CN101016541A - 一种生产布鲁氏菌疫苗抗原蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生产流产布鲁氏菌亚单位疫苗的抗原蛋白的方法，以及这种抗原蛋白的用途。本发明的方法是从流产布鲁氏菌提取细菌总DNA；以该总DNA作为模板，采用适当的引物进行聚合酶链反应，克隆获得OMP25蛋白基因，然后转入原核表达载体中，获得重组表达载体；将重组表达载体导入大肠杆菌，获得重组大肠埃希氏菌，进行诱导表达；培养重组大肠埃希氏菌，制备抗原蛋白；本发明的蛋白可以用于制备流产布鲁氏菌亚单位疫苗。

Description

一种生产布鲁氏菌疫苗抗原蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种生产流产布鲁氏菌亚单位疫苗的抗原蛋白的方法，确切讲是一种制备流产布鲁氏菌疫苗抗原蛋白的方法，特别是利用大肠杆菌表达系统生产牛流产布鲁氏菌基因工程疫苗用抗原蛋白的方法，以及这种抗原蛋白的用途。

背景技术

家畜布鲁氏菌病呈世界性分布，在五个洲的200多个国家中有170多个国家和地区存在或爆发该病，尤其在南美洲、非洲、亚洲的许多发展中国家流行严重。布鲁氏菌病主要通过消化道感染，一般只发生于动物一动物、动物一人之间的传染，被国家列为二类传染病。近些年来，我国布鲁氏菌病的疫情明显回升，已波及28个省市、自治区和直辖市；家畜布鲁氏菌病的爆发流行已经给畜牧业造成巨大的经济损失。布鲁氏菌病流行形势十分严峻。人感染布鲁氏菌病，临床主要表现波浪热或马耳他热，关节疼痛，慢性病例长期低烧，严重损伤身体，使之完全或部分丧失工作能力。生物战恐怖分子，历来把培育强毒力布鲁氏菌作为侯选的生物武器之一。

布鲁氏菌是革兰氏阴性、兼性细胞内寄生菌，能够感染多种动物和人。当前确认布鲁氏菌属中有6个种：马耳他布鲁氏菌(Brucella melitensis)、流产布鲁氏菌(Br.abortus)、猪布鲁氏菌(Br.suis)、沙林鼠布鲁氏菌(Br.neotomae)、绵羊布鲁氏菌(Br.ovis)和犬布鲁氏菌(Br.canis)。分类主要根据致病性和对宿主的嗜性差异做出。从遗传发生关系学看，布鲁氏菌属属于根瘤菌群(Rhizobiaceaegroup)。DNA-DNA杂交研究揭示6种布鲁氏菌与最近分离的海洋哺乳动物分离株之间高度一致(＞90％)

目前，市场上动物用布病疫苗全部为不同菌株的弱毒疫苗，弱毒株长期使用有可能毒力返强，另外，布鲁氏菌的培养要求条件高，培养比较困难。另一方面，由于我国现用的血清学检测技术不能区分疫苗免疫抗体与野毒感染抗体。为了不干扰常规检疫，所以现在我国大部分地区的奶牛不接种疫苗，以便避免免疫抗体的干扰，进行布病检疫。

寻找一种可长期使用而不产生毒力返强，培养生产更为容易的布鲁氏菌疫苗对维护国家安全，促进养殖业可持续性发展，保证食品安全、环境安全，保护人民身体健康和维护社会稳定具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种供家畜用的抗布鲁氏菌病的疫苗用抗原蛋白的方法，特别是一种可以大量工程化生产的方法。

本发明的方法是从流产布鲁氏菌提取细菌总DNA，以该总DNA作为模板，根据布鲁氏菌omp25基因的核苷酸全序列设计一引物进行聚合酶链反应，克隆获得omp25蛋白基因，然后转入原核表达载体中，获得重组表达载体，将重组表达载体导入大肠杆菌，获得重组大肠埃希氏菌，进行诱导表达，培养重组大肠埃希氏菌，再对表达产物进行纯化分离，得到疫苗用抗原蛋白。

