CN105237634A - 一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，包括以下步骤：1多聚甲醛固定制备菌抗原；2菌抗原注射免乳化；3短间隔脉冲注射快速促发免疫；4实体瘤种植复壮瘤细胞；5化学诱导融合；6半流体选择得单克隆杂交瘤；7阴阳性筛选配合得特异性抗体；8多抗作捕捉抗体，单抗作检测抗体组建双抗夹心ELISA。

Description

一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用。

背景技术

食物中毒是一种严重危害人体健康的食源性疾病，大多数食物中毒都是由于有害细菌污染食物照成的，在细菌性食物中毒中，蜡样芽孢杆菌食物中毒比较常见。蜡样芽孢杆菌广泛存在于多种植物性食品及生熟食品中，是一种好氧及兼性厌氧革兰氏阳性杆菌。蜡样芽孢杆菌是一种条件致病菌，可以产生腹泻毒素及呕吐毒素导致食物中毒，有时也能通过菌体感染引起人的眼部疾病，心内膜炎、脑膜炎等疾病。早在1906年就有报告第一起蜡样芽孢杆菌食物中毒，之后许多北欧、东欧国家也报告了类似的中毒症。据我国食品污染物和食源性疾病监测网络统计，2003年，蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒占所有食物中毒事件的4.0％，排在食物中毒的第四位。据统计匈牙利在1960～1968年间，蜡样芽孢杆菌为细菌性食物中毒的第三常见致病菌，该菌所引起的食物中毒事件占总食物中毒的84％。据报道乳品、米、蒸煮的米饭和炒饭、调料、干制品(面粉、奶粉等)、豆类食品、肉制品、焙烤食品等食品都有被蜡状芽孢杆菌的危险，误食带有大量活菌及其肠毒素的食物后可引起呕吐型或腹泻型肠胃炎，对人类的健康有着极大的危害。为控制蜡样芽孢杆菌的危害风险及提高食品安全性，建立一种灵敏度共，特异性好的检测方法是十分必要的。目前蜡样芽孢杆菌检测方法主要有

常规检测

常规细菌学检测是将分离培养后的可疑菌落做溶血试验、生化试验、协同溶血试验、典型运动、动物试验等鉴定，被确定为蜡样芽孢杆菌后进一步进行血清分型鉴定。常规检验步骤为：预处理样品→增菌→分离培养(同时菌数测定)、纯化→革兰氏染色镜检/生化及菌落观察/生化反应试验→肠毒素检查测试.

免疫学检测

蜡样芽孢杆菌常规检测方法虽然操作简便，但是影响因素因素太多，且费时，敏感差。因此，急需更多更加稳定便捷超灵敏的检测技术，以免疫为基础的多种免疫学检测方法包括酶联免疫吸附(ELISA)、放射性免疫法(RIA)、免疫荧光法、免疫电化学发光(IECL)等具有方法特异性、重复性以及敏感性较好，且结合物高度稳定、有效期长、仪器设备简单等诸多优点，是一种具有明显优势的分析方法，因而广泛应用于实验室研究。这些免疫学检测方法都建立在抗原抗体特异结合的基础上，同时利用荧光，放射性，酶标等显色技术而达到检测目的。建立一种良好检测方法的关键在于获得一株特异性好、灵敏度高、性质稳定的抗蜡样芽孢杆菌单克隆抗体，本专利针对此问题制备了一种可以特异性识别蜡样芽孢杆菌的鼠单克隆抗体，并以制备得到的单克隆抗体为核心建立了一种蜡样芽孢杆菌的双抗夹心ELISA的制备方法，为蜡样芽孢杆菌快速高特异性检测方法的建立奠定基础。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种特异性高的单克隆抗体制备方法，并将单抗应用到快速超灵敏蜡样芽孢杆菌双抗夹心ELISA中。

技术方案：本发明提供的一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，包括以下步骤：

1)固定：首先将蜡样芽孢杆菌富集，得到菌块沉淀，然后使用3～5％的多聚甲醛重悬，在20～30℃温度下孵育15～25min，孵育完成后8,000～12,000rpm离心20～30min，洗涤三次离心得到菌抗原沉淀。

