CN117088941A - 一种三肽衍生物及其组合物和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三肽衍生物及其组合物和用途，所述肽衍生物或其盐具有式（I）所示的结构：R1‑Ser‑Thr‑Pro‑R2（I）。具体涉及所述肽衍生物或其盐、或它们的组合物、以及它们在制备用于抗衰、修护、恢复昼夜节律、再同步皮肤细胞生物钟的组合物中的用途，亦可用于制备Clock蛋白激活剂。

Description

一种三肽衍生物及其组合物和用途
技术领域
本发明涉及一种肽衍生物、包含该肽衍生物的组合物及其用途。
背景技术
皮肤作为人体最大和最重要的器官，在一天24小时内，其状态会随着时间、昼夜的推移而表现出明显的昼夜节律。在白天，受日间节律时钟基因（如Per、Cry）调控，皮肤进入“防御”模式，皮肤屏障功能、皮脂分泌量、皮质醇、皮肤含水量和表皮弱酸性升高，帮助皮肤抵御外界刺激伤害；而在夜晚，受夜间节律时钟基因（如Bmal、Clock）调控，皮肤进入“修复”模式，皮脂产生下降，皮肤通透性、毛细血管血流量、基底细胞活跃度、细胞增殖、DNA修复能力增强。一些内源性或环境因素会使皮肤的生物节律发生改变，出现幅度降低及相位超前的倾向，导致皮肤的白天屏障功能和夜间修复功能变差，从而表现出衰老迹象。
角质形成细胞是表皮的主要细胞类型，也是皮肤屏障功能中的关键。角质形成细胞可以产生许多角蛋白及黏多糖等物质，以保持皮肤完整性，其还能够参与获得性免疫，因此在皮肤物理屏障、免疫屏障中扮演着重要角色。此外，角质形成细胞的增殖、迁移是创面愈合过程中皮肤再上皮化的基础。成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，也是真皮重要组成细胞之一，能够合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白等基质成分，生成胶原纤维、网状纤维和弹性纤维。成纤维细胞在创伤修复过程中起着重要的作用，通过大量增殖，合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，进行组织修复，并与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。
因此，调节皮肤昼夜节律相关基因表达，促进角质形成细胞和成纤维细胞增殖，增加胶原蛋白的合成和分泌，有利于抗衰修护。
近年来，植物中的许多酚酸作为抗氧化剂被用于各种化妆品中。常见的酚酸主要有两大类：肉桂酸衍生物和苯甲酸衍生物。肉桂酸衍生物包括阿魏酸、咖啡酸等，苯甲酸衍生物有没食子酸等。其中，阿魏酸（Ferulic Acid，CAS号：1135-24-6顺式；537-98-49反式），又名3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，通常所说的阿魏酸是指反式阿魏酸。阿魏酸在阿魏、当归、川芎、升麻、酸枣仁等中药材中的含量较高，其能有效捕获氧自由基，中断链式反应，从而清除自由基，保护机体免受氧化损伤，延缓衰老。咖啡酸（Caffeic Acid，CAS号：331-39-5），又名3, 4-二羟基肉桂酸，普遍存在于咖啡饮品、苹果、蓝莓等各类食物中。咖啡酸具有良好的抗氧化活性，能够保护皮肤免受紫外线照射损伤。没食子酸（Gallic Acid，CAS号：149-91-7），学名为3, 4, 5-三羟基苯甲酸，广泛存在于掌叶大黄、大叶桉、山茱萸等植物中。没食子酸作为自由基清除剂，在化工、医药、食品等领域有广泛的应用。
在现有技术的基础上，进一步研究得到一种具有多种生理活性、更加安全高效的活性物，以满足当代人们日益增长的皮肤护理需求，具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种三肽衍生物，这些肽衍生物及含有这些肽衍生物的组合物，具有抗衰、修护、恢复昼夜节律、再同步皮肤细胞生物钟等多种作用，亦可用于制备Clock蛋白激活剂。
鉴于此，本发明提供一种式（I）所示的肽衍生物、或其立体异构体、或其立体异构体的混合物、或其盐，
R1-Ser-Thr-Pro-R2（I）
式（I）中，
R1选自：FA-或R3-CO-，其中R3选自：取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基；所述FA-是
，
R2选自：-NR4R5或-OR4，其中各个R4和R5彼此独立地选自：H、取代的或未取代的烷基、取代的或未取代的烯基；
所述烷基是指具有1-24个碳原子（可选具有1-16个碳原子；可选具有1-14个碳原子；可选具有1-12个碳原子；可选具有1、2、3、4、5、或6个的碳原子）的饱和脂肪族直链或支链的烷基；可选选自：甲基、乙基、异丙基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、2-乙基己基、2-甲基丁基、或5-甲基己基；
所述烯基是指具有2-24个碳原子（可选具有2-16个碳原子；可选具有2-14个碳原子；可选具有2-12个碳原子；可选具有2、3、4、5、或6个碳原子）的直链或支链烯基；所述烯基具有一个或多个碳-碳双键，可选具有1、2或3个共轭或非共轭的碳-碳双键；所述烯基是通过一个单键而结合至分子的其余部分；可选选自：乙烯基、油烯基、或亚油烯基；
可选地，所述“取代的烷基”、“取代的烯基”中的取代基选自C1-C4烷基；羟基；C1-C4烷氧基；氨基；C1-C4氨基烷基；C1-C4羰氧基；C1-C4氧基羰基；卤素（如氟、氯、溴、以及碘）；氰基；硝基；叠氮化物；C1-C4烷基磺酰基；硫醇；C1-C4烷硫基；C6-C30芳氧基如苯氧基；-NRb(C=NRb)NRbRc，其中Rb和Rc是独立地选自：H、C1-C4烷基、C2-C4烯基、C2-C4炔基、C3-C10环烷基、C6-C18芳基、C7-C17芳烷基、具有三至十元的杂环基、或氨基的保护基。
可选地，R1选自：阿魏酰基（FA-）、乙酰基、叔-丁酰基、己酰基、2-甲基己酰基、辛酰基、癸酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基、油酰基或亚油酰基；R4、R5彼此独立地选自：H、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基；
可选地，R1选自阿魏酰基（FA-）、乙酰基、月桂酰基、肉豆蔻酰基或棕榈酰基；R4是H并且R5选自：H、甲基、乙基、己基、十二烷基或十六烷基；
可选地，R1是阿魏酰基（FA-）；R2是-OH或-NH2。
可选地，式（I）所示的肽衍生物、或其立体异构体、或其立体异构体的混合物、或其盐，选自下列肽衍生物（1）：
（1）FA-Ser-Thr-Pro-NH2。
本发明的式（I）所示的肽衍生物可以作为立体异构体或立体异构体的混合物存在；例如，其所包含的这些氨基酸可以具有L-、D-的构型、或彼此独立地是外消旋的。因此，有可能获得同分异构混合物以及外消旋混合物或非对映混合物、或纯的非对映异构体或对映异构体，这取决于不对称碳的数量和存在什么同分异构体或同分异构混合物。本发明的式（I）所示的肽衍生物的优选的结构是纯的同分异构体，即，对映异构体或非对映异构体。天然存在的L-异构体可以是优选的。