布鲁氏菌主要外膜蛋白(Outer Membrane Proteins，OMPs)在二十世纪80年代首次被鉴定具有免疫原性和抗原保护作用。根据其分子量大小可将其分为三组，其中第一组外膜蛋白目前已经确定的有10kDa、18kDa和19kDa蛋白；第二组包括36-38kDa外膜蛋白，为膜孔蛋白；第三组包括31-34kDa外膜蛋白和25-27kDa外膜蛋白。相关的基因研究表明omp25在布鲁氏菌中高度保守。Omp25蛋白可能通过共价键与肽聚糖(peptidoglycan)层连接，并且Omp25与脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)的联系对于维持Omp25蛋白的构象型抗原决定基很重要(Edmonds，et al.，2002)。通过基因组学和蛋白组学方法确定第三组外膜蛋白存在着五个新成员，其中的一些成员在流产布鲁氏菌和马耳他布鲁氏菌中存在。应用Omp25单克隆抗体进行免疫抑制试验，与田间猪布鲁氏菌变异株做比较，发现猪布鲁氏菌基因组上只有三个Omp25相关基因。根据氨基酸同源性比较，将第三组外膜蛋白分为四个亚型，分别是omp25、omp25b-omp25c-omp25d基因座、omp31/omp31b亚群以及相关性很小的omp22(也叫omp3b)。由此可见OMP25蛋白是布鲁氏菌的最重要的抗原蛋白。由于omp25能产生抗原反应，但却并不具有致病性，因此采用omp25为亚单位疫苗可以完全克服现有技术的不足。

本发明进行聚合酶链反应时，所用的布鲁氏菌株为流产布鲁氏2型CVCC12，所采用的一对引物可以是：

上游引物：5’-CCGGAATTCATGCGCAC TCTT AAGTCTCTCG-3’(含EcoRI酶切位点)

下游引物：5’ATTTGCGGCCGCAACTTGTAGC CGATGCC-3’(含Not I酶切位点)

本发明由于所选用的流产布鲁氏菌2型CVCC12株的omp25，研究表明CVCC12株的omp25基因没有任何的突变，同时与其他种布鲁氏菌的omp25基因同源性高度一致，该基因在布鲁氏菌所有种之间是比较保守的。除了缺失36bp的绵羊附睾布鲁氏菌以外，流产布鲁氏菌2型CVCC12株omp25所编码的蛋白与其他布鲁氏菌种氨基酸的同源性均高达98％以上。基于该基因的高度保守性，采用流产布鲁氏菌2型CVCC12株omp25为布鲁氏菌的亚单位疫苗可更具有安全性。

本发明所采用的原核表达载体为pGEX-6p-1，感受态细胞为BL21，将构件成功的pGEX-Omp25重组质粒转化入BL21感受态细胞中，在LB培养基(含100μg/mLAmp+)中摇培使细菌生长到对数期，加入IPTG诱导表达。

经研究表明，本发明重组大肠埃希氏菌的培养条件在IPTG浓度为0.6mmol/L、诱导温度为37℃、诱导时间为4h时表达量为最高。

由于本发明所提供的是制备布鲁氏菌衣壳蛋白的方法，这种蛋白的生产方法与传统的家畜布鲁氏菌病疫苗(弱毒疫苗)用抗原蛋白的生产方式完全不同，其优点在于：

1.本发明生产的疫苗抗原是免疫基因的表达产物，而不是活的布鲁氏菌全菌体，因此在生产过程中完全避免了人为的制毒、散毒等安全隐患。

2.本发明生产的疫苗与传统弱毒疫苗相比，抗原成分单一，在免疫家畜体内只产生单一的特异性抗体，因此可以用血清学方法有效地鉴别区分疫苗免疫家畜和自然感染家畜。因此采用本发明的疫苗可克服现阶段存在的无法区分疫苗免疫抗体与野毒感染抗体的问题，为国家实施家畜布鲁氏菌病根除计划，提供有力的技术支持。

3.本发明涉及的疫苗用抗原是蛋白质，与其他新型疫苗(如活载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗)相比不会发生可能出现基因重组问题，因此本发明不存在生物安全性问题。

4.本发明以大肠杆菌作为目的蛋白的表达载体，培养简单，可以用发酵罐规模化生产，可以实现质量控制，保证所生产的疫苗安全有效。

5、本发明的方法相对现有的疫苗技术而言要简单。

附图说明

图1.为表达产物Western-blot检测，其中：M为蛋白分子量标准，1、2、3分别为表达产物。图2为尿素和盐酸胍变性溶解的pGEX-Omp25的SDS-PAGE，其中1、2、3泳道为经尿素洗涤的包涵体，4、5、6、7泳道为经盐酸胍洗涤的包涵体。

