CN103837684A - 快速检测沙门氏菌的抗体试剂及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快速、简便、特异性高，且能够检测所有沙门氏菌的单克隆抗体及其制备方法。其抗体具体为沙门氏菌鞭毛fliC基因编码蛋白特异性单克隆抗体；其制备方法具体涉及沙门氏菌特定鞭毛成分蛋白及其单克隆抗体的制备。本发明的单克隆抗体用于检测样本中的所有沙门氏菌，其经倍比稀释至合适浓度，加入一滴待检菌液后，即可在室温下利用简单的玻板凝集反应通过观察混合液是否呈絮状或颗粒状肉眼可见沉淀判断样本是否含有沙门氏菌或为沙门氏菌所污染，从而用于实验室、临床及日常生产生活中沙门氏菌的检测或诊断。

Description

快速检测沙门氏菌的抗体试剂及检测方法

技术领域

本发明隶属生物技术检测领域，具体涉及一种能特异、便捷﹑快速检测所有沙门氏菌的单抗腹水试剂以及应用该试剂的检测方法。

背景技术

1.沙门氏菌属简述

1885年Salmon于猪霍乱病流行时分离到猪霍乱杆菌。1888年Gartner从急性胃肠炎者分离到肠炎杆菌，到1900年为纪念猪霍乱杆菌的发现者美国细菌学家Salmon，将此类细菌命名为Salmonella（沙门氏菌）。沙门氏菌是一类广泛分布于自然界，肠杆菌科中的一种重要的人畜共患、革兰氏阴性病原菌。

在此之前的研究表明除雏沙门氏菌，即鸡白痢沙门菌(Salmonellap pullorum)和鸡沙门氏菌，即鸡伤寒沙门菌(Salmonella gallinarum)外,大多数沙门菌周身有鞭毛、运动活泼，而真实情况并非如此，鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌也具有鞭毛编码基因、结构和运动性。也就是说，所有的沙门氏菌都有鞭毛，从DNA一级结构的检测和序列测定得到证实。通过我们研发的针对沙门氏菌鞭毛的抗体试剂也能反应识别雏沙门氏菌和鸡沙门氏菌而进一步验证。沙门氏菌鞭毛的基本结构为基体部、钩状部和丝状部三个部分,其中丝状部由数千个结构蛋白自身装配而成。该结构蛋白称为鞭毛蛋白,包括N、C末端高度保守区和一个中间可变区,沙门菌分型H抗原表位定位于鞭毛蛋白的可变区中。沙门菌的鞭毛具有特异的抗原性,鞭毛抗原的特异性取决于鞭毛蛋白一级结构多肽链上氨基酸的排列顺序和空间构型。沙门菌编码鞭毛蛋白的基因为fliC或fljB,鞭毛蛋白基因序列两端为N、C端保守区,中间为可变区。可变区中不同的碱基序列编码不同氨基酸序列,形成不同的抗原表位,具有特异性,被称为抗原决定区(antigenic determinant)。

2.沙门氏菌流行现状

沙门氏菌作为人畜共患致病菌，其在全球公共卫生学上都具有极其重要的地位。举例来说，目前肉及其制品的沙门氏菌检出率美国为20-25%、英国为9.9%、日本检查进口家禽的污染率为10.3%。其中鼠伤寒沙门氏菌是最常见的血清型，在国外占27.7-80%，其次为肠炎沙门氏菌占有10.3%；而我国国内状况也不容乐观，肉类沙门氏菌检出率在11-39.5%。牛、马、猪感染多呈全身感染，形成败血症，感染或带菌畜产品易引起食物中毒型沙门氏菌感染。我国禽蛋及其制品沙门氏菌检出率为3.9-43.7%，禽、蛋而引起鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌感染或带菌在食物中毒中占有相当的重要性，其感染病例报告逐渐有增加的趋势。

据统计在世界各国的各类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒列榜首。我国内陆地区也以沙门氏菌为首位。沙门氏菌菌型繁多，已确认的沙门氏菌有肠道沙门氏菌（6个亚种）和邦戈尔两个种，计有2500个以上血清型。多少年来，一直认为，除雏沙门氏菌和鸡沙门氏菌无鞭毛不运动外，其余沙门氏菌均以周身鞭毛运动，且运动活泼。因此，明确存在任何一种沙门氏菌的特异性快速检测一直是沙门氏菌研究的焦点问题。

