CN104031152A

CN104031152A - 重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His、抗该蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN104031152A
Application number: CN201410325521.4A
Authority: CN
Inventors: 师东方; 韩林林; 包军; 董秀梅; 朱妍; 张萍; 刘文鑫
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2014-07-09
Filing date: 2014-07-09
Publication date: 2014-09-10
Anticipated expiration: 2034-07-09
Also published as: CN104031152B

Abstract

本发明公开了一种重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素(STp)融合蛋白STp5-His、抗该蛋白的单克隆抗体及其应用，本发明中所述的融合蛋白STp5-His的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，编码所述融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明中猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素STp成熟肽基因(estp)经过4次串联后表达出融合蛋白STp5-His，使原本不具有免疫原性的天然STp蛋白具有了良好的免疫原性。本发明采用细胞融合技术制备出针对该融合蛋白STp5-His和天然STp的特异性单克隆抗体，解决了生产实践中无法对STp进行检测的难题，且该特异性单克隆抗体能够在体外中和天然STp，具有临床应用的前景。

Description

重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His、抗该蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明涉及重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白及其应用，具体涉及猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素STp基因(estp)经过4次串联后表达出融合蛋白STp5-His，使原本不具有免疫原性的天然STp具有了良好的免疫原性，本发明属于基因工程及免疫学技术领域。

背景技术

产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起幼畜、儿童和旅行者腹泻的主要病原菌，是造成新生仔猪、犊牛腹泻的重要病原之一。在家畜中，尤其以初生幼畜特别易感，可造成生长发育迟缓、生产能力低下、严重的可以导致死亡，给畜牧业带来严重经济损失。ETEC毒力因子包括黏附素、肠毒素、水肿病毒素、内毒素、溶血素以及EatA等。其中，肠毒素在ETEC的致病机理中发挥重要作用。肠毒素包括：耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin,ST)和不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT)，其中ST是造成严重腹泻的主要毒力因子之一。

根据ST的生物学特性可将其分为：STI(或STa)和STⅡ(或STb)两类。STa能引起新生仔猪(1～3日龄)和乳鼠肠积水，可导致儿童发生腹泻；STb只能引起断乳小猪和兔的肠积水，对乳鼠没有致病性。STa在ST引起的腹泻病中占主要地位。根据来源不同，STa分为猪/牛源(STp)和人源(STh)。STp与STh结构相似，有14个氨基酸残基及3个二硫键相同，成熟的STp有18个氨基酸，成熟的STh有19个氨基酸，二者在抗原性上没有差别，能通过基因探针加以识别。由于STa分子量小(约2Ku)，很难获得天然纯品，且此蛋白不具有免疫原性。STa无法被蛋白质染色剂染色，也不能直接包被到ELISA板上，因此无法采用SDS-PAGE法和ELISA方法对其进行直接检测，给临床ETEC的检测带来很大困难。由ETEC引起的腹泻疾病中，ST发挥重要作用，据Rebertson的调查研究表明：20％～30％的ETEC为LT+/ST-；30％～40％的ETEC为LT+/ST+；接近50％的ETEC为LT-/ST+。也就是说在大部分的ETEC引起的严重腹泻中，均有ST的存在，所以对ST进行快速、准确的检测有利于对腹泻病的早期诊断，采取有效治疗方案，降低经济损失。据统计，STp是造成新生仔猪和犊牛腹泻，甚至死亡的重要毒力因子之一。

目前对STa的检测方法是乳鼠灌胃法。将新生BALB/c乳鼠(1～3日龄)随机分组，将细菌过夜培养物上清中加入2％的伊文斯蓝10μl/ml。每只乳鼠灌饲0.1ml，25℃静止4h后，腹部解剖后取全部肠管，计算灌胃后乳鼠的G/C(肠重/剩余尸重)值进行结果判定，当G/C值≥0.09时，判为STa阳性，G/C值≤0.083时，判为STa阴性，两者之间判为可疑。该方法与血清学方法相比敏感性较低，需要特定的实验动物，操作繁琐，不利于实验室对STa的快速检测。因此，制备针对STa的特异性抗体，建立快速、敏感、特异的血清学检测方法对深入开展ETEC相关研究具有重要的理论和实际意义。

