，泳道3为未诱导阴性对照。

图4显示了样品纯化Western Blot印迹结果，其中M为预染Marker，1为样品，2为阴性对照。

图5显示了免疫SPF鸡ELISA检测血清特异性抗体结果。

具体实施方式

实施例中所述的具体试验方法描述仅是示例性描述，用于详细阐明本发明，但并不构成对本发明范围的限制，以下所述实验方法，没有具体说明的，均按照《分子克隆实验指南》(2002年，第三版，科学出版社)所述方法进行。

实施例一 融合蛋白基因的来源

本发明综合分析国内外鸡马立克氏病病毒主要流行株的基因序列、抗原结构、流行病学研究进展，根据其主要结构蛋白gB蛋白的氨基酸序列，利用相关生物信息学软件对其T细胞抗原表位进行分析，并通过亲水性、抗原性、可塑性、表面可及性和二级结构预测可能的B细胞抗原表位，综合相关报道，从而确定gB蛋白亚单位，杀伤性T细胞表位以及3个B细胞抗原表位。将所有表位用柔性Linker连接形成疫苗骨架结构后再与鸡γ干扰素串联，该疫苗总体结构为：

MDV gB-CTL-B1-B2-B3-IFN-γ-Tag

实施例二 大肠杆菌表达载体与表达菌株的构建

将实施例一中设计好的多肽编码核苷酸送上海英俊生物技术公司合成，核苷酸片段两端分别设计了EcoR I(5’端)和HindIII(3’端)限制性酶切位点，将合成好的片段克隆到pMD18T载体上，序列测定证实插入基因片段与涉及序列一致(见序列表)。将重组质粒命名为pMD18T-MDV-IFN-γ，用相应的限制性内切酶对质粒进行酶切处理，大肠杆菌表达载体选用Invitrogen公司的pRSETA质粒，也使用相同的限制性内切酶处理，酶切条件：10μL反应体系，体系内加入质粒2μL，限制性内切酶5个活性单位(New England biolabs)，10×缓冲液1μL，去离子水补齐，37.0℃酶切90分钟。酶切结束后加入1μL 200mM EDTA终止反应。在1％琼脂糖凝胶电泳中电泳30分钟。紫外灯下将pRSETA质粒和目的片段切下，按照Qiagen公司凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收。按照载体：片段为1∶2-3的比例将多表位核苷酸片段与表达载体混合，反应体系15μL，由T4DNA连接酶进行连接，16℃连接过夜，获得重组质粒命名为pRSETA-MDV-IFN-γ(见图1)，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)pLysS。

转化：将pRSETA-MDV-IFN-γ置冰上融化，加入1mL连接反应液，再次混匀，冰水浴30分钟，42℃30秒钟，然后迅速放回冰水浴90秒钟，加入1mL LB培养液，37.0℃静置培养1小时，4000g低温离心10秒钟弃上清，用200μL LB培养基重悬菌体，将菌液均匀涂布于含有100μL/mL氨苄青霉素的LB琼脂培养板上，倒置于37℃恒温箱中培养12-16小时，直至克隆形成。

鉴定：挑取平板上的单克隆至LB培养基中，37℃，200rpm震荡培养12小时，提取质粒，使用限制性内切酶EcoR I和HindIII进行双酶切，切出基因大小片段为1700bp左右，可初步确定为阳性克隆(见图2)，阳性克隆进行DNA序列测定进一步验证其正确性(见序列表)。

诱导表达：将阳性克隆过夜培养，次日早上按照1∶100转接，37℃震荡培养3小时后，加入0.5mM IPTG诱导，继续培养3小时，制备样品。常规SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况，可在63.9KD分子量处见到特异性条带为正确克隆(见图3)。取正确克隆，放大培养，SDS-PAGE证实表达正确后，使用常规Western-blot进一步证实其表达准确性(见图4)。最后筛选得到的高效分泌表达融合蛋白的工程菌，命名为pRSETA-MDV-IFN-γ/BL21(DE3，PLys)。

实施例三 工程菌的发酵、纯化与乳化

发酵 将生产菌种接种到2mL含有100μL/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养12小时活化菌种。将活化好的菌种按1∶100接入摇瓶，37℃震荡培养至OD600＝3，可按10％比例接种入发酵罐。发酵用培养基为半合成培养基，用蒸馏水配制，其中不含有任何抗生素。校正溶氧和pH值电极，开启罐体搅拌，转数为300rpm，罐体在线灭菌，待罐内培养液温度降至37℃时，标定pH及溶氧(OD)零点。发酵温度为37.0℃±0.1℃，溶氧控制在20％左右，pH控制在7.0，接种后培养菌体OD600＝1.0-1.2时流加补料500mL，补料后1小时加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导表达，连续诱导6个小时后发酵结束，取样做SDS-PAGE检测表达情况。