本发明还包括式（I）所示的肽衍生物的所有合适的同位素变体。本发明的这些肽衍生物的同位素变体此处理解为是指这样的化合物：其中在本发明的肽衍生物内至少一个原子被替换为相同原子序数的另一个原子，但所述另一原子的原子质量不同于自然界中通常或主要存在的原子质量。可掺入本发明的肽衍生物中的同位素的实例是：氢、碳、氮或氧的那些，例如2H(氘)、3H(氚)、13C、14C、15N、17O或18O。本发明的肽衍生物的特定的同位素变体（特别是其中已经掺入一种或多种放射性同位素的那些）可能有利于，例如检查在体内的作用机理或活性化合物的分布；由于相对简单的可制备性和可检测性，尤其是用3H或14C同位素标记的化合物适用于该目的。另外，由于化合物的更强的代谢稳定性，同位素（例如氘）的掺入可以产生特定的治疗益处，例如体内半衰期的延长或所需活性剂量的降低；因此，在某些情况下，本发明的肽衍生物的这种改性还可构成本发明的优选实施方案。通过本领域技术人员已知的方法，例如通过在下文中进一步描述的方法和在实施例中所述的方法，通过使用各自的试剂和/或起始物质的相应的同位素改性物，可制备本发明的肽衍生物的同位素变体。
术语“盐”指被认可的在动物，并且更确切地说在人类中使用的一种盐，包括式（I）所示的肽衍生物的金属盐，所述金属包括，但不局限于：锂、钠、钾、钙、镁、锰、铜、锌或铝等；包括式（I）所示的肽衍生物与有机碱形成的盐，所述有机碱包括，但不局限于：乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸或哌嗪等；包括式（I）所示的肽衍生物与无机酸或有机酸形成的盐，所述有机酸包括，但不局限于：乙酸、柠檬酸、乳酸、丙二酸、马来酸、酒石酸、延胡索酸、苯甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、琥珀酸、油酸、三氟乙酸、草酸、扑酸（pamoate）或葡萄糖酸等；所述无机酸包括，但不局限于：盐酸、硫酸、硼酸或碳酸。
本发明式（I）所示的肽衍生物、或其立体异构体或其盐的合成可以根据现有技术中已知的常规方法来进行，例如固相合成法、液相合成法或固相与液相结合的方法，还可以通过以产生所希望的序列为目标的生物技术方法、或通过具有动物、真菌、或植物来源的蛋白质的控制水解来制备。
例如，一种获得式（I）所示的肽衍生物的方法包括以下步骤：
-将具有受保护的N-末端和自由的C-末端的氨基酸与具有自由的N-末端和受保护的或与固体载体结合的C-末端的氨基酸偶联；
-消除保护N-末端的基团；
-重复该偶联顺序和消除保护N-末端的基团，直到获得所希望的肽序列；
-消除保护C-末端的基团或从该固体载体裂解。
优选地，C-末端与一种固体载体结合并且该方法是在固相上进行，包括将具有受保护的N-末端和自由的C-末端的氨基酸与具有自由的N-末端和与一种聚合物载体结合的C-末端的氨基酸偶联；消除保护N-末端的基团；并且重复此顺序所需要的次数以便因此获得具有所希望的长度的肽，接着从最初的聚合物载体裂解所合成的肽。
在整个合成中这些氨基酸的侧链的官能团用临时或永久的保护基团保持充分地保护，并且可以与从该聚合物载体裂解肽的过程同时地或正交地脱保护。
可选地，固相合成可以通过汇集策略（convergent strategy）来进行。
使用本领域已知的标准条件和方法对N-末端和C-末端脱保护和/或以非确定的次序从聚合物支持体裂解肽，随后可以修饰所述末端的官能团。可以对与聚合物支持体结合的肽进行N-末端和C-末端的任选的修饰，或在肽已从聚合物支持体裂解后进行N-末端和C-末端的任选的修饰。
本发明的另一方面，提供一种组合物，包括有效量的上述式（I）所示的肽衍生物、或其立体异构体、或其立体异构体的混合物、或其盐，以及至少一种赋形剂和任选的佐剂。
可选地，所述佐剂选自：激活Clock表达的剂、镇痛剂、抑制PAR-2活性的剂、胶原合成刺激剂、调节PGC-1α合成的剂、调节PPARγ的活性的剂、增加或减少脂肪细胞的甘油三酸酯含量的剂、刺激或延迟脂肪细胞分化的剂、脂解剂或刺激脂肪分解的剂、溶脂剂、生脂剂、乙酰胆碱受体聚集的抑制剂、抑制肌肉收缩的剂、抗胆碱能试剂、弹性蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、黑色素合成刺激或抑制剂、增白剂或脱色剂、促色素沉着剂、自晒黑剂、抗老化剂、NO-合酶抑制剂、5α-还原酶抑制剂、赖氨酰羟化酶和/或脯氨酰羟化酶的抑制剂、抗氧化剂、自由基清除剂和/或抗大气污染的剂、活性羰基类物质清除剂、抗糖化剂、抗组胺剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂、乳化剂、润肤剂、有机溶剂、液体推进剂、皮肤调理剂、保留水分的物质、α羟基酸、β羟基酸、增湿剂、表皮水解酶、维生素、氨基酸、蛋白质、色素、染料、生物聚合物、胶凝聚合物、增稠剂、表面活性剂、软化剂、粘合剂、防腐剂、抗皱剂、能够减少或治疗下眼袋的剂、角质层分离剂、抗微生物剂、抗真菌剂、抑真菌剂、灭菌剂、抑菌剂、刺激真皮或表皮大分子的合成和/或能够抑制或预防它们的降解的剂、刺激弹性蛋白合成的剂、刺激核心蛋白聚糖合成的剂、刺激层粘连蛋白合成的剂、刺激防御素合成的剂、刺激伴侣蛋白合成的剂、刺激cAMP合成的剂、刺激HSP70合成的剂、刺激热休克蛋白合成的剂、刺激透明质酸合成的剂、刺激纤连蛋白合成的剂、刺激去乙酰化酶合成的剂、刺激脂质和角质层组分的合成的剂、神经酰胺、脂肪酸、抑制胶原降解的剂、抑制弹性蛋白降解的剂、抑制丝氨酸蛋白酶的剂、刺激成纤维细胞增殖的剂、刺激角质形成细胞增殖的剂、刺激脂肪细胞增殖的剂、刺激黑色素细胞增殖的剂、刺激角质形成细胞分化的剂、抑制乙酰胆碱酯酶的剂、皮肤松弛剂、刺激糖胺聚糖合成的剂、抗角化过度剂、粉刺溶解剂、抗银屑病剂、抗湿疹剂、DNA修复剂、DNA防护剂、稳定剂、止痒剂、用于治疗和/或护理敏感性皮肤的剂、固化剂、紧致剂、重构剂、抗拉伸纹剂、调节皮脂产生的剂、止汗剂、刺激愈合的剂、协助愈合的剂、刺激再上皮化的剂、协助再上皮化的剂、细胞因子、镇静剂、抗炎剂、麻醉剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的剂、刺激血管生成的剂、抑制血管渗透性的剂、静脉紧张剂、作用于细胞代谢的剂、用于改善真皮-表皮接合的剂、诱导毛发生长的剂、毛发生长抑制或延缓剂、香料、螯合剂、植物提取物、精油、海洋提取物、得自生物发酵过程的剂、无机盐、细胞提取物、防晒剂、以及有效抗A和/或B紫外线的有机或无机光防护剂或其混合物。
本发明的肽衍生物根据它们的序列的性质或N-末端和/或C-末端中的任何可能的修饰，在水中具有可变的溶解度。因此本发明的肽衍生物可以通过水溶液掺入组合物中，且不溶于水的那些可溶解于常规溶剂中，所述溶剂例如并且不限于乙醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、甘油、丁二醇或聚乙二醇或其任何组合。