3.单克隆抗体技术

1975年Kohler和Milstein利用杂交瘤技术将产生抗体的B淋巴细胞同骨髓瘤细胞融合，标志着单克隆抗体制备技术的成功建立。该技术基本原理为：小鼠受到外界抗原刺激后可诱发免疫反应，机体内B淋巴细胞产生相应的抗体，由于体外培养的肿瘤细胞可无限传代，若把小鼠的骨髓瘤细胞与经免疫过小鼠脾细胞融合，融合后的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性：一方面可以分泌特定的抗体，另一方面也具备了肿瘤细胞无限增殖的能力，可在体外培养条件下或移植到体内无限增殖，从而分泌大量单克隆抗体。鉴于其质地均一、高度特异和高亲和力，目前基因工程抗体在疾病的预防、诊断、治疗和纯化方面已获得广泛应用。

4.沙门氏菌的检测与判定

4.1现行主流检测方法概述

4.1.1传统分离鉴定方法：按照前增菌和增菌，鉴别培养基初步分离鉴定，分离纯培养物，属和种的鉴定，血清学分群和菌型的判定等步骤。该方法准确，可重复性强，但过程相当繁琐，费时费力。

4.1.2免疫学标记检测方法：如ELISA，Dot-ELISA，免疫荧光技术，免疫磁性分离技术等。该方法能提高试验的灵敏性，而且快速，简便，特异性强，但对仪器设备要求较高，而且至今没有一种方法达到检测所有沙门氏菌的目的。

4.1.3分子生物学技术：如核酸杂交技术，PCR技术，基因芯片等。此类方法诊断确实、迅速，灵敏性高，特异性强，但设备和人员的要求均较高，应用价格较为昂贵，难以普遍应用，此外目前研究还未发现可以运用某一种PCR方法可将所有的沙门氏菌检测出来，对于沙门氏菌的检测覆盖率低，漏检不可避免。

4.2经典玻板凝集试验检测法

除鸡白痢沙门氏菌在临床上有时会采用全血平板凝集试验的检测方法外，市面上还有各种国内外生物技术公司生产制造的沙门氏菌乳胶凝胶试剂盒出售。这两者采用的基本原理虽基本一致，但均存在一定弊端：前者的检测病原菌局限于鸡白痢沙门氏菌，且该法仅对成年鸡群检测效果显著，对雏鸡则存在较大检测误差；后者由于其高昂的售价一般仅限于高校实验室或商业公司研发使用，加之其在市面上的众多产品质量良莠不齐，操作冗繁，实在难以在基层推广。同时为了提高检测敏感度，包被有沙门氏菌特异性的免疫磁珠常用来对被检样品进行富集。更值得一提的是：目前市场中用于鉴定沙门氏菌属的诊断因子是若干O抗原（基于A～F群）多价血清和单因子血清组合，理论上能制备若干群多种O因子和单因子血清，综合在一起可以达到鉴定所有沙门氏菌，但目前全球已知有2489个不同的血清型,分属于46个O群,要想制备齐全多种O因子和单因子血清鉴定每种沙门氏菌，其操作难度难以想象，几乎不可能，且单因子血清与单克隆抗体相比，反应亲和力大大降低。

发明内容

本发明的目的在于克服前述多种沙门氏菌检测方法的种种不足，提供一种能快速、高效检测和明确存在任何一种沙门氏菌的单抗腹水试剂及其制备与使用方法。

本发明所采用的技术方案是：

一种特异性快速简便检测样本中所有沙门氏菌的方法，用抗体试剂对待测样本进行玻板凝集试验检测；其特征在于包括所述抗体试剂通过下述方法制得：扩增沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因fliC并将其插入表达载体pET-22b(+)，随后将获得的重组质粒载体导入工程菌E.coliBL21(DE3)，进而筛选重组阳性克隆；诱导并纯化重组表达蛋白；制备免疫原并免疫BALB/c小鼠，建立杂交瘤细胞株、筛选阳性细胞株、制备单抗腹水作为检测用抗体试剂。