由于STa蛋白较小，免疫原性差，单独免疫后无法刺激动物体产生相应抗体。虽然通过化学方法提纯可以获得品质较高的STa蛋白，但纯化工艺复杂，样品损失量大，因此获得具有免疫原性的STa蛋白是制备特异性抗体的前提。目前主要有两种方法获得具有免疫原性的STa蛋白：

(1)基因融合方法：一般选择将STa基因与其它比较大的载体蛋白基因进行融合，表达融合蛋白，通过这种方法获得具有免疫原性的STa融合蛋白。例如将STa基因与LT B亚单位基因连接、STa基因与K99基因融合或STa基因与β-半乳糖苷酶基因融合在一起等，其中将STa基因与LTB基因融合进行提高STa免疫原性的研究较多。徐兵等(1999)将ETEC的LTB亚单位基因和ST基因融合并进行了表达，用表达的融合蛋白免疫小鼠后，抗ST的血清抗体效价为免疫前的100倍，抗LTB的血清抗体效价为免疫前的1000倍，由于LTB是强免疫原，所以抗ST的血清抗体效价明显低于抗LTB血清抗体效价。李敏等(2009)通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将STa毒素中心的6个Cys分别突变为Ser和Gly，将突变后的STa与K99菌毛基因连接，表达的融合蛋白能够被抗ETEC C83922的多克隆抗体特异性识别，但是没有明确说明STa抗体的产生。李书光等(2009)利用基因工程技术构建了k99-estA融合基因及其原核表达载体，并对表达的融合蛋白进行了初步免疫原性分析。结果显示，用该蛋白免疫动物能够获得抗STa蛋白的特异性抗体，乳鼠灌胃实验证明该抗体能中和天然STa，对乳鼠有保护作用。

(2)化学偶联方法：此方法首先需要纯化ST，使其达到同质的标准。然后将其与其它大分子蛋白质(如BSA、GST、HAS)通过化学剂进行偶联。例如Aref(2012)利用二甲基甲酰胺(DMF)作为结合剂将纯化后的STa与经过修饰的牛血清白蛋白(MBSA)连接，合成了STa-MBSA共轭物蛋白，用此蛋白免疫新西兰大白兔，获得的抗STa血清抗体效价可达到1:1×10⁶。

但以上获得免疫原性STa蛋白的方法均具有不足之处。采用常规的基因融合方法将STa基因与LTB基因或其它的基因进行融合，表达的融合蛋白能够在不同程度上诱导免疫动物产生针对STa的抗体，但STa基因大小没有变化，只是将其与某个大分子量蛋白基因连接在一起进行融合表达，融合蛋白中STa蛋白的比例仍然较小，导致该融合蛋白免疫动物后产生针对STa的特异性抗体的效价往往不高。而通过化学方法将STa与其它半抗原蛋白偶联以获得免疫原性STa蛋白的方法，首先需要提纯STa。STa因为蛋白质分子量小难以进行提纯且纯化工艺复杂，另外，化学偶联试剂价格昂贵、无法批量生产，而且这些化学偶联剂如碳化二亚胺、戊二醛等会造成偶联蛋白之间的随机偶联，甚至会造成STa三级构象的改变，使其抗原表位发生变化，从而影响最终蛋白的免疫效果。