具体实施方式

本发明的具体实施方式说明如下：

本发明使用的主要材料

菌株：流产布鲁氏菌2型CVCC12株，购自中国兽医药品监察所。

表达菌：BL21为目的基因表达的大肠杆菌，用于质粒转化时须经CaCl₂处理使其具有感受性，成为感受态细胞，该菌株可以从许多生物工程公司购买得到。

pGEX-6P-1载体：为原核表达载体，购自Promega公司。

布鲁氏菌阳性牛血清：用于表达蛋白的定性检测，购自中国兽医药品监察所。

辣根过氧化物酶标记兔抗牛IgG：用于表达蛋白的定性检测，购自北京拜尔迪生物技术公司。

引物：所有基因扩增和改造用的引物均由大连宝生物有限公司合成。

酶和试剂：EcoRI、NotI、Taq酶、T₄DNA连接酶均购自Promega公司；IPTG、SDS(十二烷基磺酸钠)、蛋白酶K、Rnase、溶菌酶、核酸Marker、Agarose DNAextraction kit、DNA快速纯化回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒均购自大连宝生物工程公司；酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)溶液产自美国，琼脂糖产自西班牙，均由上海生工生物工程技术服务有限公司进口分装；单核苷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP，购自TaKaRa公司。中分子量标准蛋白marker为MBI公司产品；盐酸胍、尿素、异丙基-β-D-硫代半乳糖(IPTG)为Amresco公司产品；二硫苏糖醇(DTT)、还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)均购自Fluka公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、Triton X-100为华美生物工程公司产品；STE：自己配置，含10mmol/L Tris-Cl、0.1mol/L NaCl和1mmol/L EDTA，高压蒸汽灭菌15min，4℃贮存；雄性绵羊红细胞，本实验室提供。

以下为本发明的一个实施例

1.从选择的流产布鲁氏菌2型CVCC12株株提取总DNA

将流产布鲁氏菌接种布鲁氏菌培养用胰蛋白胨琼脂平板，在5％CO₂环境中，37℃培养24-48小时，通过形态学和生化鉴定，确定其为布鲁氏菌，然后进行增菌培养；取2mL增菌液于微量离心管，6000rpm离心5min收集沉淀；每管加入500μl NET Buffer置于80℃水浴15min；从水浴锅取出离心管，室温放置2min，而后加入12μl溶菌酶，37℃消化4hr；从水浴锅取出离心管，室温放置2min，加入蛋白酶K、Rnase酶过夜消化；在离心管中加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提2次；用无水乙醇洗涤2次得布鲁氏菌基因组总DNA，放入温箱中使离心管内壁干燥；加入50μl无核酸酶TE Buffer溶解，贮存于-20℃备用。

本实施例中选用流产布鲁氏菌2型CVCC12株，从中提取细菌总DNA，以该总DNA为模板，进行聚合酶链反应(PCR)，所用引物对为：

上游引物：5’-CCGGAATTCATGCGCAC TCTT AAGTCTCTCG-3’(含EcoR I酶切位点)

下游引物：5’-ATTTGCGGCCGCAACTTGTAGC CGATGCC-3’(含NotI酶切位点)

扩增片段包括omp25基因的完整阅读框架(长度为642bp)。

2.目的基因的克隆

首先将前述PCR产物和pGEX-6P-1载体分别用EcoR I和Not I双酶切，形成粘性末端，这样既可防止质粒的自身环化，又可形成粘端连接，使得连接效率和精确性大为提高。然后在T₄DNA连接酶的作用下使两产物连接，从而构建成pGEX-Omp25表达载体，42℃热击使pGEX-Omp25转入BL21感受态细胞，成为重组表达菌，在LB培养基(含100μg/mLAmp+)中摇培后提取重组质粒，通过PCR鉴定和酶切鉴定予以确认。鉴定肯定阳性质粒pGEX-Omp25为带有完整omp25基因的重组质粒。测序结果表明，阳性质粒pGEX-Omp25含有流产布鲁氏菌外膜蛋白基因omp25的完整阅读框架，用DNAStar软件进行分析显示，与GeneBank登录的B.abortus的omp25基因核苷酸序列同源性为100％。与B.menlitensis、B.suis、B.ovis、B.canis、B.neotomae的omp25基因核苷酸序列同源性分别为99.5％、99.5％、98.7％、99.4％、99.4％；推导的氨基酸同源性分别为99.1％、99.1％、97.5％、98.1％、99.1％。这证明获得的目的基因高度保守。