2)免乳化：将多聚甲醛固定后的菌抗原沉淀用灭菌生理盐水重悬制备菌抗原悬浮液，用彼得罗夫·霍泽(petrofhausser)细菌计数板计数，根据计数浓度将悬浮液菌浓度调整为10⁹～10⁸，10⁸～10⁷，10⁶～10⁵，10⁵～10⁴cells/mL，然后不添加任何佐剂直接用于动物免疫。

3)短期免疫：选取腹股沟、腋窝、脚蹼的两侧对称的六个位点作为免疫位点，分别在第1,3,6,8,10和13天时以肌肉注射的方式，注射浓度为10⁹～10⁸，10⁸～10⁷，10⁶～10⁵，10⁵～10⁴，10⁵～10⁴，10⁵～10⁴cells/mL无免疫佐剂辅助的菌抗原悬浮液。

4)实体瘤种植：取6～8周龄的免疫缺陷型小鼠BABL/c，制备SP2/0骨髓瘤RPMI1640悬浮液，悬浮液的细胞浓度调整为1～10×10⁷cells/mL，以皮下注射方式注射到小鼠颈部，8～10天后观察出现明显凸起，并有拇指大硬块即为实体瘤；

5)细胞融合：融合用骨髓瘤悬浮液是将实体瘤取出利用组织研磨器及细胞筛制备得到，淋巴细胞及脾细胞混合悬浮液是用血清效价最高的小鼠肠系淋巴结、腹股沟淋巴结及脾脏经组织研磨器研磨及过筛处理制备完成，骨髓瘤细胞悬浮液与淋巴脾细胞混合悬浮液的混合比例是5～10:1，混合容器是40～60mL离心管，离心转数是1500～1800rpm，离心时间为7～10min，融合温度为35～40℃，化学诱导剂为30～50％PEG1450，加诱导剂的时间范围是80～100s，静置孵育时间为0.5～1.5min，不完全培养基为RPMI1640；

6)了选择性培养：配置80～100mL含有1.5～2.5ml选择性成分H(次黄嘌呤)A(腺嘌呤)T(胸腺嘧啶)，10～20％胎牛血清、0.5～1.5ml三抗、0.5～1.5ml非必须氨基酸、70～80mLRPMI1640的液体完全培养基。90～110mL液体完全培养基添加0.5～1.5g羧甲基纤维素，使其成为半流体状培养基；融合完成的细胞均匀分散于半流体培养基后，分装到6孔细胞培养板，放于二氧化碳培养箱静置培养7～10天，获得杂交瘤细胞。

7)消减筛选：将半流体培养基上出现的白色克隆点，挑人96孔细胞培养板连续培养取上清；首先以蜡样芽孢杆菌为筛选抗原，利用间接ELISA为筛选手段，筛选出的阳性杂交瘤细胞，继续培养将阳性上清继续进行阴性筛选，选取蜡样芽孢杆菌相似菌作为筛选抗原，利用间接ELISA得到的不与相似抗原有ELISA反应的即为特异性识别蜡样芽孢杆菌的杂交瘤细胞上清。

8)双抗夹心ELISA：将16～20ug/mL的兔多克隆抗体包被到聚乙烯酶标板上作为捕获抗体，洗涤，封闭，加入处理好的待测样37℃孵育，洗涤，加入稀释度为1:1000的单克隆抗体作为检测抗体，洗涤，加入酶标二抗羊抗鼠HRP-IgG，洗涤，加入显色底物，加入硫酸终止；

9)试剂盒：将抗体及标准品装入1.5～2mL棕色玻璃瓶，10×洗涤液装入5～10mL的白色PE塑料瓶。固相载体为可拆卸96孔聚苯乙烯(PS)酶标板。双封闭①为0.05％BSA，双封闭剂②为0.05％脱脂奶粉。干燥方式为低温冷冻干燥，即-60～90℃抽真空干燥

有益效果

本发明提供的蜡样芽孢杆菌的单克隆抗体制备方法得到的单克隆抗体效价高、特异性好，灵敏度高具有极大的应用优势。

该方法采用多聚甲醛固定法对全细胞蜡样芽孢杆菌进行表面抗原固定处理，与传统的沸水浴加热法相比，其显著优点是：多聚甲醛可以使得菌表面组分迅速固定，极大的降低了传统沸水浴加热制备抗原时对表面组分的破坏，使得菌表面形态最大程度与活菌表面学性质一致，使得制备得到的抗体可以特异灵敏的识别活菌。