待施用的有效量的本发明的肽衍生物以及它们的剂量将依赖于许多因素，包括年龄、患者的状态、状况的严重性、施用的途径和频率以及待使用的肽衍生物的具体性质。
“有效量”意指无毒性的但足以提供希望的效果的本发明的一种或多种肽衍生物的量。在本发明的组合物中以获得希望的效果的有效的浓度使用本发明的肽衍生物；在一个优选形式中，相对于组合物的总重量，在0.00000001%（按重量计）和20%（按重量计）之间，优选在0.000001%（按重量计）和15%（按重量计）之间、更优选在0.0001%（按重量计）和10%（按重量计）之间，并且甚至更优选在0.0001%（按重量计）和5%（按重量计）之间。
本发明的另一方面，提供一种递送系统或缓释系统，以便实现有效成分的更好渗透和/或改进它的药物代谢动力学和药效动力学特性，其包含有效量的上述式（I）所示的肽衍生物、或其立体异构体、或其立体异构体的混合物、或其盐、或上述的组合物。
术语“递送系统”是指与本发明的肽衍生物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体，它们选自：水、油或表面活性剂、包括石油来源、动物来源、植物来源、或合成来源的那些，例如并且不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、蓖麻油、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、醚硫酸酯、硫酸酯、甜菜碱、葡萄糖苷、麦芽糖苷、脂肪醇、壬苯醇醚、泊洛沙姆、聚氧乙烯、聚乙二醇、右旋糖、甘油、毛地黄皂苷和类似物。本领域的普通技术人员已知在可以给予本发明的肽衍生物的不同递送系统中可以使用的稀释剂。
术语“缓释”以常规含义使用，指提供化合物在一段时间内逐渐释放的化合物的递送系统，且优选地但不是必须地，在整个时间段内具有相对恒定的化合物释放水平。
递送系统或缓释系统的实例是脂质体、油质体、醇质体、毫米胶囊、微米胶囊、纳米胶囊、纳米结构的脂质载体、海绵状物、包合物、类脂囊泡、胶束、毫米球、微米球、纳米球、脂质球、微米乳液、纳米乳液、毫米粒子、微米粒子或纳米粒子。
本发明的另一方面，提供一种化妆品，包含有效量的上述式（I）所示的肽衍生物、或其立体异构体、或其立体异构体的混合物、或其盐、或上述的组合物、或上述的递送系统或缓释系统。
可选地，所述化妆品的剂型包括膏霜、乳液、凝胶、粉剂、片剂、膜剂、气雾剂或喷雾剂。
本发明的另一方面，提供一种上述式（I）所示的肽衍生物、或其立体异构体、或其立体异构体的混合物、或其盐、或上述的组合物、或上述的递送系统或缓释系统在制备用于护理或治疗皮肤或粘膜的组合物中的用途。
本发明的另一方面，提供一种上述式（I）所示的肽衍生物、或其立体异构体、或其立体异构体的混合物、或其盐、或上述的组合物、或上述的递送系统或缓释系统在制备用于抗衰的组合物中的用途。
本发明的另一方面，提供一种上述式（I）所示的肽衍生物、或其立体异构体、或其立体异构体的混合物、或其盐、或上述的组合物、或上述的递送系统或缓释系统在制备用于修护的组合物中的用途。
本发明的另一方面，提供一种上述式（I）所示的肽衍生物、或其立体异构体、或其立体异构体的混合物、或其盐、或上述的组合物、或上述的递送系统或缓释系统在制备用于恢复昼夜节律、再同步皮肤细胞生物钟的组合物中的用途。
本发明的另一方面，提供一种上述式（I）所示的肽衍生物、或其立体异构体、或其立体异构体的混合物、或其盐、或上述的组合物、或上述的递送系统或缓释系统在制备Clock蛋白激活剂中的用途。
本发明的另一方面，提供一种上述式（I）所示的肽衍生物、或其立体异构体、或其立体异构体的混合物、或其盐、或上述的组合物、或上述的递送系统或缓释系统在制备用于提高细胞活性和/或促进细胞增殖的组合物中的用途，或在制备用于改善皮肤屏障功能的组合物中的用途，或在制备用于促进皮肤或粘膜的再上皮化或愈合的组合物中的用途，或在制备用于促进胶原蛋白合成的组合物中的用途，或在制备用于增加皮肤弹性和/或提高皮肤紧致度的组合物中的用途，或在制备用于促进Clock基因表达的组合物中的用途。
本发明的另一方面，提供一种上述式（I）所示的肽衍生物、或其立体异构体、或其立体异构体的混合物、或其盐、或上述的组合物、或上述的递送系统或缓释系统在制备化妆品中的用途。
为了便于理解本发明，对在本发明所使用的一些术语和表述的含义说明如下：
在本发明中，术语“皮肤”应理解为是构成它的多个层，从最上层或角质层至最下层或皮下组织，两个端点都包括在内。这些层由不同类型的细胞组成，如角质形成细胞、成纤维细胞、黑色素细胞、和/或脂肪细胞等。在本发明中，术语“皮肤”包括头皮。
在本说明书中，用于氨基酸的缩写遵循IUPAC-IUB生化命名委员会（IUPAC-IUBCommission of Biochemical Nomenclature）在欧洲生物化学杂志（Eur. J. Biochem.1984, 138: 9-37）中所指定的规则。
因此，例如，Ser表示NH2-CH(CH2OH)-COOH，Ser-表示NH2-CH(CH2OH)-CO-，-Ser表示-NH-CH(CH2OH)-COOH，并且-Ser-表示-NH-CH(CH2OH)-CO-。因此，表示肽衍生物键的连字符消除了当位于该符号的右侧时的氨基酸（在此用常规非离子化形式来表示）1-羧基中的OH，并且消除了当位于该符号的左侧时的氨基酸2-氨基中的H；两种修饰可以应用于同一个符号（见表1）。
表1 氨基酸残基的结构以及它们的单字母和三字母缩写符号
缩写“FA-”在本发明中用来表示阿魏酰基；FA：阿魏酸；Ser：丝氨酸；Thr：苏氨酸；Pro：脯氨酸。
本发明具有以下优点和效果：
1、本发明的肽衍生物通过人工设计得到，合成方便，且对人体安全无刺激。
2、本发明的肽衍生物能够提高细胞活性、促进细胞增殖、改善皮肤屏障功能、促进皮肤或粘膜的再上皮化或愈合、促进胶原蛋白合成、增加皮肤弹性、提高皮肤紧致度，具有抗衰、修护作用。
3、本发明的肽衍生物能够激活皮肤昼夜节律周期调节基因及Clock等相关蛋白的表达，调节皮肤昼夜节律，再同步皮肤细胞生物钟，增强细胞活力，修复受损细胞，缓解皮肤衰老迹象，在化妆品或医药领域具有广泛应用，亦可用于制备Clock蛋白激活剂。
4、本发明将STP多肽与阿魏酸通过酰胺键连接，结果出人意料地发现，相较于STP多肽、阿魏酸、两者的物理混合物以及其他酚酸修饰的肽衍生物，本发明的三肽衍生物取得了预料不到的技术效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面将对本发明的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是肽衍生物（1）FA-Ser-Thr-Pro-NH2的质谱图。
具体实施方式
为使本发明的所述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明中所使用的实验试剂及材料均可通过市售获得。以下为部分试剂及材料的缩写：