本发明中筛选到3株杂交瘤细胞株1D6、2G6和3E2，其分泌效果最好的是或3E2。杂交瘤细胞株3E2的保藏编号是CGMCC NO.8955

一种快速检测沙门氏菌的单抗腹水试剂，其制备步骤如下：

(1)鞭毛fliC基因片段的PCR扩增及检测用主要的试剂

a)用于PCR扩增及检测用的序列

上游引物为31bp，下划线为Nde I酶切位点；序列如下：

5’—GCTGCACATATGGCACAAGTCATTAATACAA—3’

下游引物为37bp，下划线为Not I酶切位点；序列如下：

5’—ACTGCAGCGGCCGCTTAACGTAAGAGAGGACGCTTTT—3’

用于PCR扩增及检测用的沙门氏菌细菌染色体DNA模板和阴性对照模板的制备。

(2)鞭毛fliC基因片段的克隆

a)PCR扩增用的上下游引物见上述

b)PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定和PCR产物的试剂盒纯化回收

c)将步骤(1)用Nde I和Not I双酶切、电泳和纯化回收的PCR产物插入同样处理的表达载体pET-22b(+)中

d)假定阳性重组菌E.coli BL21(DE3)克隆的筛选，Nde I和Not I酶切鉴定和测序验证

(3)鞭毛fliC基因片段的表达和纯化

a)IPTG诱导表达上述阳性重组菌

b)SDS-PAGE检测确定重组蛋白(rFliC蛋白)表达

c)尿素变性复性法纯化重组表达蛋白，SDS-PAGE纯度鉴定

(4)抗鞭毛FliC蛋白单克隆抗体制备；

a)纯化的重组毒素FliC蛋白(rFliC)与弗氏完全佐剂、不完全佐剂乳化，免疫原制备和免疫BALB/c小鼠

b)免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接ELISA筛选

c)阳性杂交瘤细胞亚克隆建株

(5)腹水试剂的制备与纯化

(6)腹水的浓度及效价的测定

本发明筛选了3株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1D6、2G6和3E2，由杂交瘤细胞株1D6、2G6或3E2制备的单抗腹水用于本发明的检测。

如上所述制备好的腹水试剂可与冰袋一同封存至塑料泡沫盒中进行低温运输。具体运用时建议与事先准备的若干表面洁净的玻板、常规移液器，以及灭菌接种环或牙签配合使用。在以上推荐器材或缺的情况下使用其他替代工具或可影响试验结果的可靠性。

本发明的单抗腹水试剂能用于快速检测所有沙门氏菌。该方法操作便捷，试验结果可直接用肉眼观察，一般2min内即出结果，适用于基层各级医院、兽医部门、食品质量检测机构和出入境沙门氏菌的快速大量筛选检测；其同样适用于高校科研院所实验室或生物技术研究公司。该法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。

本发明提供的单抗介导的玻板凝集试验既克服了现有全血平板凝集试验的检测方法检测单一抗原的局限性，又克服了沙门氏菌乳胶凝胶试剂盒价格高额的缺陷，是全面快速检测和明确存在沙门氏菌的最佳选择。具体操作步骤如下：取表面洁净普通玻板若干块，同时用灭菌生理盐水将沙门氏菌单抗腹水试剂稀释至规定浓度(100倍)。以移液器吸取一滴约10ul工作浓度的沙门氏菌单抗腹水试剂垂直滴于水平放置的玻板表面上。随后迅速滴加等量的待检培养菌液。用灭菌金属环或牙签使单抗腹水试剂与待测菌液充分混合均匀，涂布成直径1-2cm的片状后随即平稳摇动玻板，一般在2min内即可观察试验结果。标准判定状况为室温下2min内，以腹水试剂是否与待检菌液产生絮状或颗粒状肉眼可见沉淀将反应结果判定为阳性与阴性二种情况。

