CN110257342A - 一株吉他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株sml及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一株吉他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株SML及其应用，属于食品安全免疫检测领域。杂交瘤细胞株SML，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.17392。本发明将吉他霉素的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化，免疫BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，最后用吉他霉素完全抗原冲刺免疫。将高效价，低IC50小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，培养，筛选；再经过间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，最终得到一株单克隆抗体杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对吉他霉素具有较好的特异性和检测灵敏度，可实现对水产品中吉他霉素残留量的检测，具有实际应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及一株吉他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株SML及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
吉他霉素(KIT)是由链霉菌所产生的一种多组分的大环内酯类抗生素。抗菌性能与红霉素近似，对革兰氏阳性菌，如葡萄球菌、化脓性链球菌、绿色链球菌、肺炎链球菌、破伤风杆菌、白喉杆菌等有较强的抑制作用。用于防治畜禽细菌感染和霉形体病等以及用作促生长剂。KIT属于脂溶性药物，在环境中会长时间残留，引起水体和土壤的污染，并可能通过食物链进入人体，对人体器官产生一定程度的损害，甚至可能导致耐药细菌的出现。很多国家都规定了KIT的最高残留标准，其中我国农业部规定畜禽中KIT的最高残留限量为0.2ppm。
目前检测KIT的方法主要有高效液相色谱法（HPLC）、液质联用法（LC/MS）等仪器检测方法，而免疫分析方法相对较少。其中仪器检测方法检测准确，但仪器昂贵，操作复杂，时间长，样品前处理繁琐。免疫分析方法相对于仪器检测方法，具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。
发明内容
本发明的目的是提供一株吉他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株SML及其应用，由该细胞株制备的抗体对吉他霉素具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立吉他霉素的免疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株吉他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株SML，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17392。
吉他霉素单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.17392的吉他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株SML分泌产生。
所述吉他霉素单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中吉他霉素残留的分析检测。
本发明提供的吉他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株SML的制备方法，基本步骤为：
（1）半抗原的制备：采用CMO法制备半抗原KIT-CMO。
具体方法如下：称取200mg KIT于圆底烧瓶中，加入30mg，0.24mmol的CMO，加入5mL甲醇和5mL，0.02 M NaHCO3缓冲溶液，置于60℃恒温磁力搅拌水浴锅中进行反应12h，反应结束后，反应液用氮吹仪吹干，粘附于瓶底的衍生物用无水甲醇再次复溶，离心除去不溶白色颗粒物质（主要除去提供碱性环境的NaHCO3颗粒），并取甲醇相再次吹干以获得白色吉他霉素肟化衍生物（KIT-CMO）。置于4℃冰箱保存备用。
（2）完全抗原的制备：采用活化酯（EDC）法合成免疫原KIT-EDC -BSA, 采用羰基二咪唑（CDI）法合成包被原KIT-CDI-OVA。
KIT-EDC-BSA合成的具体步骤如下：称取2.61mg半抗原KIT-CMO，7.64 mg EDC，4.6mg NHS 于棕色反应瓶中，加入200µL DMF溶解，室温下搅拌12h，称A液；取10.0mg BSA加入到2mL 0.01M 碳酸盐缓冲溶液（pH=9.6）中，称B液；将A液逐滴加入到B液中，室温下搅拌反应过夜，随后将反应液装入煮过的透析袋中，用0.01M PBS透析三天，每隔12h更换一次透析液，即得到免疫原KIT-EDC-BSA，将免疫原分装保存于-20℃。
KIT-CDI-OVA合成的具体步骤如下：称取一定量的KIT-CMO与CDI用无水DMF溶解，其中KIT-CMO与CDI的摩尔比为1：10，37℃活化2h，称C液；称取10.0 mg OVA，用2mL 0.01M碳酸盐缓冲溶液（pH = 9.6）溶解，称D液；将C液逐滴加入到D液中，磁力搅拌8~10h。反应结束后，用0.01M PBS充分透析后，鉴定偶联成功后，分装后置于-20℃冰箱保存待用。