纯化 将收集的菌体，用包涵体洗液I(1％Triton X-100，20Mm Tris-cl pH 8.0)混悬后进行超声，2000W超声裂解1小时。4℃，12000rpm离心收集包涵体，并用包涵体洗液II(1％DOC，4M尿素，20mM Tris-cl pH 8.0)混悬二次超声洗涤包涵体，二次低温离心收集包涵体。包涵体沉淀用8M尿素，0.3％β-ME，20mM Tris-cl(pH＝8.0)混匀，室温搅拌4小时，8000rpm低温离心30分钟，弃去沉淀。变性蛋白1∶100稀释，复性液用Tris(pH＝8.0)缓冲体系，加入0.3M精氨酸，4℃搅拌复性24小时。复性液用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，20mM咪唑，平衡上亲和层析柱，用pH＝8.0的20mM磷酸缓冲液，0.5M氯化钠，0.5M咪唑洗脱。再用1.5M硫酸铵、100mM EDTA、pH＝8.5的10mM磷酸氢二钠平衡上疏水层析柱，再平衡，用pH＝8.5的10mM磷酸氢二钠洗脱，即得分子佐剂加强型鸡马立克氏病蛋白工程疫苗半成品原液，进行SDS-PAGE以及Western-blot印记检定纯化产物是否为目的蛋白。

乳化 将纯化的半成品原液用灭菌PBS稀释至200μg/mL。取进口白油矿物油佐剂DUOPRIME(医药级)经121℃灭菌15分钟，备用。按油相∶水相＝50∶50的比例配制，先将油相加入乳化缸内，开动搅拌机以80-100r/min的速度缓慢搅拌，缓缓加入水相，加完后再搅拌2分钟，然后以5500r/min高速循环乳化9分钟，制成油包水单相疫苗。

实施例四 蛋白工程疫苗安全性实验

1试验动物 3日龄SPF鸡40只。

2疫苗 由公司研发中心提供，批号20150216，20150218，20150220。

将40只3日龄SPF鸡随机分为4组，3个批号组和1个对照组，组间无体重差异。免疫组经腿部肌肉两点注射疫苗0.2ml/只；对照组经腿部肌肉两点注射PBS 0.2ml/只。免疫后饲养21天，观察试验动物采食、饮水及精神是否正常、是否产生过敏反应、是否死亡或出现其他异常情况，并在免疫前和试验结束后，对试验动物称重，记录并分析。

3试验结果

结果见表1，3个免疫组试验动物免疫后均未出现任何过敏反应或中毒症状，SPF鸡精神状态良好，采食、饮水、活动等一切正常，未出现明显局部炎症等损伤性临床副反应，无死亡发生，表明鸡马立克氏病蛋白工程疫苗对鸡是安全的。3个免疫组试验动物的体重增长与对照组相比，差异不显著(P＞0.05)，表明鸡马立克氏病蛋白工程疫苗对动物体重无不良影响。

表1蛋白工程疫苗安全性检测结果

组别

采食

精神

炎性反应

死亡

免前体重(g)

免后21天体重(g)

日均增重(g)

20150216

正常

正常

无

无

43.42±2.78

211.95±12.88

8.03±0.49

20150218

正常

正常

无

无

43.00±3.04

206.48±14.29

7.78±0.55

20150220

正常

正常

无

无

43.80±3.01

215.46±14.33

8.17±0.56

对照组

正常

正常

无

无

43.04±3.26

209.47±13.97

7.93±0.51

实施例五 特异性抗体的ELISA检测

1试验动物 1日龄SPF鸡80只。

2疫苗 蛋白工程疫苗由公司研发中心提供，批号20150216、20150218、20150220。

将80只1日龄SPF鸡随机分为4组，3个免疫组和1个对照组，免疫组分别肌肉注射各批次蛋白工程苗，0.2ml/只，对照组肌肉注射PBS，0.2ml/只。分别在免后3、5、、7、14、21、28、42天翅静脉采血，分离血清，保存备用。

ELISA方法检测血清中的抗体，其具体步骤如下：将纯化的MDV重组蛋白抗原用PBS(pH7.4)稀释成10μg/mL，加入酶标板中，100μL/孔，4℃静置包被过夜；去掉液体，用PBST(含0.05％Tween-20，pH7.4)洗板三次，3分钟/次，加入5％脱脂奶粉，100μL/孔，37℃封闭1小时；洗板三次，用血清稀释液(含0.5％小牛血清的PBST)将待检样品1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600、1∶3200、1∶6400、1∶12800倍稀释，加入酶标板，100μL/孔，同时用免疫PBS的血清做阴性对照，37℃孵育1小时；洗板三次，用1∶2000稀释的HRP标记兔抗鸡IgG加入酶标板，100μL/孔，37℃孵育1小时。加入TMB底物100μL/孔，避光显色15分钟；加入2MH₂SO₄终止反应，于450nm波长下检测吸光度值(BIORAD 680酶标仪)。