Amide Resin：一种多肽合成用的起始树脂（交联度1%，替代度1.72mmol/g，粒度100-200目）；Fmoc-Linker：4-[(2,4-二甲氧基苯基)(Fmoc-氨基)甲基]苯氧乙酸；Ac2O：醋酸酐；DMF：N,N-二甲基甲酰胺；DIPEA：二异丙基乙胺；DIC：二异丙基碳二亚胺；piperidine：哌啶；HOBt：1-羟基苯并三氮唑；TFA：三氟乙酸；TIS：三异丙基硅烷；EDT：1, 2-乙二硫醇；FA：阿魏酸；CA：咖啡酸；GA：没食子酸；Ser：丝氨酸；Thr：苏氨酸；Pro：脯氨酸；Fmoc：9-芴基甲氧羰基；tBu：叔丁基。
实施例1 FA-Ser-Thr-Pro-NH2的制备
1.1 Fmoc-Linker-Amide Resin的制备
称取5g的Amide Resin于固相合成反应柱中，用DMF溶胀，洗涤树脂，抽走溶剂。
称取7.1g的Fmoc-Linker、2.10g的HOBt于干燥三角瓶中。用DMF溶剂溶解后置于冰水浴中冷却10min，加DIC活化10min，避免水汽。
将活化后的Fmoc-Linker加入溶胀后的树脂中反应2.5h，抽走反应液，洗涤树脂，抽走溶剂。
继续加入Ac2O与DIPEA封端处理1.5h。洗涤树脂，抽走溶剂。
1.2 脱Fmoc
Fmoc-Linker-Amide Resin用20% piperidine/DMF脱Fmoc二次，每次10min，取样K检，显色深蓝。用DMF洗涤树脂7次，抽走溶剂。
1.3 投料反应
称取6.5g的Fmoc-Pro-OH，3.71g的HOBt加入干燥三角瓶中，加入DMF使其溶解，密封置于-18℃冰箱30min。加2.892g DIC活化3min，避免水汽。将活化后的氨基酸加入脱保护后树脂中反应2h，抽走反应液。K检树脂无色透明说明反应完全。
对N-末端Fmoc基团进行脱保护，并且在存在3.71g HOBt和2.892g DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，将活化后的7.7g的Fmoc-Thr(tBu)-OH偶联至肽基树脂上，持续反应2h。然后洗涤这些树脂并且重复Fmoc基团的脱保护处理以便偶联下一个氨基酸。在存在3.71gHOBt和2.892g DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，偶联9.5g的Fmoc-Ser(tBu)-OH。反应完全之后，洗涤树脂，抽走溶剂。
对肽基树脂的N-末端Fmoc基团脱保护，用20% piperidine/DMF脱Fmoc二次，每次10min，取样K检，显色深蓝。用DMF洗涤树脂6次，抽走溶剂。
在存在DIPEA的情况下，使用DMF作为溶剂，将6.5g的反式阿魏酸偶联至肽基树脂上，持续反应1.5h，洗涤树脂，抽走溶剂，收缩干燥后得到12.8g的FA-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Pro-Linker-Amide Resin。
1.4 裂解
量取76mL的TFA、2mL的TIS和2mL的水混合搅拌均匀后得到裂解液，封口放置-18℃冰箱备用；异丙醚放置于-18℃冰箱冷冻备用。
称取12.8g的FA-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Pro-Linker-Amide Resin，加入圆底烧瓶中，加入上述冷冻好的裂解液，搅拌反应2h。抽滤，收集滤液浓缩到15mL后加入异丙醚搅拌离心洗涤6次，真空干燥，得到4.4g的FA-Ser-Thr-Pro-NH2粗肽衍生物。
1.5 纯化
称取4.4g粗肽衍生物溶于210mL的甲醇：纯水（V：V=1：21）中，用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤得到澄清透明溶液，通过反相HPLC纯化处理，纯化梯度如下表：
时间（min） 流速（mL/min） A%（乙腈） B%（0.1%醋酸+纯水）
0 40 5 95
10 40 8 92
30 40 20 80
35 40 20 80
40 40 20 80
50 40 25 75
60 40 45 55
将过滤后的样品进样纯化，收集馏分，浓缩冻干，得到纯度91.81%的肽衍生物（1）FA-Ser-Thr-Pro-NH2。
实施例2 CA-Ser-Thr-Pro-NH2的制备
2.1 Fmoc-Linker-Amide Resin的制备
称取5g Amide Resin于固相合成反应柱中，用DMF溶胀，洗涤树脂，抽走溶剂。
称取7.1g的Fmoc-Linker、2.10g的HOBt于干燥三角瓶中。用DMF溶剂溶解后置于冰水浴中冷却10min，加DIC活化10min，避免水汽。
将活化后的Fmoc-Linker加入溶胀后的树脂中反应2.5 h，抽走反应液，洗涤树脂，抽走溶剂。
继续加入Ac2O与DIPEA封端处理1.5 h。洗涤树脂，抽走溶剂。
2.2 脱Fmoc
Fmoc-Linker-Amide Resin用20% piperidine/DMF脱Fmoc二次，每次10min，取样K检，显色深蓝。用DMF洗涤树脂7次，抽走溶剂。
2.3 投料反应
称取7.9g的Fmoc-Pro-OH，3.71g的HOBt加入干燥三角瓶中，加入DMF使其溶解，密封置于-18℃冰箱30min。加2.892g DIC活化3min，避免水汽。将活化后的氨基酸加入脱保护后树脂中反应2h，抽走反应液。K检树脂无色透明说明反应完全。
对N-末端Fmoc基团进行脱保护，并且在存在3.71g HOBt和2.892g DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，将活化后的7.6g Fmoc-Thr(tBu)-OH偶联至肽基树脂上，持续反应2h。然后洗涤这些树脂并且重复Fmoc基团的脱保护处理以便偶联下一个氨基酸。在存在3.71gHOBt和2.892g DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，偶联7.5g的Fmoc-Ser(tBu)-OH。反应完全之后，洗涤树脂，抽走溶剂。
对肽基树脂的N-末端Fmoc基团脱保护，用20% piperidine/DMF脱Fmoc二次，每次10min，取样K检，显色深蓝。用DMF洗涤树脂6次，抽走溶剂。
在存在DIPEA的情况下，使用DMF作为溶剂，将5.2g的CA偶联至肽基树脂上，持续反应1.5h，洗涤树脂，抽走溶剂，收缩干燥后得到11.3g的CA-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Pro-Linker-Amide Resin。
2.4 裂解
量取76mL的TFA、2mL的TIS和2mL的水混合搅拌均匀后得到裂解液，封口放置-18℃冰箱备用；异丙醚放置于-18℃冰箱冷冻备用。