结合制备菌抗原的水不溶解性，该方法采用了注射抗原免乳化的预处理方式，保证了有效促发动物免疫的同时，消除了佐剂对脊椎动物肉芽瘤的毒性，保证了实验操作时的动物福利。

该方法创新的采用了短期间隔脉冲免疫，选取临近外周免疫器官淋巴结的腹股沟、腋窝、脚蹼两侧对称肌肉为免疫位点，较传统免疫方法在极短时间内促发机体对菌抗原的免疫反应，短期内得到分化成熟的淋巴细胞供融合用。

配合短期间隔脉冲免疫该方法还优化了菌抗原的免疫用量，以期避免大剂量会导致疫抑制，小剂量导致免疫剂量不足而使得免疫促发不能得以进行。

为了提高融合用小鼠骨髓瘤细胞的活力，本文采用体表种植骨髓瘤细胞实体瘤的方法对细胞进行复壮，大大提高了杂交瘤细胞的融合率，成活率及生长效率，大大提高了目标杂交瘤细胞的筛选效率。

该方法配合短期间，融合细胞选取的是淋巴结细胞与脾细胞的混合悬浮液，最大程度保证杂交瘤细胞的抗体分泌率。

该方法为了有效规避有限稀释方法筛选杂交瘤细胞的工作量，采用羧甲纤维素增稠剂，是液体培养基具有一定的粘性，限制细胞移动，因此单个杂交瘤细胞可以在局部区域形成白色单菌落，这为单克隆杂交瘤细胞的获得极大减轻工作量。

该方法独特的采用消减筛选的方法，分别对待筛选杂交瘤细胞进行阳性筛选和阴性筛选，以期得到分泌高特异性与蜡样芽孢杆菌结合而与蜡样芽孢杆菌相似菌不结合的单克隆杂交瘤细胞株。

附图说明

图1为短间隔脉冲免疫与传统免疫比较图,图1中，横坐标轴1是传统免疫方法，横坐标轴2是创新免疫方法，纵坐标轴3是免疫血清的效价；4是传统免疫方法的免疫周期为2周，5是创新免疫方法的免疫周期为9周；6,7,8,9分别是各个组免疫小鼠的编号，分别是No.A，No.B，No.C，No.D。

图2为消减筛选示意图，其中1：阳性筛选，2：阴性筛选，3：洗涤，4：去除非分泌及非结合杂交瘤细胞，5：收集分泌mAb的杂交瘤细胞，6：去除结合mAb，7：抗蜡样芽孢杆菌杂交瘤细胞，8：杂交瘤库，9：消减筛选，10：结合，11：洗涤

图3为蜡样芽孢杆菌单克隆抗体的SDS～PAGE电泳图，其中1：Marker，2：多抗，3：单抗，4：单抗，5：腹水，6：上清

图4为免疫位点说明示意图；1腋窝，2腹股沟,3脚蹼。

具体实施方案

通过下面的实施例对本发明做进一步的详细说明。

蜡样芽孢杆菌全细胞抗原的制备

将本实验室的蜡样芽孢杆菌复苏活化。配置LB培养基(每升中称取胰蛋白胨10g、酵母酵粉5g和NaCl10g，pH7.0)，在121℃下高压灭菌20分钟。在无菌环境条件下，将1mL～80℃保存的蜡样芽孢杆菌添加到25mL液体培养基中，37℃，220rpm的培养箱中培养15h。10,000rpm离心25min弃上清，得到菌沉淀。配置无菌生理盐水，称取0.9gNaCl溶于100mL蒸馏水中，121℃下高压灭菌20分钟。用无菌生理盐水将上述菌沉淀重悬，10，000rpm离心20min，倒掉上清，往复循环洗涤3次，最后一次菌块沉淀，用4％多聚甲醛重悬室温孵育20min，然后执行3次离心洗涤，最后菌抗原利用蒸馏水重悬。

3、蜡样芽孢杆菌抗原的短间隔脉冲免疫

第1次免疫

将蜡样芽孢抗原(浓度为6×10⁸cfu/ml)均分为6份，肌肉注射方式给每只7周龄的BABL/c小鼠，注射位点为腹股沟、腋窝、脚蹼两侧，每个位点注射量为50uL。