本发明通过扩增沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因fliC，使之插入表达载体后导入工程菌中诱导表达大量的目的蛋白，制备免疫原再将其免疫入小鼠体内制备阳性杂交瘤细胞株，注射BALB/c小鼠获取含单抗的腹水，经进一步纯化制得。

作为一种经典的检测技术，玻板凝集试验检测法具有多项优点，而以本单抗介导的玻板凝集检测沙门氏菌方法突出优点在于：

(1)广泛性体现在本方法可以全面快速检测和明确存在任何一种沙门氏菌。

(2)便捷性体现在本方法极其迅速简便的判定过程，明显优于其他免疫或分子检测方法。且该法无需专业技术人员操作，也不涉及一些高档仪器的运用。

(3)特异性强体现在对沙门氏菌属所有已知菌株均可检出的同时，与非沙门氏菌不产生假阳性结果。

(3)灵敏度高体现在本方法的检测仅需一滴样本菌液约10ul，在短短数分钟的反应后，即可读取结果。

(4)成本低廉操作过程不涉及一些精密分子学或免疫学仪器确保了本方法廉价的巨大优势。

本发明是利用研制出的沙门氏菌鞭毛特异性单克隆抗体，建立快速检测沙门氏菌单抗腹水试剂，为医学和动物学临床、出入境海关及质监等众多部门沙门氏菌的快速诊断、控制提供强有力的保证，且独一无二。

附图说明

图1.PCR扩增fliC片断电泳图；M:蛋白marker;1:D6;2:2G6;3:3E2。

图2.纯化腹水的SDS-PAGE电泳图；M:-T14;1～10:沙门氏菌;11:阴性对照。

杂交瘤细胞株3E2，于2014年3月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号是CGMCCNO.8955。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施实例1：抗沙门氏菌鞭毛fliC单克隆抗体研制

1.实验方法

1.1沙门氏菌鞭毛主要编码基因fliC基因的原核表达（抗原的制备）。

1.1.1沙门氏菌标准菌株CMCC(B)50336（国家卫生部鉴定所，扬州大学焦新安教授提供）模板DNA和阴性对照模板制备

采用煮沸裂解法制备模板。从固体平板上挑取单菌落接种于液体LB培养基，37℃摇床培养过夜；次日取1mL培养液，12000r/min离心5min，弃上清；用双蒸水洗涤两次后用200ul双蒸水重悬，沸水浴10min，12000r/min离心10min,取上清；用核酸蛋白定量仪测定模板浓度，于-20℃保存备用。

1.1.2聚合酶链反应(PCR)

(1)引物设计与合成：扩增及检测fliC鞭毛基因片段的的序列引物为：

上游引物为31bp，下划线为Nde I酶切位点；序列如下：

5’—GCTGCACATATGGCACAAGTCATTAATACAA—3’（SEQ ID NO.1）

下游引物为37bp，下划线为Not I酶切位点；序列如下：

5’—ACTGCAGCGGCCGCTTTTAACGTAAGAGAGGACGCTTTT—3’（SEQ IDNO.2）

(2)PCR扩增体系与程序

PCR扩增体系(25ul)：10×PCR Buffer(20mmol/L MgCl₂)2.5ul，模板2.5ul，上下游引物各0.5ul，dNTPs1.0ul，rTaq酶2.5U，剩余用双蒸水补足。

PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，经25个循环；最后72℃延伸10min。

(3)PCR特异性检测

将上述沙门氏菌、不同血清型的沙门氏菌和非沙门氏菌DNA模板进行扩增，检测并确定该PCR扩增的预期片段来自沙门氏菌标准株，为特异性，而非沙门氏菌DNA模板不能扩增出任何预期的特异性条带。

1.1.3重组鞭毛FliC蛋白的表达和制备

(1)克隆将上述PCR扩增产物用限制性内切酶Nde I和Not I双酶切，琼脂糖凝胶电泳并结合DNA回收试剂盒纯化PCR产物，插入同样处理的表达载体pET-22b(+)（美国NOVAGEN公司）中，制备DH5α感受态细胞，将含目的DNA片段与载体质粒连接反应后，得到的重组质粒pET-22b(+)全量转入200μl的感受态细胞中；经氨苄青霉素(Amp⁺)平板筛选、挑取单个菌落培养和提取质粒进行双酶切鉴定，阳性克隆提取含目的片段的质粒DNA经测序验证，将阳性质粒命名为pET-fliC。