为解决上述难题，获得具有免疫原性的STp蛋白，本发明将estp进行4次串联，构建了estp5-his基因片段，使estp从54bp增加至447bp。将该基因片段插入pGEX-6P-1载体，构建pGEX-6P-estp5-his表达载体。将获得的表达载体转入BL21(PlySs)感受态中，表达了融合蛋白STp5-His，大小约为38Ku，理论上使融合蛋白STp5-His的分子量比天然STp增加了5倍，增强了其免疫原性。而且用其免疫动物，能够刺激小鼠产生抗STp特异性抗体。因此，用此融合蛋白作为免疫原免疫BALB/c鼠，采用细胞融合技术制备了针对融合蛋白STp5-His和天然STp的特异性单克隆抗体，为建立STp血清学检测技术提供了有效的检测试剂，解决了用血清学方法检测STp的难题，且该特异性单克隆抗体能够体外中和天然STp，具有临床治疗的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服天然STp不具有免疫原性，无法用其免疫动物制备特异性抗体来建立血清学检测方法的难题，提供一种新型重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白以及由该重组蛋白免疫动物制备得到的特异性抗体。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明根据猪/牛源STp成熟肽基因序列(estp，GenBank:V00612.1，448bp-501bp)，参考大肠杆菌密码子偏好性对其优化后人工合成两段基因：estp-linker以及estp-his，其中estp-linker片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，estp-his片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，将这两段基因进行4次串联，构建得到串联基因片段estp5-his，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。将estp5-his插入pGEX-6P-1载体(图1)中，获得了重组表达载体pGEX-6P-estp5-his(图2)。将得到的重组表达载体转化到宿主菌中，表达获得了融合蛋白STp5-His，该融合蛋白STp5-His即为具有免疫原性的重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素蛋白，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，该融合蛋白以包涵体形式存在。用切胶纯化的融合蛋白STp5-His免疫新西兰大白兔，可刺激动物产生针对融合蛋白STp5-His的特异性多克隆抗体，其效价为1:40000。用此融合蛋白作为免疫原免疫小鼠后制备出一株针对融合蛋白STp5-His和天然STp的特异性单克隆抗体MAb-C3，其细胞培养上清效价为1:12800，腹水效价为1:1×10⁶，且该单克隆抗体可以体外中和粗提后的天然STp。

本发明的一种重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

进一步的，本发明还提出了编码以上所述的重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His的核苷酸序列，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

含有所述核苷酸序列的重组表达载体以及含有所述重组表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。

优选的，本发明的一种重组表达载体，其特征在于，通过以下方法构建得到：

(1)基因的设计：

参照耐热肠毒素STp成熟肽基因序列，进行大肠杆菌密码子优化后，设计并合成如下两段核苷酸序列：estp-linker以及estp-his；

其中，estp-linker的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，estp-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(2)estp基因的串联：

通过同尾酶构建estp-linker-estp-linker-estp-linker-estp-linker-estp-his基因片段，命名为基因片段estp5-his；

(3)表达载体的构建：

将构建的串联基因estp5-his插入pGEX-6P-1载体中，构建得到重组表达载体。

在本发明的一个具体实施例中，所述基因片段estp5-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明中，优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21PlySs。

本发明重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His免疫动物后可以产生抗STp特异性抗体，步骤如下：

(1)融合蛋白的表达：将本发明获得的重组表达载体转化到宿主细胞中，经IPTG诱导表达，获得重组融合蛋白STp5-His，带有His标签，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，该融合蛋白大小约为38Ku，以包涵体形式存在，表达量约占菌体总蛋白量的20％；

(2)融合蛋白STp5-His的免疫原性：用获得的融合蛋白STp5-His免疫新西兰大白兔，可刺激机体产生针对融合蛋白STp5-His的特异性多克隆抗体，其间接ELISA检测效价可达1:40000；用该融合蛋白免疫小鼠后，采用细胞融合技术制备出1株杂交瘤细胞，命名为C3，能产生针对融合蛋白STp5-His和天然STp的特异性单克隆抗体。该单克隆抗体经鉴定为IgG1，命名为MAb-C3。C3的细胞培养上清间接ELISA检测效价为1:12800，其腹水效价可达到1:1×10⁶。该单克隆抗体可以体外中和粗提的天然STp。

因此，更进一步的，本发明还提出了所述的重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His在制备抗耐热肠毒素STp特异性抗体中的应用。

本发明所述的一种分泌抗重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为C3，分类命名为鼠源杂交瘤细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9245，保藏日期为2014年6月4日。