第2次免疫

第1次免疫完成2天后，进行第2次免疫，免疫方案如上，只是将菌抗原浓度调整为6×10⁷cfu/ml。

第3次免疫

第2次免疫完成3天后，进行第3次免疫，只是将菌抗原浓度调整为6×10⁵cfu/ml。。

第4次免疫

第3次免疫完成2天后，进行第4次免疫，免疫方案同2)，只是将菌抗原浓度调整为6×10⁴cfu/ml。

第5次免疫(取血前加强免疫)

第3次免疫完成2天后，进行第4次免疫，免疫方案同2)，只是将菌抗原浓度调整为6×10⁴cfu/ml。第4次免疫完成7天后进行断取血，取上清用ELISA测血清的效价，效价达到了28.6万以上。

融合前三天，对小鼠进行加强免疫，将浓度为6×10⁸cfu/ml的菌抗原以腹腔注射的方式注入小鼠体内。

4、实体瘤种植

取7周龄的免疫缺陷型小鼠BABL/c，观察其形态，毛色顺滑光泽，取出液氮冻存的SP2/0复苏，制备SP2/0骨髓瘤RPMI1640悬浮液，悬浮液的细胞浓度调整为4×10⁷cells/mL，以皮下注射方式注射到小鼠颈部，8～10天后观察出现明显凸起，并有拇指大硬块即为实体瘤。

5、消减筛选

阳性筛选间接ELISA操作步骤。

(1)包被：利用包被缓冲液(pH9.6)稀释蜡样芽孢杆菌浓度至10⁸cells/mL，酶标板每孔添加100μL，4℃过夜，甩干，PBST洗板三次，扣干；

(2)封闭：酶标板每孔滴加200μL0.05％BSA及0.05％BSA双成分封闭液，37℃温育2h，甩干，PBST洗板三次，扣干；

(3)细胞培养上清检测：将96孔细胞培养板连续培养的细胞上清加入到已经封闭好的酶标板，每孔添加100μL，PBS作为阴性对照，37℃温育1h，甩干，PBST洗板三次，扣干；

(4)二抗反应：羊抗鼠IgG:HRP酶标二抗用PBS作1:7000稀释，酶标板每孔滴加100μL，37℃温育1h，甩干，PBST洗涤六次，扣干；

(5)显色反应：酶标板每孔滴加100μL底物显色液，37℃避光温育15min；

(6)终止反应：酶标板每孔滴加50μL反应终止液，于450nm处测定吸光值；

(7)保存并分析数据，以待测孔OD450≥阴性孔OD450的2.1倍，判为阳性。

阴性筛选间接ELISA。

阴性筛选间接ELISA的筛选步骤，与阳性筛选基本一致，只是在包被抗原处有所差异，阴性筛选的包被抗原为蜡样芽孢杆菌的相似菌。其中蜡样芽孢杆菌的相似菌为苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，产期荚膜杆菌。

Claims (10)

1.一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)固定：使用一定浓度的多聚甲醛在合适的温度下孵育处理，使得蜡样芽孢杆菌的表面成分固定，得到的菌抗原的抗原决定簇与活菌的状态一致，然后离心洗涤，得到菌抗原；

(2)免乳化：将固定好的蜡样芽孢杆菌的用生理盐水悬浮调至合适菌浓度，准备动物免疫；

(3)短间隔脉冲免疫：选择六个外周免疫位点以肌肉注射方式，在短间隔脉冲免疫期内，将制备得到的细菌抗原悬浮液注射到免疫缺陷型小鼠体内；

(4)实体瘤种植：将免疫缺陷型小鼠的骨髓瘤细胞制备细胞悬浮液，并以一定密度注射给小鼠，待一定期限后，出现有明显凸起的实体瘤；

(5)细胞融合：选血清滴度高的小鼠供脾脏及淋巴结，制备脾脏及淋巴细胞混合悬浮液与一定比例的骨髓瘤细胞悬浮液混匀离心，扣干，在一定时间范围内加入一定浓度的化学诱导融合剂，在一定温度范围内静置孵育一定时间，加入不完全培养基终止反应；

(6)半流体选择性培养：向含有选择性成分HAT的完全培养基添加一定质量的增稠剂使得培养基成为半流体状，将融合细胞均匀分散在半流体培养基，于二氧化碳细胞培养箱培养；

(7)消减筛选：将获得杂交瘤细胞上清，首先进行一定轮数的阳性筛选，然后进行相应轮数的阴性筛选，得到的杂交瘤细胞即为所取；

(8)双抗夹心ELISA：以合适浓度的抗蜡样芽孢杆菌的兔多克隆抗体包被到固相载体上作为捕获抗体以合适稀释度的单克隆抗体为检测抗体，借助酶标二抗建立双抗夹心ELISA检测方法；