（3）动物免疫与效价测定：采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c 雌性小鼠，首次免疫用100μg 偶联抗原与等量福氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μg 偶联抗原与等量福氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量偶联抗原加强免疫一次；冲刺免疫剂量再减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制；
其具体ELISA 程序如下：
a、包被：将包被抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μL/孔，37℃孵育2 h；
b、洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μL PBST溶液，置于摇床上振荡3 min，甩干，洗涤3次；以下洗涤方法相同；
c、封闭：拍干后，加入200 μL /孔封闭液，37℃孵育2 h。洗涤后烘干备用；
d、加样：酶标板上半部分加入PBS，50 μL/孔（上半部分称为0标），下半部分加入一定浓度的KIT标准品，将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50 μL/孔（下半部分成为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30 min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100 μL/孔，37℃孵育30 min，洗涤后拍干；
e、显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100 μL的显色液（TMB与底物液比例1:5），37℃避光反应15 min；
f、终止和测定：取出酶标板，每孔加入50 μL终止液（2 mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值A450；
g、结果判读：以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照，加标OD值为0标一半的即是所加的标准品浓度。
（4）细胞融合与筛选：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为1450）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、将脾细胞和SP2/0细胞按照10:1（数量比）的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对KIT具有较好抑制的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌吉他霉素单克隆抗体的细胞株。
（5）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于 -20℃保存。
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株SML分泌的单克隆抗体，对吉他霉素具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为1.99ng/mL），可实现对水产品中吉他霉素残留量的检测，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株吉他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株SML，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号为CGMCC No.17392。
附图说明
图1 KIT-CMO 的液质联用鉴定图谱。
图2 KIT抗体的标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对KIT有较好灵敏度的通用性单克隆抗体。
实施例1 吉他霉素单克隆抗体的制备
（1）半抗原的制备：采用CMO法制备半抗原KIT-CMO。
具体方法如下：称取200mg KIT于圆底烧瓶中，加入30 mg，0.24mmol的CMO，加入5mL甲醇和5mL，0.02 M NaHCO3缓冲溶液，置于60℃恒温磁力搅拌水浴锅中进行反应12h，反应结束后，反应液用氮吹仪吹干，粘附于瓶底的衍生物用无水甲醇再次复溶，离心除去不溶白色颗粒物质（主要除去提供碱性环境的NaHCO3颗粒），并取甲醇相再次吹干以获得白色吉他霉素肟化衍生物（KIT-CMO）。置于4℃冰箱保存备用。采用液质联用进行鉴定，如附图1所示。
（2）完全抗原的制备：采用活化酯（EDC）法合成免疫原KIT-EDC -BSA, 采用羰基二咪唑（CDI）法合成包被原KIT-CDI-OVA。
KIT-EDC-BSA合成的具体步骤如下： 称取2.61 mg半抗原KIT-CMO，7.64 mg EDC，4.6 mg NHS 于棕色反应瓶中，加入200 µL DMF溶解，室温下搅拌12h；取10.0 mg BSA加入到2 mL 0.01 M 碳酸盐缓冲溶液（pH = 9.6）中；将反应液逐滴加入到BSA溶液中，室温下搅拌反应过夜，随后将反应液装入煮过的透析袋中，用0.01 M PBS透析三天，每隔12h更换一次透析液，即得到免疫原KIT-EDC-BSA，将免疫原分装保存于-20℃。
KIT-CDI-OVA合成的具体步骤如下：称取一定量的KIT-CMO与CDI用无水DMF溶解，其中KIT-CMO与CDI的摩尔比为1：10，37℃活化2 h。称取10.0 mg OVA, 用2 mL 0.01M 碳酸盐缓冲溶液（pH = 9.6）溶解，将反应液逐滴加入到OVA溶液中，磁力搅拌8~10 h。反应结束后，用0.01 M PBS充分透析后，鉴定偶联成功后，分装后置于-20℃冰箱保存待用。
（3）动物免疫与效价测定：采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c 雌性小鼠，首次免疫用100 μg 偶联抗原与等量福氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μg 偶联抗原与等量福氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量偶联抗原加强免疫一次；冲刺免疫剂量再减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制；