再进一步的，本发明还提出了一种抗所述的重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No.9245的杂交瘤细胞分泌产生的。以及所述的单克隆抗体在制备检测耐热肠毒素STp试剂中的应用以及在制备治疗由耐热肠毒素STp引起的疾病药物中的应用。

附图说明

图1为pGEX-6P-1载体图谱；

图2为pGEX-6P-estp5-his重组表达载体图谱；

图3为基因工程菌BL21(PlySs)/pGEX-6P-estp5-his SDS-PAGE分析图；

其中，M为蛋白质分子量标准，1为未经IPTG诱导的BL21(PlySs)/pGEX-6P-estp5-his菌液，2为IPTG诱导后BL21(PlySs)/pGEX-6P-1空载体，3为IPTG诱导后BL21(PlySs)/pGEX-6P-estp5-his(上清)，4为IPTG诱导后BL21(PlySs)/pGEX-6P-estp5-his(包涵体)；

图4为融合蛋白STp5-His Western blot鉴定图；

其中，M为蛋白质分子量标准，1为IPTG诱导后BL21(PlySs)/pGEX-6P-estp5-his(包涵体)，2为IPTG诱导后BL21(PlySs)/pGEX-6P-estp5-his(上清)，3为IPTG诱导后BL21(PlySs)/pGEX-6P-1空载体，4为未经IPTG诱导的BL21(PlySs)/pGEX-6P-estp5-his菌液。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1 STp5-His基因的构建

1、序列的优化合成

根据GenBank:V00612.1获得STp成熟肽的18个氨基酸序列，如SEQ ID NO.6所示。

根据大肠杆菌密码子偏好性对其优化：选择偏好性高的密码子，相邻两个相同的氨基酸，密码子核苷酸第一个选择大肠杆菌偏好性最高的密码子，第二个选择大肠杆菌偏好性第二高的密码子，优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

此序列加上linker核苷酸序列和组氨酸标签(his)核苷酸，经鉴定该序列没有BamH I、BglⅡ和Sal I3个酶切位点。

选择如下3个酶作为酶切位点，其中BamH I和BglⅡ为同尾酶。

Sal I:GTCGAC

BamH I:GGATCC

BglⅡ:AGATCT

linker进行大肠杆菌偏好性优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

his进行大肠杆菌密码子偏好性优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

采用基因合成方法合成estp-linker和estp-his两段序列，其中estp-linker的核苷酸序列如SEQ NO.1所示，estp-his的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。将合成的这两段序列分别连接到pUC57载体上。

2、STp5-His基因的构建

第一次串联：

酶切：将estp-linker质粒先用BglⅡ和Sal I进行双酶切，酶切后回收大片段(pUC57-estp-linker)。将estp-linker质粒和estp-his质粒分别用BamH I和Sal I双酶切，酶切后回收小片段estp-linker(BamH I，Sal I)和estp-his(BamH I，Sal I)，-20℃保存备用。

连接转化：BglⅡ和BamH I是同尾酶，它们的酶切产物末端在T₄连接酶作用下可以重新连接形成新的酶切位点，此位点不能再被这两种酶切开。连接条件16℃连接过夜，反应体系(10μl)：

次日，将连接产物转化DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)终浓度为100μg/ml的LB琼脂平板培养基(Amp⁺，100μg/ml)，37℃培养12～15h。挑取单个菌落，扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定，鉴定正确的质粒命名为pUC57-estp-linker-estp-linker。

二次串联：

方法同第一次串联，即将pUC57-estp-linker-estp-linker用BglⅡ和Sal I双酶切，回收大片段。将回收的大片段和estp-linker(BamH I，Sal I)用T₄连接酶过夜连接。次日，将连接产物转化DH5α，扩大培养，提取质粒酶切鉴定，鉴定正确的质粒命名为pUC57-estp-linker-estp-linker-estp-linker。

三次串联：

方法同第一次串联，即将pUC57-estp-linker-estp-linker-estp-linker用BglⅡ和Sal I双酶切，回收大片段。将回收的大片段和estp-linker(BamH I，Sal I)用T₄连接酶过夜连接。次日，将连接产物转化DH5α，扩大培养，提取质粒酶切鉴定，鉴定正确的质粒命名为pUC57-estp-linker-estp-linker-estp-linker-estp-linker。