2.1将pGEX-Omp25表达载体碱裂解法小量提取质粒。

2.2对重组质粒pGEX-Omp25的鉴定

鉴定包括以下方面：

(1)重组质粒pGEX-Omp25琼脂糖凝胶电泳鉴定；

(2)重组质粒pGEX-Omp25的PCR扩增；即用含有如下两个酶切位点的P3、P4引物对重组质粒进行PCR扩增鉴定；

(3)重组质粒pGEX-Omp25的酶切鉴定；即用EcoR I和Not I双酶切鉴定；

(4)重组质粒pGEX-Omp25的测序确证；

(5)用DNAstar软件对序列进行分析，并与已发表的序列进行同源性比较。

经以上的鉴定证明获得的正确目的基因已准确的连接到表达载体上，并成功的构建了pGEX-Omp25重组表达载体。

3.流产布鲁氏菌omp25基因在大肠杆菌中的表达

将鉴定为阳性的重组菌30μl接种至3mLLB培养液(含100μg/mL Amp+)中，37℃振摇过夜。取过夜培养物200μl接种于20mLLB培养液中，剧烈振摇至OD600为0.6-1.0时(相当于生长到对数期)，加入IPTG至终浓度1mmol/L，37℃诱导表达。

4.表达产物的分离与纯化

(1)包涵体的制备与溶解

5000rpm离心10min收集诱导培养的pGEX-Omp25工程菌，弃上清。用1/10原培养体积的STE(pH8.0)缓冲液重悬细菌沉淀。用两种方法裂解细菌：(1)在细菌重悬液中同时加入溶菌酶至终质量浓度100mg/L和1/10体积的1％TritonX-10，30℃作用15min后，于冰浴中超声裂解细菌(250W，作用10s，间隔10s，40个循环)；(2)直接超声裂解细菌重悬液(250W，作用10s，间隔10s，40个循环)。4℃下，12000rpm离心10min离心收集包涵体沉淀，分别用1mol/L尿素、1mol/L NaCl和1％Triton X-100溶液各洗涤包涵体沉淀2次(重悬包涵体，分别作用10min)。

采用两种方法对包涵体进行变性处理：(1)用8mol/L的尿素(pH8.0的STE新鲜配制)和2mmol/L DTT缓冲液溶解包涵体进行变性处理；(2)用6mol/L的盐酸胍(pH8.0的STE新鲜配制)和2mmol/L DTT缓冲液溶解包涵体进行变性处理。4℃，12000rpm，10min离心收集变性溶解的pGEX-Omp25上清液，去除不溶性杂质。

(2)Omp25蛋白变性液的复性

分别在变性液中各加入等体积的复性液(20mmol/LTris-Cl、2mmol/L EDTA)，加入还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使其终浓度分别达到1mmol/L和0.1mmol/L，室温放置20hr，对pGEX-Omp25进行复性，用20mmol/L Tris-Cl(pH8.0)缓冲液透析24hr，每6hr换液一次。PEG20000浓缩复性包涵体蛋白液，过滤除菌，置4℃待用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，检测表达产物。对不同的阳性克隆分别进行诱导表达，筛选出表达量高的克隆，同时用未诱导的菌液作为阴性对照。尝试过低温和不同诱导时间等条件进行诱导表达，但融合蛋白都主要以包涵体形式存在。通过SDS-PAGE蛋白电泳表明，出现预期大小的目的蛋白，参见图2。

相关的试验还表明在IPTG浓度为0.6mmol/L、诱导温度为37℃、诱导时间为4h时表达量最高。故选择IPTG浓度为0.6mmol/L，温度37℃，诱导4hr作为本试验的诱导表达条件。研究还表明当培养温度过高或低，均不能获得满意得诱导表达，同样延长培养时间表达蛋白的产量并不增加。

4.重组蛋白pGEX-Omp25免疫活性的检测

(I)Western-blot分析溶液的配制：

洗涤液溶液：150mmol/L NaCl

50mmol/L Tris-HCl pH7.5

转移缓冲液：39mmol/L甘氨酸

48mmol/L Tris碱

0.037％SDS

20％甲醇

氨基黑染色液(100mL)：0.5g氨基黑10B溶于40mL双蒸水、50mL甲醇、10mL冰乙酸中。

封闭液：10mL PBST+0.3g BSA

底物溶液(30mL)：在30mL PBST中加入15mg的DAB(二氨基联苯胺)和9mg CoCl₂·6H₂O使其溶解，加入10μl 30％H₂O₂混匀后立即使用。