称取11.3g CA-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Pro-Linker-Amide Resin，加入圆底烧瓶中，加入上述冷冻好的裂解液，搅拌反应2h。抽滤，收集滤液浓缩到15mL后加入异丙醚搅拌离心洗涤6次，真空干燥，得到3.7g的CA-Ser-Thr-Pro-NH2粗肽衍生物。
2.5 纯化
称取3.7g粗肽衍生物溶于180mL的甲醇：纯水（V : V=1 : 2）中，用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤得到澄清透明溶液，通过反相HPLC纯化处理，纯化梯度如下表：
时间（min） 流速（mL/min） A%（0.1%醋酸+乙腈） B%（0.1%醋酸+纯水）
0 40 5 95
10 40 8 92
30 40 20 80
35 40 20 80
40 40 20 80
50 40 30 70
将过滤后的样品进样纯化，收集馏分，浓缩冻干，得到纯度99.6%的肽衍生物（2）CA-Ser-Thr-Pro-NH2。
实施例3 GA-Ser-Thr-Pro-NH2的制备
3.1 Fmoc-Linker-Amide Resin的制备
称取5g Amide Resin于固相合成反应柱中，用DMF溶胀，洗涤树脂，抽走溶剂。
称取7.1g的Fmoc-Linker、2.10g的HOBt于干燥三角瓶中。用DMF溶剂溶解后置于冰水浴中冷却10min，加DIC活化10min，避免水汽。
将活化后的Fmoc-Linker加入溶胀后的树脂中反应2.5 h，抽走反应液，洗涤树脂，抽走溶剂。
继续加入Ac2O与DIPEA封端处理1.5 h。洗涤树脂，抽走溶剂。
3.2 脱Fmoc
Fmoc-Linker-Amide Resin用20% piperidine/DMF脱Fmoc二次，每次10min，取样K检，显色深蓝。用DMF洗涤树脂7次，抽走溶剂。
3.3 投料反应
称取6.5g的Fmoc-Pro-OH，3.71g的HOBt加入干燥三角瓶中，加入DMF使其溶解，密封置于-18℃冰箱30min。加2.892g DIC活化3min，避免水汽。将活化后的氨基酸加入脱保护后树脂中反应2h，抽走反应液。K检树脂无色透明说明反应完全。
对N-末端Fmoc基团进行脱保护，并且在存在3.71g HOBt和2.892g DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，将活化后的8.7g Fmoc-Thr(tBu)-OH偶联至肽基树脂上，持续反应2h。然后洗涤这些树脂并且重复Fmoc基团的脱保护处理以便偶联下一个氨基酸。在存在3.71gHOBt和2.892g DIC的情况下，使用DMF作为溶剂，偶联7.3g的Fmoc-Ser(tBu)-OH。反应完全之后，洗涤树脂，抽走溶剂。
对肽基树脂的N-末端Fmoc基团脱保护，用20% piperidine/DMF脱Fmoc二次，每次10min，取样K检，显色深蓝。用DMF洗涤树脂6次，抽走溶剂。
在存在DIPEA的情况下，使用DMF作为溶剂，将6.9g的GA偶联至肽基树脂上，持续反应1.5h，洗涤树脂，抽走溶剂，收缩干燥后得到11.9g的GA-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Pro-Linker-Amide Resin。
3.4 裂解
量取76mL的TFA、2mL的TIS和2mL的水混合搅拌均匀后得到裂解液，封口放置-18℃冰箱备用；异丙醚放置于-18℃冰箱冷冻备用。
称取11.9g GA-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Pro-Linker-Amide Resin，加入圆底烧瓶中，加入上述冷冻好的裂解液，搅拌反应2h。抽滤，收集滤液浓缩到15mL后加入异丙醚搅拌离心洗涤6次，真空干燥，得到3.3g的GA-Ser-Thr-Pro-NH2粗肽衍生物。
3.5 纯化
称取3.3g粗肽衍生物溶于200mL的纯水中，用孔径为0.22μm微孔滤膜过滤得到澄清透明溶液，通过反相HPLC纯化处理，纯化梯度如下表：
时间（min） 流速（mL/min） A%（0.1%醋酸+乙腈） B%（0.1%醋酸+纯水）
0 40 5 95
10 40 8 92
30 40 20 80
35 40 20 80
40 40 20 80
50 40 30 70
将过滤后的样品进样纯化，收集馏分，浓缩冻干，得到纯度99.1%的肽衍生物（3）GA-Ser-Thr-Pro-NH2。
实施例4
所获得的这些肽衍生物通过ESI-MS测定其分子量，肽衍生物（1）的测试结果见图1。结果显示，[2M+Na]+二聚体加和离子峰的质荷比（m/z）为979.3285，质谱测得的分子量为478.16。
实施例5 细胞增殖实验
5.1 试剂与材料
噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、高糖培养基（DMEM）、磷酸盐缓冲液（PBS）、胎牛血清。
5.2 仪器
酶标仪、CO2培养箱、超净工作台。
5.3 细胞株
人角质形成细胞（HaCaT）、人皮肤成纤维细胞（HSF）。
5.4 待测样品
样品组：肽衍生物（1）、肽衍生物（2）、肽衍生物（3）。
空白对照组：PBS。
阳性对照组：2%DMSO。
5.5 实验方法
分别取处于指数生长期状态良好的HaCaT细胞和HSF细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数1～4×105个/mL，制成细胞悬液。
取细胞悬液接种于96孔板上，200μL/孔，置恒温CO2培养箱中培养24h。
换液，分别加入待测样品，20μL/孔，置于37℃、5% CO2培养箱中孵育48h。
之后每孔加入20μL 5mg/mL MTT，继续于37℃、5% CO2培养箱中孵育4h。吸去上清液，加入150μL/孔的DMSO，置于平板摇床上振摇5min后，使用酶标仪在波长570nm处测定每孔的OD值，并计算细胞活性。
细胞活性=（测试样品孔OD-调零孔OD）/（空白对照孔OD-调零孔OD）×100%
5.6 结果
MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法，测得的OD值与细胞活性成正比。
测试样品对HaCaT细胞及HSF细胞活性的影响结果分别见表2及表3。结果表明，与空白对照组、肽衍生物（2）、肽衍生物（3）相比，本发明的肽衍生物（1）能够显著提高细胞的活性，促进细胞增殖。不同的肽衍生物的区别在于，肽链N-末端的修饰不同，肽衍生物（1）、（2）、（3）分别经FA、CA、GA修饰。尽管FA、CA、GA均为酚酸，但它们分别与同一多肽序列（Ser-Thr-Pro-NH2）的N-末端通过酰胺键连接后得到的化合物，表现出了明显不同的活性。采用FA修饰后，本发明的肽衍生物（1）产生了预料不到的技术效果，能够明显提高细胞活性，促进细胞增殖，有利于改善皮肤屏障功能，促进皮肤或粘膜的再上皮化或愈合，可用于抗衰、修护。
表2 测试样品对HaCaT细胞活性的影响结果（n=6，空白对照组为100%，阳性对照组为52.43%）