四次串联：

方法同第一次串联，即将pUC57-estp-linker-estp-linker-estp-linker-estp-linker用BglⅡ和Sal I双酶切，回收大片段。将回收的大片段和estp-his(BamH I，Sal I)用T₄连接酶过夜连接。次日，将连接产物转化DH5α，扩大培养，提取质粒酶切鉴定，鉴定正确的质粒命名为pUC57-estp5-his，获得的串联后的基因片段estp-linker-estp-linker-estp-linker-estp-linker-estp-his的长度为447bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

实施例2 pGEX-6P-estp5-his重组表达载体构建及表达产物制备

1、pGEX-6P-estp5-his重组表达载体构建

将pUC57-estp5-his和pGEX-6p-1分别用Sal I和BamHⅠ双酶切，各5管，每管反应体系为20μl：10×K Buffer2.0μl、BamHⅠ0.5μl、Sal I0.5μl、质粒17.0μl。37℃水浴酶切3h，1.5％琼脂糖凝胶回收目的estp5-his(Sal I，BamHⅠ)片段和pGEX-6p-1(Sal I，BamHⅠ)载体片段。将纯化后的estp5-his(Sal I，BamHⅠ)与pGEX-6p-1(Sal I，BamHⅠ)16℃连接过夜，反应体系为10μl：T4DNA Ligase Buffer1.0μl、T4DNA Ligase0.5μl、pGEX-6p-1(Sal I，BamHⅠ)1.4μl、estp5-his(Sal I，BamHⅠ)7.1μl。

次日，将连接产物转化到DH5α感受态细胞，涂于LB琼脂平板培养基(Amp⁺，100μg/ml)，37℃培养过夜。次日，挑取单个菌落，接种于LB液体培养基(Amp⁺，100μg/ml)中，37℃200r/min振荡培养14～18h，提取重组质粒，用Sal I和BamHⅠ进行双酶切鉴定。鉴定正确的重组质粒进一步序列分析。构建表达载体pGEX-6P-estp5-his图谱如图2所示，部分载体序列的测序结果如SEQ ID NO.4所示。说明重组质粒构建正确，

鉴定正确的重组表达载体pGEX-6P-estp5-his转入宿主菌BL21PlySs感受态，构建的基因工程菌命名为BL21(PlySs)/pGEX-6P-estp5-his。

2、融合蛋白STp5-His的诱导表达

将BL21(PlySs)/pGEX-6P-estp5-his进行常规诱导表达。将新鲜菌液按1:25接种于50ml液体LB培养基(Amp+,100μg/ml；氯霉素，35μg/ml)的锥形瓶，37℃200r/min振荡培养3～4h，在OD_600nm＝0.4～0.6时收集样品100μl，然后加入IPTG至终浓度为1mM，于37℃200r/min振荡培养7h。将诱导后的菌液10000g/min离心10min，弃上清。菌体沉淀用PBS重悬，反复洗3次，弃上清。最后将菌体沉淀用1ml PBS重悬，超声波处理。超声条件为：工作3.0s、间歇4.0s、功率400W、超声10min。超声结束后，分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE分析，鉴定目的蛋白的表达方式。对BL21(PlySs)/pGEX-6P-1的空载体重组菌也以相同条件诱导表达作为对照。以12％分离胶进行SDS-PAGE电泳分析，可见目的蛋白(约38Ku)以包涵体形式表达(图3)。