(II)ELISA试剂配制：

(1)包被液0.05mol/L碳酸盐缓冲液

Na₂CO₃(无水碳酸钠)1.6g

NaHCO₃(碳酸氢钠)2.9g

加无离子水至1000mL

(2)洗涤液pH9.2碳酸盐缓冲液-吐温20

Na₂HPO₄·12H₂O  2.9g

KCl 0.2g

KH₂PO₄ 0.2g

NaCl 18g

吐温20 0.5mL

加无离子水至1000mL

(3)甲液0.1mol/L柠檬酸4.2g/200mL

乙液0.2mol/L Na₂HPO₄.12H₂O 14.3g/200mL

取甲液24.3mL与乙液25.7mL混合，临用前加20mg邻苯二胺(OPD)加过氧化氢(H₂O₂)0.02mL。

(4)终止液2mol/L H₂SO₄溶液

取分析纯浓硫酸11.8mL，加无离子水至100mL。

(III)间接血凝试验试剂配制

(1)0.15mol/L pH7.2PBS配制

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)    19.34g

磷酸二氢钾    2.86

氯化钠        4.25

蒸馏水        加至500ML

103.41kPa灭菌30min。

(2)含1％灭能健康兔血清0.15mol/L pH7.2 PBS稀释液的配制

0.15mol/L pH7.2 PBS     99mL

灭能健康兔血清          1mL

将上二者混合，即为含1％灭能健康兔血清0.15mol/L pH7.2 PBS的稀释液。

(IV)重组表达蛋白的Western-blot分析

(1).转印：剪8块滤纸与1块硝酸纤维素膜(NC)，大小与凝胶相等，在转移缓冲液中浸泡3min，在正极板上按四层滤纸、NC膜、SDS-PAGE电泳凝胶、四层滤纸的顺序叠放整齐，确定无气泡后盖上负极板，110mA转移1hr。

(2).封闭：转移完成后，取下NC膜，切下标准分子量Marker，置氨基黑染色液中浸染5min，取出后用漂洗脱色，直至背景蓝色脱尽。其余NC膜用PBS冲洗，加入10mL封闭液，室温轻轻振摇1-2hr。

(3).与抗体的结合：封闭结束后，用PBS冲冼NC膜4-5次，加入PBST 1∶50倍稀释的布鲁氏菌阳性牛血清10mL，37℃结合1.5hr，用PBST冲洗4-5次，每次在摇床缓慢摇动。加入1∶400倍稀释的兔抗牛IgG(二抗)，室温下轻摇孵育1hr，取出用PBST冲洗3-4次，每次10min。

(4).底物显色：将NC膜转移到10mL底物溶液中，室温避光轻摇3min观察显色情况，等出现条带时，立即转入PBST缓冲液中，室温保存。

(V)重组表达蛋白的ELISA检测

(1)重组表达蛋白的纯化：将大量制备的含重组表达蛋白的重组菌菌体裂解上清进行SDS-PAGE电泳，经染色后，参照Marker的大小，切下所需的51ku的特异蛋白条带，将其冻干后研成粉末与1×PBS等体积混合。

(2)ELISA检测：按常规方法进行，将纯化的目的蛋白10倍稀释后包被酶标板，用购自中国兽医药品监察所的布鲁氏菌阳性牛血清1∶100稀释作为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG1∶200稀释作为二抗。同时用标准阴性和标准阳性血清作对照。

(3)操作过程：用微量移液器向每个孔内加0.1mL包被液稀释的蛋白样品，置湿盒内于37℃恒温培养箱中1h，然后于4℃冰箱中包被过夜。次日，用洗涤液洗涤三次，甩去洗涤液，倒置在纱布上轻轻拍扣使孔内的液体充分流出，每次间隔3min。向孔内分别加入用稀释液稀释好的1∶100阳性血清、阴性血清0.1mL，置湿盒内于37℃恒温箱中反应1hr后，甩去血清，用同法洗涤3次，再加入稀释好的1∶200酶标记兔抗牛IgG 0.1mL，置于湿盒内于37℃恒温箱静置1hr，甩去残留的酶标记物溶液，以同法洗涤三次。加入底物溶液0.1mL，置湿盒内于37℃恒温箱中静置30min，取出后立即向孔内加入0.02mL终止液，终止反应。