浓度 肽衍生物（1） 肽衍生物（2） 肽衍生物（3）
10ppm 125.60% 104.08% 97.83%
50ppm 133.73% 103.41% 97.38%
100ppm 126.50% 108.59% 78.00%
200ppm 126.28% 100.07% 42.77%
表3 测试样品对HSF细胞活性的影响结果（n=6，空白对照组为100%，阳性对照组为54.72%）
浓度 肽衍生物（1） 肽衍生物（2） 肽衍生物（3）
50ppm 109.61% 100.26% 97.06%
100ppm 112.18% 103.34% 19.45%
实施例6 光老化实验
6.1 试剂与材料
胎牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS）、高糖培养基（DMEM）、青霉素、链霉素、噻唑蓝（MTT）。
6.2 仪器
酶标仪、CO2培养箱、超净工作台。
6.3 细胞株
人皮肤成纤维细胞（HSF）。
6.4待测样品
多肽组：参比肽（Ser-Thr-Pro-NH2）、肽衍生物（1）、肽衍生物（2）、肽衍生物（3），测试浓度为100ppm。
空白对照组：PBS。
UV组：UV辐射，加PBS。
6.5 实验方法
取处于指数生长期状态良好的细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数1~4×105个/mL，制成细胞悬液。
适当稀释取10000个/孔细胞悬液接种于96孔板上，待细胞长满至80%左右时，建立UV光老化模型。空白对照组加50μL PBS，补充培养基至200μL，不进行UV照射；UV组和多肽组，加入适量PBS反复洗至无色后，加入50μL PBS，以80mJ/cm2 UV灯下照射，灯源和培养瓶间距15cm，经照射后，弃去PBS，UV组加入PBS溶液和培养基至200μL，多肽组加入培养液和相关浓度样品至200μL。空白对照组、UV组、多肽组继续于37℃、5% CO2培养箱中孵育24h。
之后每孔加入22μL 5mg/mL MTT，继续于37℃、5% CO2培养箱中孵育4h。弃去原溶液，加入150μL/孔的DMSO，置于平板摇床上振摇5min后，使用酶标仪读取490nm和630nm波长下的参比OD值。
6.6 结果
紫外线的照射会导致皮肤结构、功能和外观的改变，最终导致皮肤衰老。本实验选取80mJ/cm2 UV能量进行辐射建立皮肤光老化模型。
表4 测试样品对光老化细胞活性的影响（n=6，以UV组为100%，空白对照组为145.01%）
浓度 肽衍生物（1） 肽衍生物（2） 肽衍生物（3） 参比肽
100ppm 115.92% 102.69% 99.50% 104.89%
实验结果见表4。经UV辐射后，成纤维细胞活性显著下降。与未经修饰的参比肽、CA修饰的肽衍生物（2）、GA修饰的肽衍生物（3）相比，FA修饰的肽衍生物（1）能够明显地提高细胞活性，从而改善细胞老化，具有明显的抗光老化作用。由此可知，并非针对参比肽N-末端的任意酚酸修饰均能够产生或提高抗光老化的作用，本发明的肽衍生物取得了预料不到的技术效果。
实施例7 胶原蛋白含量测试
7.1 试剂与材料
胎牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS）、高糖培养基（DMEM）、胰蛋白酶、RIPA裂解液、BCA蛋白试剂盒、胶原蛋白I ELISA试剂盒。
7.2 仪器
酶标仪、CO2培养箱、超净工作台。
7.3 细胞株
人皮肤成纤维细胞（HSF）。
7.4 待测样品
多肽组：参比肽（Ser-Thr-Pro-NH2）、肽衍生物（1）、肽衍生物（2）、肽衍生物（3）、FA、FA与参比肽的混合物（重量比1:1），上述样品的测试浓度为25ppm。
空白对照组：PBS。
UV组：UV辐射，加PBS。
7.5 实验方法
取处于指数生长期状态良好的HSF细胞，加入0.25%胰蛋白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数1～4×106个/mL，制成细胞悬液。
按照105个/孔接种于6孔板上，直至细胞长满至80%左右时建立UV光老化模型。空白对照组加200μL PBS，补充培养基至800μL，不进行UV照射；UV组和多肽组，加入适量PBS反复洗至无色后，加入200μL PBS，置于80mJ/cm2 UV灯下照射，灯源和培养瓶间距15cm。经照射后，弃去PBS，UV组加入PBS溶液和培养基至800μL，多肽组加入培养基和相关浓度样品至800μL。空白对照组、UV组、多肽组继续于37℃、5% CO2培养箱中孵育48h。
培养结束后使用细胞刮刮掉细胞，吹打混匀，使用RIPA提取细胞蛋白，BCA定量到1mg/mL，按照胶原蛋白I ELISA操作说明书进行操作。15min内用酶标仪在450nm处测量各孔的OD值。
7.6 实验结果
胶原蛋白是结缔组织中发现的最丰富的蛋白质，提升胶原蛋白含量对于预防衰老、增加皮肤饱满和紧致度具有重要作用。在紫外线过暴环境中，胶原蛋白酶和弹性蛋白酶活性大幅增加，弹性蛋白水解，胶原蛋白的合成也受到抑制。本实验采用测试样品处理经紫外线辐射后的细胞，检测相应细胞中的胶原蛋白I含量，以确定本发明的肽衍生物能否促进胶原蛋白生成。
表5 测试样品对胶原蛋白I含量的影响结果（n=4，以UV组为100%，空白对照组为146.09%）
浓度 肽衍生物（1） 参比肽 FA FA与参比肽的混合物（重量比1:1） 肽衍生物（2） 肽衍生物（3）
25ppm 127.36% 93.04% 92.09% 94.36% 82.38% 84.90%
测试样品对胶原蛋白含量的影响结果见表5。结果显示，与空白对照组相比，经紫外线辐射后，UV组的胶原蛋白含量大幅降低。与UV组相比，参比肽、FA、FA与参比肽的混合物（重量比1:1）、肽衍生物（2）、肽衍生物（3）均不能提高经紫外线辐射后的细胞中的胶原蛋白含量。相比之下，本发明的肽衍生物（1）能够显著提高经紫外线辐射后的细胞中的胶原蛋白含量，具有优异的促进胶原蛋白生成的效果，可以增加皮肤弹性，提高皮肤紧致度。由此可知，本发明将STP多肽与阿魏酸通过酰胺键连接，相较于STP多肽、阿魏酸、两者的物理混合物以及其他酚酸修饰的肽衍生物，本发明的肽衍生物取得了预料不到的技术效果。
实施例8 Clock基因表达检测
8.1 试剂与材料
磷酸盐缓冲液（PBS）（Gibco）、二甲基亚砜（DMSO）（Sigma）、高糖培养基（DMEM）（Gibco）、胎牛血清（Gibco）、RNA提取液（武汉赛维尔生物科技有限公司）、SweScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (One-Step gDNA Remover)（武汉赛维尔生物科技有限公司）、2×SYBR Green qPCR Master Mix (None ROX)（武汉赛维尔生物科技有限公司）、引物（武汉赛维尔生物科技有限公司）。
8.2 仪器