(2)表达和检测进一步将含pET-fliC阳性重组宿主菌E.coli BL21(DE3)在LB(Amp⁺)液体培养基中经适当培养条件后用不同浓度的IPTG诱导表达，收集菌体，分离上清和沉淀，SDS-PAGE检测确定表达蛋白存在的状态。

(3)重组蛋白纯化通过尿素变性复性透析法纯化重组蛋白pET-fliC后测其浓度并进行SDS-PAGE检测。

1.2动物免疫

取含适量纯化蛋白抗原（50_xg左右）200μl与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射8周龄BALB/c小鼠200μl/只；2周后、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同剂量抗原腹腔注射，不加佐剂；3天后融合。

1.3融合

1.3.1饲养细胞的制备

饲养细胞取自BALB/c小鼠的腹腔巨噬细胞。具体操作为：将BALB/c小鼠摘眼球采血，分离血清作为抗体检测时的阴性对照；同时通过颈脱位致死小鼠，浸泡于75%酒精10min，取出小鼠，腹部向上固定于支架上，用无菌剪镊从后腹部掀起腹部皮肤，暴露腹膜，用酒精棉球擦拭腹膜消毒；注射器注射5mL HAT完全培养基于腹腔中，避免刺破肠管；用右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，随后反复抽吸注入的培养液；1000rpm离心10min，弃上清，用适量HAT完全培养基重悬细胞，根据细胞计数结果补加培养基，使细胞浓度为2×10⁵/mL；将上述细胞悬液加入96孔细胞培养板中，50μL/孔，37℃、5%CO₂培养箱中培养。

1.3.2骨髓瘤细胞SP2/0的制备

融合前两周开始复苏骨髓瘤细胞SP2/0，扩大培养，融合时确保SP2/0处于对数生长期，状态良好，活细胞计数高于95%；融合当天，用DMEM基础培养基轻轻吹下细胞，收集于离心管中，1000rpm离心10min，弃上清，用适量培养基重悬细胞，同法离心洗涤一次，最后将细胞重悬于10mL DMEM基础培养基中，制成细胞悬液，用血球计数板进行活细胞计数。

1.3.3脾淋巴细胞的制备

取加强免疫后3天的雌性BALB/c小鼠，摘眼球采血，分离血清作为抗体检测时的阳性对照；颈脱位致死小鼠，75%酒精浸泡10min，取出小鼠，腹部向上固定于支架上，用无菌剪镊取出小鼠脾脏，置于盛有DMEM基础培养基的无菌平皿中，轻轻洗涤，剥去周围结缔组织；将脾脏移入另一盛有10mL DMEM基础培养基的无菌平皿中，用弯头针轻轻挤压脾脏，吸管吹打，将脾脏制成单细胞悬液，收集脾细胞悬液，1000rpm离心10min，DMEM基础培养基洗涤一次，最后用10mL DMEM基础培养基重悬细胞，用血球计数板进行活细胞计数。

1.3.4细胞融合

取计数后的脾细胞和骨髓瘤细胞按5:1～10:1的比例混合于50mL融合管中，充分混匀，1000rpm离心10min，弃上清；用手掌轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀；在45s内缓慢滴加37℃预热的PEG-15001mL，边滴加边轻轻旋转融合管；继续旋转并在90s内缓慢滴加37℃预热的DMEM基础培养基1mL，补加适量培养基，37℃水浴10min，1000rpm离心10min，弃上清，加入HAT完全培养基，轻轻混匀细胞，分装于已接种饲养细胞的96孔细胞培养板中，37℃、5%CO₂培养箱中培养。5d后用新鲜的HAT完全培养基换出一半培养基，10d后用HT完全培养基换出HAT培养基；观察杂交瘤细胞的生长情况，待细胞生长至孔底面积1/10以上或细胞培养上清变黄时，吸取细胞培养上清进行间接ELISA抗体检测。