3试验结果：

试验鸡免疫蛋白工程疫苗后能在较短时间内产生特异性抗体，免后第5天，血清中的平均抗体滴度达1∶1400以上，三个批次组之间无显著差异。试验鸡血清中的IgG抗体滴度呈现相同的消长趋势，免疫后开始缓慢升高，免后5-7天迅速升高并在第21天达到高峰，然后呈下降趋势，截至实验结束，抗体水平降到免后5天的水平。免后21天抗体滴度最高可达1∶12800，最低为1∶6400，而PBS对照组未检测到抗体(见图5)，说明蛋白工程苗能在免疫后较短时间内诱导机体迅速产生明显的体液免疫反应。

实施例六 免疫保护试验

1试验动物 1日龄SPF鸡140只。

2疫苗与攻毒用毒株 蛋白工程疫苗由公司研发中心提供，批号20150216、20150218、20150220，CVI988/Risenpes液氮苗和HVT冻干苗均为国产商品化疫苗，MDV1超强毒株RB1B由广东永顺制药研发中心惠赠。

将140只1日龄SPF鸡随机分为7组，蛋白工程苗组、商品苗组、攻毒对照组及健康对照组。蛋白工程苗组分别肌肉注射各批次蛋白工程苗，0.2ml/只，商品苗组分别肌肉注射CVI988/Risenpes冷冻疫苗和HVT冻干苗，0.2ml/只，攻毒对照组免疫PBS乳化液，0.2ml/只，健康对照组不做任何处理。8日龄时除了健康对照组外的各组鸡经腹腔注射攻击vvMDV国际标准毒株RB1B(1000PFU)，连续观察60天，记录鸡的发病情况，并对试验期间死亡的鸡逐个剖检，记录器官的大体病变。攻毒后10、17、24、31天，每组随即采集10只鸡的血羽样本，进行琼脂扩散实验，检测羽囊排毒情况。

保护率＝[(攻毒对照组死亡率-疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率]×100％。

3试验结果：

结果如表2，PBS对照组在24日龄(攻毒后16天)出现第一只MD致死，截至试验结束死亡15只，死亡率为75％；蛋白工程疫苗保护率不低于CVI988/R液氮苗，高于HVT冻干苗，其中20160216批次组无鸡只死亡，保护率达到100％；剖检发病死亡鸡均表现各内脏器官(性腺、心脏、肝脏、脾脏、肾脏)及神经的弥漫性肿瘤或结节性肿瘤，胸腺和法氏囊萎缩等变化。

表2蛋白工程疫苗对SPF试验鸡的保护效应

实施例七 琼脂扩散试验

为了检测强毒在羽毛囊中的复制情况，于攻毒后10、17、24、31天采集带血羽毛样品，每只鸡采集6根羽毛，以1％琼脂(含8％氯化钠)浇成琼脂板，用带血羽囊按常规方法进行琼脂扩散试验，同时以阳性血清做对照。如果在加样孔和阳性血清孔之间出现沉淀线即判为阳性，6根羽囊中只要有一根呈阳性反应，即判定该鸡为羽囊排毒阳性。

试验结果

结果如表3，攻毒后第10天对照组的鸡就开始排毒，排毒持续时间较长；应用基因工程疫苗免疫的鸡羽囊的排毒时间推迟，且排毒时间缩短，排毒量与HVT冻干苗组相比明显降低，免疫效果接近CVI988/R液氮苗。各批次组之间无明显差异。

表3 SPF鸡免疫攻毒后羽囊排毒情况

组别	攻毒后10天	攻毒后17天	攻毒后24天	攻毒后31天
					20150216	0/10	1/10	2/10	0/10
20150218	1/10	2/10	1/10	0/10
					20150220	0/10	2/10	1/10	0/10
CVI988/R液氮苗	0/10	1/10	2/10	0/10
					HVT冻干苗	3/10	4/10	5/10	4/10
攻毒对照组	7/10	10/10	9/10	8/10
					健康对照组	0/10	0/10	0/10	0/10

Claims (8)

1.一种鸡马立克氏病多表位融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.一种核酸分子，其编码权利要求1所述的融合蛋白。

3.权利要求2所述的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.一种载体，其含有权利要求2或3所述的核酸分子。

5.一种宿主细胞，其含有权利要求4所述的载体。

6.一种制备权利要求1所述融合蛋白的方法，其包括用权利要求5所述的宿主细胞表达权利要求1所述的融合蛋白。

7.一种用于预防鸡马立克氏病的疫苗，其包括权利要求1所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体。

8.权利要求1所述的融合蛋白在制备鸡马立克氏病蛋白工程疫苗中的应用。