二氧化碳培养箱（上海一恒）、超净工作台（苏净）、生物倒置显微镜（重庆光电）、酶标仪（美国MD）、荧光正置显微镜（广州明美）、台式高速冷冻型微量离心机（DragonLab）、涡旋混匀仪（武汉赛维尔生物科技有限公司）、掌上离心机（武汉赛维尔生物科技有限公司）、荧光定量PCR仪（Bio-rad）、PCR仪（北京东胜创新生物科技有限公司）、干式恒温金属浴（武汉赛维尔生物科技有限公司）、超微量分光光度计（Thermo）、封膜仪（智能型）（武汉赛维尔生物科技有限公司）。
8.3 细胞株
人皮肤成纤维细胞（HSF）。
8.4待测样品
多肽组：参比肽（Ser-Thr-Pro-NH2）、肽衍生物（1），上述样品测试浓度均为25ppm。
对照组：PBS。
模型组：UVA照射。
8.5 实验方法
8.5.1 细胞给药及收集
（1）实验前处理：成纤维细胞复苏并将细胞培养至3cm培养皿中直至细胞数量达到18皿。
（2）实验分组：将18皿细胞分为三组，分别为对照组，模型组和多肽组（n=6次×3）。
（3）同步化处理：使用100 nM的地塞米松对成纤维细胞处理30min，使其具有与正常细胞相同的节律。
（4）建模：倒掉含有地塞米松的培养基，PBS清洗细胞后；加入适量PBS覆盖培养皿，对照组不照射，模型组及多肽组用UVA照射4h，使其偏离正常细胞的节律。随后倒掉PBS加入完全培养基于培养箱中培养6 h。
（5）加样：加入相应的测试样品。
（6）收集细胞：分别在加样后的不同时间收集细胞。收集细胞时，倒掉培养基，加胰酶消化后，终止消化并离心得细胞沉淀。随后倒掉沉淀，每孔加500 μL PBS洗涤细胞，离心，弃上清，并于-80℃冰箱保存。
8.5.2 总RNA抽提（枪头和离心管均使用无菌无酶款）
（1）用微量移液器将培养瓶/板中培养液吸除干净，加入1mL 4℃预冷的PBS溶液，轻摇洗涤。用微量移液器将PBS吸除干净。
（2）加入1mL的RNA提取液，轻缓振荡或用枪头吹打，破碎细胞。
（3）将液体转移到灭过菌的1.5 mL离心管内。
（4）加入400 μL三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。
（5）4℃下，12000rpm离心10min。
（6）将400 μL上清转移到一新的离心管中，加入550 μL异丙醇，颠倒混匀。-20℃放置15min。
（7）4℃下，12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。
（8）吸除液体，加入75%乙醇1.5 mL洗涤沉淀。
（9）4℃下，12000rpm离心10min。
（10）将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。
（11）加入15 μL Water Nuclease-Free溶解RNA。
（12）使用Nanodrop 2000检测RNA浓度及纯度：仪器空白调零后取2.5 μL待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测。
（13）将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200 ng/μL。
8.5.3 反转录（枪头和PCR管均使用无菌无酶款）
（1）反转录反应体系配制（20 μL反应体系，试剂盒货号G3337）
成分 体积
5×SweScript All-in-One SuperMix for qPCR 4 μL
gDNA Remover 1 μL
Total RNA 10 μL
RNase free water Add to 20 μL
（2）轻轻混匀并离心
（3）反转录程序设置，于普通PCR仪上完成反转录
温度 时间
25℃ 5 min
42℃ 30 min
85℃ 5 sec
8.5.4 PCR定量
（1）取0.1mL PCR反应板，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。点完样用PCR封板膜配合封膜仪完成封膜
成分 体积
2×SYBR Green qPCR Master Mix (None ROX) 7.5μL
2.5μM基因引物（上游+下游） 1.5μL
反转录产物（cDNA） 2.0μL
Water Nuclease-Free 4.0μL
（2）PCR扩增，于荧光定量PCR仪上完成扩增
Stage1 Stage2（40个循环） Stage3（熔解曲线）
95℃，30s 预变性 95℃，15s 变性60℃，30s 退火/延伸 65℃→95℃每升温0.5℃，采集一次荧光信号
8.5.5 结果处理
ΔΔCT法：
A=CT(目的基因，待测样本) - CT(内标基因，待测样本)
B=CT(目的基因，对照样本) - CT(内标基因，对照样本)
K=A-B
表达倍数=2-K
8.6 实验结果
生物节律是指机体的活动随时间的变化所表现出来的规律，是生命体活动的重要特征之一。目前研究最多的生物节律是昼夜节律。Clock基因是研究昼夜节律相关动作的主要基因。人体内部的生物钟系统受到紫外线等外界因素干扰会导致昼夜节律紊乱，从而影响代谢活动，使修复功能变差，进而表现出衰老迹象，在基因层面表现为Clock等时钟基因表达异常。
表6 测试样品对Clock基因表达的影响（8h的表达倍数）
浓度 UVA 肽衍生物（1） 参比肽
25ppm 1.29 1.98 1.40
测试样品对Clock基因表达的影响见表6。结果显示，本发明的肽衍生物（1）能够明显提高经UVA辐射后的细胞中Clock基因的表达，且具有比参比肽更优的技术效果。
因此，本发明的肽衍生物能够激活皮肤昼夜节律周期调节基因及Clock等相关蛋白的表达，调节皮肤昼夜节律，再同步皮肤细胞生物钟，增强细胞活力，修复受损细胞，缓解皮肤衰老迹象，在化妆品或医药领域具有广泛应用，亦可用于制备Clock蛋白激活剂。
实施例9 含肽衍生物（1）的组合物的制备
成分 以重量计%
辛甘醇 0.5
肽衍生物（1） 0.05
水 99.45
制备方法：称取处方量的肽衍生物（1）置于容器中，再加入水，搅拌使其充分溶解，最后加入辛甘醇，搅拌均匀，即得。
实施例10 含肽衍生物（1）的化妆品的制备
成分 以重量计%
透明质酸钠 0.05
丁二醇 3.00
黄原胶 0.10
1, 2-戊二醇 2.00
1, 2-己二醇 0.50
海藻糖 2.00
肽衍生物（1） 0.03
水 适量至100
制备方法：水搅拌加热至85℃，保温30min；将透明质酸钠、黄原胶预溶于丁二醇，加入水中，搅拌溶解完全；搅拌降温至35℃，加入剩余成分，搅拌均匀即得。
实施例11 含肽衍生物（1）组合物的化妆品的制备
成分 以重量计%
丙二醇 1.0
尿囊素 0.3
甘油 1.0
透明质酸钠 0.1
实施例9含肽衍生物（1）的组合物 0.005
防腐剂 0.5
香精 0.5
水 适量至100
制备方法：将尿囊素、甘油用水溶解，加热至85℃，保温30分钟；将透明质酸钠加入水中，搅拌使混合均匀，然后加热到80~85℃，保温搅拌使其分散均匀；上述溶液冷却后混合，搅拌均匀，得混合溶液；将含肽衍生物（1）的组合物、丙二醇、防腐剂、香精依次加入上述混合溶液，加水搅拌均匀，即得。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