(4)结果判定：将培养板放入分光光度计读取450吸收波的OD值。

(VI)间接血凝试验

操作步骤：

(1)将从第1孔至第5孔，每孔滴加稀释液50μL；用移液器分别吸标准阳性血清、标准阴性血清(分别占2排)50μL加入第1孔，充分混匀后再吸取50μL加入第2孔……依次做倍比连续稀释至第5孔(1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32)，混匀后从第5孔弃取50μL。

(2)加抗原

第一排阳性血清、第一排阴性血清5个孔分别滴加1％的pGEX-Omp25敏化的红细胞悬液25μL；

第二排阳性血清、第二排阴性血清5个孔分别滴加1％的用50％，33％饱和硫酸铵盐析的重组表达蛋白pGEX-Omp25敏化的红细胞悬液25μL。

(3)振荡

加致敏红细胞后将血凝板放在微量振荡器上振荡1min，置室温2hr，判定结果。

5重组表达蛋白免疫鉴定结果

(I)重组表达蛋白的Western-blot分析

重组pGEX-Omp25表达产物经SDS-PAGE后转移至PVDF膜上进行免疫印迹试验，结果在51ku左右出现明显的阳性反应带，说明表达产物能被流产布鲁氏菌阳性牛血清所识别，具有免疫性，结果参见附图1。

(II)ELISA结果

用纯化的pGEX-Omp25融合蛋白作为包被抗原，进行ELISA检测。ELISA结果如表1，检测说明表达产物pGEX-Omp25具有免疫学活性。

表1 pGEX-Omp25的ELISA试验结果

标准阴性血清	标准阳性血清	FMD阳性血清	衣原体阳性血清
				0.290 0.251	1.010 1.034	0.393 0.285	0.354 0.371
0.275 0.273	0.993 1.101	0.405 0.423	0.398 0.431
				0.378 0.385	0.885 0.910	0.418 0.385	0.405 0.375

5.5间接血凝试验结果：用pGEX-Omp25重组蛋白致敏绵羊红细胞，检测布鲁氏菌标准阳性血清和布鲁氏菌标准阴性血清的凝集情况，结果如表2。试验表明了用重组蛋白pGEX-Omp25致敏的绵羊红细胞能够使布鲁氏菌标准阳性血清凝集，表达产物pGEX-Omp25具有免疫活性。

表2 pGEX-Omp25的间接血凝试验结果

标准阴性	标准阳性	标准阴性	标准阳性
				-	+++	-	++++
-	++	-	++++
				-	++	-	+++
-	+	-	+++
				-	-	-	++

以上述3项试验均说明表达的Omp25蛋白可与牛布鲁氏菌阳性血清发生很好的抗原-抗体反应，Omp25蛋白具有免疫活性，完全可以作为流产布鲁氏菌疫苗抗原蛋白。

Claims (10)

1.制备流产布鲁氏菌疫苗抗原蛋白的方法，其特征是从流产布鲁氏菌提取细菌总DNA；以该总DNA作为模板，采用适当的引物进行聚合酶链反应，克隆获得OMP25蛋白基因，然后转入原核表达载体中，获得重组表达载体；将重组表达载体导入大肠杆菌，获得重组大肠埃希氏菌，进行诱导表达；培养重组大肠埃希氏菌，制备抗原蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述一对特异性引物为：

上游引物：5’-CCGGAATTCATGCGCAC TCTT AAGTCTCTCG-3’(含EcoRI酶切位点)

下游引物：5’ATTTGCGGCCGCAACTTGTAGC CGATGCC-3’(含Not I酶切位点)

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的一对引物上酶切位点位于引物的5’端，两引物进行聚合酶链反应后OMP25基因的开放阅读框恰好在两酶切位点之内。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的原核表达载体为pGEX-6p-1。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的原核表达载体带有强的启动子和多克隆位点，在多克隆位点上有EcoR I和Not I酶切位点。

6.根据权利要求1至5所述的方法，其特征在于，所述的重组表达载体的构建是分别对聚合酶链反应后OMP25目的基因和pGEX-6p-1载体用EcoR I和Not I双酶切。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的感受态细胞为BL21。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的诱导表达条件是：当重组菌生长到对数期时。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的重组大肠埃希氏菌的优化培养条件是在IPTG浓度为0.6mmol/L、诱导温度为37℃、诱导时间为4小时。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的表达蛋白能被布鲁氏菌阳性牛血清所识别。