1.4杂交瘤细胞株的筛选

1.4.1间接ELISA最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定

筛选时以融合前摘眼球采血制备的血清为阳性对照，以非免疫小鼠眼球采血制备的血清为阴性对照，同时以PBS作为空白对照调零孔。在酶标板上进行方阵试验，确定检测抗原的最佳包被浓度和阳性、阴性血清的最佳稀释度，具体操作如下：根据检测抗原的浓度，用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(PH9.6)稀释成不同梯度，即10μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL和1μg/mL，横向加入酶标板中，100μL/孔，置37℃孵育3h后4℃过夜；次日弃去孔中的液体，PBST洗涤3次，每次5min，拍干；封闭液(10%NCS+PBST)封闭，150μL/孔，37℃孵育2h，PBST洗涤同前，拍干；一抗(阳性血清)纵向以PBST进行200×、400×、800×、1600×、3200×稀释，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤同前，拍干；加入用PBST稀释(1:10000稀释)的羊抗小鼠-HRP标记的IgG，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤同前，拍干；加入新鲜配制的TMB底物显色液，100μL/孔，37℃作用5min后以2mol/LH₂SO₄终止显色，50μL/孔；酶联免疫检测仪读取OD₄₅₀。根据反映结果选择最佳包被浓度及其对应的血清稀释度。

确定检测原最佳包被浓度后，批量包被酶标板：用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(PH9.6)稀释检测原至最佳工作浓度，加入96孔酶标板中，100μL/孔，置37℃孵育3h后4℃过夜；次日弃去孔中的液体，PBST洗涤3次，每次5min，拍干；封闭液(10%NCS+PBST)封闭，150μL/孔，37℃孵育2h，PBST洗涤同前，拍干，-20℃保存备用。

1.4.2间接ELISA试验

吸取待检孔的细胞上清加入上述检测酶标板中，同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照，37℃孵育1h，PBST洗涤同前，拍干；加入用PBST稀释(1:10000稀释)的羊抗小鼠-HRP标记的IgG，100μL/孔，37℃孵育30min，PBST洗涤同前，拍干；加入新鲜配制的TMB底物显色液，100μL/孔，37℃作用5min后以2mol/L H₂SO₄终止显色，50μL/孔；测定孔内的OD₄₅₀。判定标准：待检孔的OD值/阴性对照孔的OD值≥2.1即可判断为阳性，可进行下一步试验。

1.5杂交瘤细胞的克隆化及建株

采用有限稀释法对连续三次检测为阳性的细胞株进行克隆化：克隆前制备饲养细胞；轻轻吹下阳性孔中的杂交瘤细胞，进行活细胞计数，用HT完全培养基稀释细胞到5、10和20个/mL，再分别加入含有饲养细胞的96孔细胞培养板中，使相应的每孔平均为0.5、1和2个细胞；37℃、5%CO₂培养箱中培养；待细胞上清变黄或细胞长满培养孔的1/3～1/2时进行检测，强阳性孔再克隆，如此重复3～4次，直到阳性率达到100%且OD₄₅₀稳定时则可建株冻存。1.6腹水的制备和纯化

选择8～10周龄的雌性BALB/c小鼠数只，腹腔注射液体石蜡，0.3mL/只，7～10天后腹腔注射处于对数生长期的杂交瘤细胞，2×10⁶～5×10⁶细胞/只；每天观察小鼠腹水生成情况，待小鼠腹部明显膨胀时收集腹水，4000rpm离心10min以去除细胞碎片等杂质，取上清待用。

将收集的腹水用饱和(NH₄)₂SO₄盐析法进行纯化。具体操作为：在2mL预处理的腹水中加入两倍体积的PBS，4℃搅拌，缓慢滴加6mL饱和(NH₄)₂SO₄，使饱和度为50%，4℃静置2h，4℃，12000rpm离心30min；沉淀溶于6mL PBS中，4℃搅拌，缓慢滴加3mL饱和(NH₄)₂SO₄，使饱和度为33%，4℃静置2h，离心取沉淀，重复2次饱和度为33%，最后用适量PBS重悬沉淀，于透析袋中4℃透析过夜，次日移出透析产物，10000rpm离心30min，所得上清即为纯化腹水。纯化后用SDS-PAGE检测纯化效果并测定蛋白浓度。