(9)试剂盒：将ELISA各组分抗体、洗涤液、标准品等装填入玻璃瓶及塑料瓶，选取合适固相载体，进行预包被、双封闭剂封闭，干燥后装入试剂盒。

2.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，其特征在于：步骤(1)中，所述的蜡样芽孢杆菌固定方法是用3～5％的多聚甲醛在20～30℃温度下孵育15～25min，离心条件为8,000～12,000rpm离心20～30min，洗涤三次后离心得菌抗原沉淀。

3.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，其特征在于：步骤(2)中，将步骤(1)制备的菌沉淀用灭菌生理盐水重悬制备菌悬浮液，用彼得罗夫·霍泽(petrofhausser)细菌计数板调整为10⁹～10⁸，10⁸～10⁷，10⁶～10⁵，10⁵～10⁴cells/mL准备动物免疫。

4.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，其特征在于：步骤(3)中，六个外周免疫位点为腹股沟、腋窝、脚蹼的两侧对称位点，短间隔免疫脉冲是指在第1,3,6,8,10和13天时以肌肉注射的方式，注射浓度为10⁹～10⁸，10⁸～10⁷，10⁶～10⁵，10⁵～10⁴，10⁵～10⁴，10⁵～10⁴cells/mL无免疫佐剂辅助的菌抗原悬浮液。

5.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，其特征在于：步骤(4)中，免疫缺陷型小鼠为BABL/c小鼠，周龄为6～8周，骨髓瘤细胞为SP2/0瘤细胞，重悬液是RPMI1640，骨髓瘤悬浮液的浓度是1～10×10⁷cells/mL，注射方式是皮下注射，注射部位为颈部，8～10天后观察出现明显凸起，并有拇指大硬块即为实体瘤。

6.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，其特征在于：步骤(5)中，融合用骨髓瘤悬浮液是将实体瘤取出利用组织研磨器及细胞筛制备得到，淋巴细胞及脾细胞混合悬浮液是用血清效价最高的小鼠肠系淋巴结、腹股沟淋巴结及脾脏经组织研磨器研磨及过筛处理制备完成，骨髓瘤细胞悬浮液与淋巴脾细胞混合悬浮液的混合比例是5～10：1，混合容器是40～60mL离心管，离心转数是1500～1800rpm，离心时间为7～10min，融合温度为35～40℃，化学诱导剂为30～50％PEG1450，加诱导剂的时间范围是80～100s，静置孵育时间为0.5～1.5min，不完全培养基为RPMI1640。

7.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，其特征在于：步骤(6)中，80～100mL完全培养基含有1.5～2.5ml选择性成分H(次黄嘌呤)A(腺嘌呤)T(胸腺嘧啶)，10～20％胎牛血清、0.5～1.5ml三抗、0.5～1.5ml非必须氨基酸、70～80mLRPMI1640，90～110mL液体完全培养基含有0.5～1.5g羧甲基纤维素。

8.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，其特征在于：步骤(7)中获得抗体上清的方式是将半流体培养基上出现的白色克隆点，挑人96孔细胞培养板连续培养取上清；抗体上清的阳性筛选是以蜡样芽孢杆菌为筛选抗原，以间接ELISA为筛选手段，筛选出的阳性上清继续进行阴性筛选，阴性筛选选取蜡样芽孢杆菌相似菌作为筛选抗原，蜡样芽孢杆菌的相似菌为苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，产期荚膜杆菌，间接ELISA为筛选方法，得到的杂交瘤细胞即为所取。

9.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，其特征在于：步骤(8)中，兔多克隆抗体的包被浓度为16～20ug/mL，单克隆抗体的稀释度为1:800～1200，酶标二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG。

10.根据权利要求1所述的一种蜡样芽孢杆菌单克隆抗体制备方法及应用，其特征在于：步骤(9)中，抗体及标准品装入1.5～2mL棕色玻璃瓶，10×洗涤液装入5～10mL的白色PE塑料瓶；固相载体为可拆卸96孔聚苯乙烯(PS)酶标板；双封闭①为0.05％BSA，双封闭剂②为0.05％脱脂奶粉；干燥方式为低温冷冻干燥，即-60～90℃抽真空干燥。