3、融合蛋白STp5-His的鉴定

由于在estp5-his尾部加入了His标签基因，所以表达的目的蛋白可以通过His单抗特异性识别来鉴定融合蛋白STp5-His是否成功表达。将蛋白Marker、包涵体沉淀、上清、空载体对照、未诱导样品进行15％的SDS-PAGE电泳。然后取出凝胶，按常规操作进行Western blot分析，转印条件为50mA45min。转印结束后，取下NC膜，将NC膜放在5％脱脂乳中，4℃冰箱过夜封闭。将过夜封闭的NC膜用PBST洗涤3次，10min/次，放置于His单抗(用5％脱脂乳按1:500稀释)中，37℃摇床作用2h。用PBST洗涤3次，将NC膜放入含有辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(1:5000稀释)中，37℃摇床作用2h。用PBST冲洗3次，最后用4-氯-l-奈酚显色液避光显色，观察，当出现反应条带后，立即用去离子水冲洗NC膜以终止反应。结果显示，在包涵体泳道约38Ku处出现特异性条带，其它地方无条带出现，证明该融合蛋白STp5-His成功表达(图4)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

实施例3 融合蛋白STp5-His的免疫原性鉴定

1、融合蛋白STp5-His纯化

在融合蛋白STp5-His中加入等量的SDS上样缓冲液，沸水中煮沸10min，取600μl样品进行12％分离胶的SDS-PAGE电泳。电泳结束后，用4℃预冷的0.3M KCl溶液染色，此时蛋白胶上约38Ku处可见一条白色条带，与预期的融合蛋白 STp5-His大小一致。将目的条带切下，放入4ml EP管中，充分研碎后加入适量PBS混匀，反复冻融4次，使蛋白释放，然后10000g/min离心10min，收集上清即为纯化的蛋白，其蛋白含量为1.423～1.789mg/ml，分装后-80℃保存。

2、检测蛋白MBP-STp5的制备

将本实验室构建的estp5基因片段插入pMAL-c4x载体，诱导表达带有MBP标签蛋白的融合蛋白MBP-STp5，通过切胶纯化。该融合蛋白不含His标签蛋白，与融合蛋白STp5-His只有STp5部分相同。

3、多克隆抗体的制备

将纯化的融合蛋白STp5-His用PBS稀释成1mg/ml，每只新西兰雌性大白兔免疫剂量为1mg蛋白+1ml白油+40μl吐温。按上述比例取适量融合蛋白STp5-His、白油和吐温，300W超声乳化20min，以此为免疫原，经颈部皮下两点、背部皮下两点、左右后腿肌肉两点注射免疫。每隔14d免疫一次，第3次免疫后3d，兔耳缘静脉采血，分离血清，用间接ELISA检测血清抗体效价。ELISA包被抗原为纯化的融合蛋白MBP-STp5(1.4μg/ml，100μl/孔)，二抗为HRP标记的羊抗兔IgG(1:8000稀释)，免疫前兔血清作为阴性血清对照，抗体的效价定义为OD_450nmP/N>2的最大稀释倍数。结果显示，血清中抗STp特异性抗体效价为1:40000，证明融合蛋白STp5-His具有良好的免疫原性。所制备的兔血清多克隆抗体命名为Ab-STp。

4、单克隆抗体的制备

将纯化的融合蛋白STp5-His用PBS稀释成1mg/ml。取6～8周龄的雌性BALB/c小鼠，每只小鼠免疫剂量为0.1mg蛋白+0.1ml佐剂。按上述比例取适量融合蛋白STp5-His和佐剂，200W超声乳化15min，以此为免疫原，经腹腔注射免疫。总共免疫四次，每隔14d免疫一次。第一次免疫佐剂用弗氏完全佐剂，随后三次采用弗氏不完全佐剂。四免3天后，用间接ELISA检测其血清抗体效价，当效价达到1:25600时，随即用0.1mg纯化融合蛋白STp5-His加强免疫，3天后剖杀，取脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。

4.1饲养层细胞制备

融合前1d，选择健康非免疫昆明鼠颈锥脱臼致死，75％酒精浸泡消毒5～8min，移入超净台内，固定于解剖板上，用灭菌镊子和剪刀剪开腹部皮肤(注意不可损伤腹膜)，充分暴露腹膜。用酒精棉擦拭消毒，然后用一次性无菌注射器吸取10ml完全HAT选择培养液注入小鼠腹腔，右手固定注射器保持不动，左手用镊子夹取酒精棉球轻轻揉动小鼠腹部1～2min(注意时间不要太长，以免小肠上皮细胞脱落)，再用注射器吸出腹腔内的培养液(内含巨噬细胞)，注入到灭菌平皿中。再往平皿中补加45ml完全HAT选择培养液混匀，100μl/孔加入一次性96孔细胞板，置于5％CO2，37℃的细胞培养箱中培养。18～24h后观察饲养层细胞生长状态，细胞呈多形性，贴壁紧密，折光性较好时可用。