1.7腹水抗体效价的测定

以原核表达的fliC鞭毛蛋白包被酶标板，将腹水做2倍比稀释，采用间接ELISA方法测定其效价。

1.8单克隆抗体的特异性检测

将本单克隆抗体与本实验室的24个血清型90株沙门氏菌和5种非沙门氏菌进行玻板凝集试验，以此鉴定单抗的特异性。

2实验结果

2.1沙门氏菌鞭毛fliC基因片段PCR特异性结果不同血清型的沙门氏菌均在1500bp处有特异性条带（与预期1518bp相符），而阴性对照未出现条带。结果见图1。

2.2重组蛋白的表达及纯化

经优化确定最佳诱导条件为1mmol/L IPTG，37℃诱导4h，表达的重组蛋白pET-fliC经SDS-PAGE检测，在约56kDa处可见明显的蛋白条带，与预期结果相符，且表达产物呈现包涵体状态。运用尿素变性复性法纯化后的蛋白经SDS-PAGE鉴定其为单一蛋白条带，配成浓度为1mg/mL于-20℃保存。

2.3杂交瘤细胞株的建立

经过融合、筛选和三次亚克隆，最后获得3株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1D6、2G6和3E2。这三株杂交瘤细胞经液氮冻存复苏或体外连续传20代后，仍能稳定分泌抗体。

2.4腹水的纯化及浓度测定

1D6、2G6和3E2三株杂交瘤细胞的腹水经饱和(NH₄)₂SO₄盐析法纯化后，用核酸蛋白检测仪测得蛋白浓度分别为5mg/mL、1.28mg/mL和2.86mg/mL。腹水纯化的SDS-PAGE分析结果见图2。

2.5单抗腹水效价测定结果

对获得的3株杂交瘤细胞株的细胞上清和腹水进行倍比稀释，然后用间接ELISA方法进行效价检测，结果如表1。

表1.三株单抗的ELISA效价鉴定

腹水效价	细胞株	细胞上清效价
			1.024×106	1D6	5.12×104
2.56×105	2G6	1.28×104
			1.024×106	3E2	5.12×105

2.6单克隆抗体特异性的鉴定结果

玻板凝集试验结果表明本实验制备的单克隆抗体与90株沙门氏菌均发生凝集，而与非沙门氏菌均不发生凝集，结果见表2。

表2.玻板凝集试验结果

注:+表示玻板凝集试验结果阳性;-表示玻板凝集试验结果阴性。

Claims (5)

1.一种快速检测沙门氏菌的方法，用抗体试剂对待测样本进行玻板凝集试验检测；其特征在于所述抗体试剂通过下述方法制得：扩增沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因fliC并将其插入表达载体pET-22b(+)，随后将获得的重组质粒载体导入工程菌E.coli BL21(DE3)，进而筛选重组阳性克隆；诱导并纯化重组表达蛋白；制备免疫原并免疫BALB/c小鼠，建立杂交瘤细胞株、筛选阳性细胞株、制备单抗腹水作为检测用抗体试剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述玻板凝集试验的步骤是：取表面洁净普通玻板若干块，同时用灭菌生理盐水将抗体试剂稀释至规定浓度；以移液器吸取一滴约10ul工作浓度的抗体试剂垂直滴于水平放置的玻板表面上；随后迅速滴加等量的待检培养菌液；用灭菌金属环或牙签使抗体试剂与待测菌液充分混合均匀，涂布成直径1-2cm的片状后随即平稳摇动玻板，在2min内观察试验结果；标准判定状况为室温下2min内，以抗体试剂是否与待检菌液产生絮状或颗粒状肉眼可见沉淀将反应结果判定为阳性或阴性。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述杂交瘤细胞株是3E2。

4.用于权利要求1所述检测方法的抗体试剂，其特征在于，是由杂交瘤细胞株3E2制备的单抗腹水。

5.杂交瘤细胞株3E2，其保藏编号是CGMCC NO.8955。

Images