最后，还需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的相同要素。
以上对本发明所提供的一种三肽衍生物及其组合物和用途，进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (15)

1.式（I）所示的肽衍生物或其盐，
R1-Ser-Thr-Pro-R2（I）
式（I）中，
R1是FA-，所述FA-是
，
R2是-OH或-NH2。
2.根据权利要求1所述的式（I）所示的肽衍生物或其盐，其特征在于，选自下列肽衍生物（1）：
（1）FA-Ser-Thr-Pro-NH2。
3.根据权利要求1-2任一项所述的式（I）所示的肽衍生物或其盐，其特征在于，
所述盐包括式（I）所示的肽衍生物的金属盐，所述金属包括：锂、钠、钾、钙、镁、锰、铜、锌或铝；
或者，所述盐包括式（I）所示的肽衍生物与有机碱形成的盐，所述有机碱包括：乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸或哌嗪；
或者，所述盐包括式（I）所示的肽衍生物与无机酸或有机酸形成的盐，所述有机酸包括：乙酸、柠檬酸、乳酸、丙二酸、马来酸、酒石酸、延胡索酸、苯甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、琥珀酸、油酸、三氟乙酸、草酸、扑酸或葡萄糖酸；所述无机酸包括：盐酸、硫酸、硼酸或碳酸。
4.一种组合物，其特征在于，包括有效量的权利要求1-3任一项所述的式（I）所示的肽衍生物或其盐，以及至少一种赋形剂和任选的佐剂。
5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述佐剂选自：激活Clock表达的剂、镇痛剂、抑制PAR-2活性的剂、胶原合成刺激剂、调节PGC-1α合成的剂、调节PPARγ的活性的剂、增加或减少脂肪细胞的甘油三酸酯含量的剂、刺激或延迟脂肪细胞分化的剂、脂解剂或刺激脂肪分解的剂、溶脂剂、生脂剂、乙酰胆碱受体聚集的抑制剂、抑制肌肉收缩的剂、抗胆碱能试剂、弹性蛋白酶抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、黑色素合成刺激或抑制剂、增白剂或脱色剂、促色素沉着剂、自晒黑剂、抗老化剂、NO-合酶抑制剂、5α-还原酶抑制剂、赖氨酰羟化酶和/或脯氨酰羟化酶的抑制剂、抗氧化剂、自由基清除剂和/或抗大气污染的剂、活性羰基类物质清除剂、抗糖化剂、抗组胺剂、抗病毒剂、抗寄生虫剂、乳化剂、润肤剂、有机溶剂、液体推进剂、皮肤调理剂、保留水分的物质、α羟基酸、β羟基酸、增湿剂、表皮水解酶、维生素、氨基酸、蛋白质、色素、染料、生物聚合物、胶凝聚合物、增稠剂、表面活性剂、软化剂、粘合剂、防腐剂、抗皱剂、能够减少或治疗下眼袋的剂、角质层分离剂、抗微生物剂、抗真菌剂、抑真菌剂、灭菌剂、抑菌剂、刺激真皮或表皮大分子的合成和/或能够抑制或预防它们的降解的剂、刺激弹性蛋白合成的剂、刺激核心蛋白聚糖合成的剂、刺激层粘连蛋白合成的剂、刺激防御素合成的剂、刺激伴侣蛋白合成的剂、刺激cAMP合成的剂、刺激HSP70合成的剂、刺激热休克蛋白合成的剂、刺激透明质酸合成的剂、刺激纤连蛋白合成的剂、刺激去乙酰化酶合成的剂、刺激脂质和角质层组分的合成的剂、神经酰胺、脂肪酸、抑制胶原降解的剂、抑制弹性蛋白降解的剂、抑制丝氨酸蛋白酶的剂、刺激成纤维细胞增殖的剂、刺激角质形成细胞增殖的剂、刺激脂肪细胞增殖的剂、刺激黑色素细胞增殖的剂、刺激角质形成细胞分化的剂、抑制乙酰胆碱酯酶的剂、皮肤松弛剂、刺激糖胺聚糖合成的剂、抗角化过度剂、粉刺溶解剂、抗银屑病剂、抗湿疹剂、DNA修复剂、DNA防护剂、稳定剂、止痒剂、用于治疗和/或护理敏感性皮肤的剂、固化剂、紧致剂、重构剂、抗拉伸纹剂、调节皮脂产生的剂、止汗剂、刺激愈合的剂、协助愈合的剂、刺激再上皮化的剂、协助再上皮化的剂、细胞因子、镇静剂、抗炎剂、麻醉剂、作用于毛细血管循环和/或微循环的剂、刺激血管生成的剂、抑制血管渗透性的剂、静脉紧张剂、作用于细胞代谢的剂、用于改善真皮-表皮接合的剂、诱导毛发生长的剂、毛发生长抑制或延缓剂、香料、螯合剂、植物提取物、精油、海洋提取物、得自生物发酵过程的剂、无机盐、细胞提取物、防晒剂、以及有效抗A和/或B紫外线的有机或无机光防护剂或其混合物。
6.一种递送系统或缓释系统，其特征在于，包含有效量的权利要求1-3任一项所述的式（I）所示的肽衍生物或其盐、或权利要求4或5所述的组合物；
所述递送系统或缓释系统选自：脂质体、油质体、醇质体、毫米胶囊、微米胶囊、纳米胶囊、纳米结构的脂质载体、海绵状物、包合物、类脂囊泡、胶束、毫米球、微米球、纳米球、脂质球、微米乳液、纳米乳液、毫米粒子、微米粒子或纳米粒子。
7.一种化妆品，其特征在于，包含有效量的权利要求1-3任一项所述的式（I）所示的肽衍生物或其盐、或权利要求4或5所述的组合物、或权利要求6所述的递送系统或缓释系统。
8.根据权利要求7所述的化妆品，其特征在于，所述化妆品的剂型包括膏霜、乳液、凝胶、粉剂、片剂、膜剂、气雾剂或喷雾剂。
9.权利要求1-3任一项所述的式（I）所示的肽衍生物或其盐、或权利要求4或5所述的组合物、或权利要求6所述的递送系统或缓释系统在制备用于护理或治疗皮肤或粘膜的组合物中的用途。
10.权利要求1-3任一项所述的式（I）所示的肽衍生物或其盐、或权利要求4或5所述的组合物、或权利要求6所述的递送系统或缓释系统在制备用于抗衰的组合物中的用途。
11.权利要求1-3任一项所述的式（I）所示的肽衍生物或其盐、或权利要求4或5所述的组合物、或权利要求6所述的递送系统或缓释系统在制备用于修护的组合物中的用途。
12.权利要求1-3任一项所述的式（I）所示的肽衍生物或其盐、或权利要求4或5所述的组合物、或权利要求6所述的递送系统或缓释系统在制备用于恢复昼夜节律、再同步皮肤细胞生物钟的组合物中的用途。
13.权利要求1-3任一项所述的式（I）所示的肽衍生物或其盐、或权利要求4或5所述的组合物、或权利要求6所述的递送系统或缓释系统在制备Clock蛋白激活剂中的用途。
14.权利要求1-3任一项所述的式（I）所示的肽衍生物或其盐、或权利要求4或5所述的组合物、或权利要求6所述的递送系统或缓释系统在制备用于提高细胞活性和/或促进细胞增殖的组合物中的用途，或在制备用于改善皮肤屏障功能的组合物中的用途，或在制备用于促进皮肤或粘膜的再上皮化或愈合的组合物中的用途，或在制备用于促进胶原蛋白合成的组合物中的用途，或在制备用于增加皮肤弹性和/或提高皮肤紧致度的组合物中的用途，或在制备用于促进Clock基因表达的组合物中的用途。
15.权利要求1-3任一项所述的式（I）所示的肽衍生物或其盐、或权利要求4或5所述的组合物、或权利要求6所述的递送系统或缓释系统在制备化妆品中的用途。
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