4.2骨髓瘤细胞(SP2/0)准备

SP2/0细胞融合前两周就开始复苏，调整其状态，使细胞成对数增长。融合前6～8h重新换液。

4.3杂交瘤细胞融合

(1)灭菌PEG3350(50％)融合剂放入37℃温箱预热。

(2)将小鼠摘眼球取血，断颈处死后，浸入75％酒精中7～10min。

(3)准备3个平皿分别加入10ml不完全1640培养基，其中一个有铜网。

(4)将小鼠捞出，去除多余酒精，将小鼠固定在解剖板上，剪开腹部皮肤，酒精棉擦腹膜，换一套剪镊剪开腹膜，再换一套剪镊钝性剥离脾脏(动作轻柔不要让脾脏破裂以免污染)，在第一个平皿中尽量剥除包裹脾脏的结缔组织和脂肪，在第二个平皿中涮洗，然后放入带铜网的平皿磨碎释放脾淋巴细胞。

(5)将SP2/0细胞吹下移入10ml离心管。

(6)分别将脾淋巴细胞和SP2/0细胞1000r/min离心10min，倒去上清。

(7)取2个10ml离心管，里面加入10ml不完全1640培养基，37℃预热。

(8)分别重悬脾淋巴细胞和SP2/0细胞，1000r/min离心10min，倒去上清。

(9)重复步骤(8)。

(10)将脾淋巴细胞与SP2/0细胞按5:1比例混合后加入50ml离心管，混匀，1400r/min离心10min，弃上清。

(11)轻轻振动50ml离心管，使细胞沉淀混匀成糊状。

(12)将50ml离心管37℃水浴2～3min。

(13)用1ml吸管吸取1ml37℃预热的PEG3350(50％)，1min内边搅拌边加入，动作要轻柔。37℃水浴静止90s。然后取10ml预热的不完全1640培养基，5min内加入(前3min内，1ml/min加入；第4min加2ml；第5min加5ml)终止PEG作用，边搅拌边加入。

(14)37℃水浴静止7min，1400r/min离心10min，弃上清。

(15)再加入10ml预热的不完全1640培养基洗一次。

(16)加入50ml HAT培养基重悬细胞沉淀，混匀，100μl/孔加入铺有饲养层细胞的96孔板。

(17)在4～6天时观察，融合上的细胞能在选择性培养基HAT中增值成细胞群。

4.4阳性杂交瘤细胞筛选

用间接ELISA筛选阳性融合细胞，以SP2/0细胞培养上清液作为阴性对照，免疫小鼠血清作为阳性对照，检测P/N>2且OD_450nm>0.5定义为阳性杂交瘤细胞株，经过3次间接ELISA筛选，选择OD_450nm值稳定的阳性杂交瘤细胞株进行单克隆。最终筛选获得1株稳定分泌抗融合蛋白STp5-His和天然STp的杂交瘤细胞，命名为C3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9245，保藏日期为2014年6月4日。所分泌的单克隆抗体经鉴定为IgG1亚类，命名为MAb-C3。间接ELISA测定C3细胞培养上清效价为1:12800，用其制备的腹水效价可达1:1×10⁶。