其具体ELISA 程序如下：
a、包被：将包被抗原用0.05 M pH 9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释，100 μL/孔，37℃孵育2h；
b、洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200 μL PBST溶液，置于摇床上振荡3 min，甩干，洗涤3次。以下洗涤方法相同；
c、封闭：拍干后，加入200 μL /孔封闭液，37℃孵育2h。洗涤后烘干备用；
d、加样：酶标板上半部分加入PBS，50 μL/孔（上半部分称为0标），下半部分加入一定浓度的KIT标准品，将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50 μL/孔（下半部分成为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30 min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100 μL/孔，37℃孵育30 min，洗涤后拍干；
e、显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100 μL的显色液（TMB与底物液比例1:5），37℃避光反应15 min；
f、终止和测定：取出酶标板，每孔加入50 μL终止液（2 mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值A450；
g、结果判读：以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照，加标OD值为0标一半的即是所加的标准品浓度。
（4）细胞融合与筛选：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为1450）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；
b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、将脾细胞和SP2/0细胞按照10:1（数量比）的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。
筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对KIT具有较好抑制的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌吉他霉素单克隆抗体的细胞株。
（5）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于 -20℃保存。
使用间接竞争ELISA和间接ELISA，测定单克隆抗体对KIT的IC50为 1.99 ng/mL（附图2）；可以满足目前市场上对吉他霉素免疫检测产品的需求。
该单克隆抗体对其他大环内酯类的IC50和交叉反应率如表1所示。
表1 吉他霉素抗体的交叉反应率
综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。
Claims (6)
1.一株吉他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株SML，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17392。
2.吉他霉素单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.17392的吉他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株SML分泌产生。
3.权利要求2所述吉他霉素单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全检测中吉他霉素残留的分析检测。
4.吉他霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株SML免疫用完全抗原的制备方法，其特征是步骤如下：
（1）半抗原的制备：采用CMO法制备半抗原KIT-CMO；
具体方法如下：称取200mg KIT于圆底烧瓶中，加入30mg、0.24mmol的CMO，加入5mL甲醇和5mL、0.02 M NaHCO3缓冲溶液，置于60℃恒温磁力搅拌水浴锅中进行反应12h，反应结束后，反应液用氮吹仪吹干，粘附于瓶底的衍生物用无水甲醇再次复溶，离心除去不溶白色颗粒物质，并取甲醇相再次吹干以获得白色吉他霉素肟化衍生物KIT-CMO，置于4℃冰箱保存备用；
（2）完全抗原的制备：采用活化酯EDC法合成免疫原KIT-EDC -BSA, 采用羰基二咪唑CDI法合成包被原KIT-CDI-OVA。
5.根据权利要求4所述完全抗原的制备方法，其特征是：步骤（2）中KIT-EDC-BSA合成的具体步骤如下：称取2.61mg半抗原KIT-CMO，7.64mg EDC，4.6mg NHS 于棕色反应瓶中，加入200µL DMF溶解，室温下搅拌12h，称A液：取10.0mg BSA加入到2mL pH=9.6的0.01M的碳酸盐缓冲溶液中，称B液；将A液逐滴加入到B液中，室温下搅拌反应过夜，随后将反应液装入煮过的透析袋中，用0.01M PBS透析三天，每隔12h更换一次透析液，即得到免疫原KIT-EDC-BSA，将免疫原分装保存于-20℃。
6.根据权利要求4所述完全抗原的制备方法，其特征是：步骤（2）中KIT-CDI-OVA合成的具体步骤如下：称取KIT-CMO与CDI用无水DMF溶解，其中KIT-CMO与CDI的摩尔比为1：10，37℃活化2h，称C液；称取10.0 mg OVA，用2mL pH = 9.6、0.01M的碳酸盐缓冲溶液溶解，称D液；将C液逐滴加入到D液中，磁力搅拌8~10h；反应结束后，用0.01M PBS充分透析后，鉴定偶联成功后，分装后置于-20℃冰箱保存待用。
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