实施例4 抗体的免疫反应性鉴定

1、天然STp的粗提

参照文献(John FA,1978；Staples SJ,1980；Saeed MK,1983；Aref NM,2012)并结合本实验室条件，重新设计了粗提STp的方案，简要步骤如下：将产猪/牛源耐热肠毒素大肠杆菌C83915(STp⁺)在LB固体培养基上划线，37℃培养18h，挑取单个菌落接种于50ml Honda氏产毒肉汤基础培养基中，37℃200r/min振荡培养14～16h，然后无菌转入有3L Honda氏产毒肉汤培养基的生物发酵罐，添加止泡剂，发酵培养。发酵条件为39℃、溶氧度45％、PH＝8.5、发酵24h。取出培养物，6000r/min离心30min，收集上清。将上清过XAD-2大孔吸附树脂柱，随后将洗脱液通过闪蒸的方法浓缩至50ml，加入5倍体积HPLC级别的丙酮进行萃取，置于4℃1h，离心收集上清，通过闪蒸浓缩至30ml，分装、-70℃保存备用。

2、毒素中和试验

参照Giannella(1976)的方法进行乳鼠灌胃实验。实验分3组，每组3只小鼠，第1组为Honda培养基(阴性对照组)；第2组为粗提STp(用Honda培养基1:20稀释)组(阳性对照组)；第3组为粗提STp(用Honda培养基1:10稀释)与等体积C3细胞培养上清混合(实验组)，每组样品添加2％伊文思蓝10μl/ml，分别置于25℃温箱孵育2h。实验动物为3～5日龄的新生乳鼠，100μl/只灌胃，灌完后将乳鼠置于25℃温箱保温。4h后剖腹取出全部肠管，分别称量肠管与剩余尸体的重量，计算G/C(肠重/剩余尸重)值。结果显示，第1组和第3组乳鼠状态良好，肠管无充盈，且G/C值<0.083。第2组乳鼠不爱动、奄奄一息，肠管有明显充盈，G/C值>0.090，具体数值见表1。试验证明，制备的单克隆抗体MAb-C3能中和天然STp。

表1 乳鼠灌胃试验结果

判定结果：当G/C值≥0.090时，判断为STp阳性(+)，G/C值≤0.083时，判断为STp阴性(－)，两者之间可疑(±)。

3、抗体与STp的免疫反应性

用包被液将融合蛋白MBP-STp5稀释成1.4μg/ml，100μl/孔包被ELISA板，4℃包被过夜。次日用PBST洗3次，5％脱脂乳37℃封闭2h。事先将C3细胞培养上清用PBST稀释到一定比例，加入等体积粗提STp(1:20稀释)，混匀后置于37℃孵育1h。封闭结束后，PBST洗3次，然后加入C3细胞培养上清与STp的孵育液，100μl/孔，用C3细胞培养上清作对照，37℃作用1h。PBST洗3次，加入HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃孵育1h。PBST洗3次，加入TMB显色液，100μl/孔，置于暗处显色5min，加2M硫酸终止反应。用同样的方法检测兔多克隆抗体Ab-STp与STp的免疫反应性。用酶标仪读取OD_450nm值。

结果显示，STp能够阻断MAb-C3和Ab-STp与包被抗原结合，其抑制率都在80％以上(表2)。证明MAb-C3和Ab-STp与STp均有良好的免疫反应性。

表2 阻断ELISA结果

注：阻断抑制率(％)＝(对照―阳性)/对照×100％。

Claims

1.重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His，其特征在于，所述的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.编码权利要求1所述的重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His的核苷酸序列，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种含有如权利要求2所述核苷酸序列的重组表达载体。

4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，通过以下方法构建得到：

(1)基因的设计：

(2)estp基因的串联：

(3)表达载体的构建：

5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述基因片段estp5-his的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

6.一种含有权利要求3-5任一项所述的重组表达载体的宿主细胞，优选的，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21PlySs。

7.权利要求1所述的重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His在制备抗耐热肠毒素STp特异性抗体中的应用。

8.一种分泌抗权利要求1所述的重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于所述杂交瘤细胞株命名为C3，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No.9245。

9.一种抗权利要求1所述的重组猪/牛源大肠杆菌耐热肠毒素融合蛋白STp5-His的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体是由保藏号为CGMCCNo.9245的杂交瘤细胞分泌产生的。

10.权利要求9所述的单克隆抗体在制备检测耐热肠毒素STp试剂中的应用以及在制备由耐热肠毒素STp引起的疾病治疗药物中的应用。