CN107523554A - 一株分泌马杜霉素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株ss0708及其应用 - Google Patents

Abstract

一株分泌马杜霉素（MD）特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株SS0708及其应用，属于免疫检测技术领域。本发明通过常规的细胞融合技术制备了一株鼠源的单克隆细胞株SS0708，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14687。该细胞株分泌的单克隆抗体采用间接竞争酶联免疫法测定，对MD的IC₅₀为3.75 ng/mL。该抗体可用于动物源食品中MD残留的免疫检测，满足目前市场上对MD快速免疫检测产品的需求。

Description

一株分泌马杜霉素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株SS0708 及其应用

技术领域

本发明涉及一株分泌马杜霉素（MD）特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备以及应用，涉及MD单克隆抗体的制备方法，以及动物源食品中MD的间接竞争酶联免疫检测方法的建立，属于免疫检测技术领域。

背景技术

马杜霉素（MD）又名马杜米星，是在 1983 年由 Liu 和 Labeda在微生物Actinomadura yumaensis 的发酵产物中分离得到的聚醚类离子载体抗生素的一种。马杜霉素对动物的球虫病具有用药量小、见效快和不易产生耐药性等优点，被广泛添加在畜禽饲料中。然而，这会造成马杜霉素在动物机体内残留、蓄积，食用这些动物组织可引起血管舒张，特别是诱发心脏冠状动脉扩张，引起患有冠状动脉疾病的人群的冠状动脉扩张，使病情恶化，很大程度上危害着人类的健康。我国农业部235公告中规定鸡肉中MD的最大残留标准240μg/kg。

目前，MD的最常用的检测方法为高效液相色谱法等仪器检测方法，该方法耗时长，操作需要掌握相关的专业技术，样品前处理繁琐等。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，因此适用于大量样品的现场快速筛查。

发明内容

本发明的目的在于制备一种能够分泌MD特异性单克隆抗体的细胞株制备方法，建立检测MD的免疫学检测方法。

本发明的技术方案：一株分泌马杜霉素MD特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株SS0708，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14687。

马杜霉素特异性单克隆抗体，其是由所述保藏编号为CGMCC No.14687的杂交瘤细胞株SS0708分泌产生，其IC₅₀为3.75 ng/mL。

所述马杜霉素特异性单克隆抗体的应用，用于动物源食品中MD残留的免疫检测。

提供的MD杂交瘤细胞株的制备方法基本步骤为：

（1）免疫原和包被原的制备：采用活化酯法，将MD与载体蛋白KLH偶联得到的MD-KLH作为免疫原，将MD与载体蛋白OVA偶联得到的MD-OVA作为包被抗原。具体合成步骤如下：步骤1： 称取10mg MD，溶于3 mL 0.1 M pH 6.0的一水合 2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）溶液中；不断搅拌下，先加入24mg N-羟基琥珀酰亚胺，15 min 后，再加入31mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基-碳二亚胺）；在室温下，搅拌2h，得到活化液；步骤2：称取20mg KLH 或者OVA，溶于1mL 0.1 M pH 9.0碳酸盐缓冲溶液中；在不断搅拌下，逐滴加入活化液，室温下，反应4h后，将反应液用0.01 M pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析，即可得到MD-KLH或者MD-OVA。

（2）动物免疫与效价测定：采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c 雌性小鼠，首次免疫用100μg MD-KLH与等量弗氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μgMD-KLH与等量弗氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量MD-KLH加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，用MD与鸡蛋清白蛋白（OVA）的偶联物MD-OVA作为包被抗原，通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制；

其具体ELISA 程序如下：

1)包被：将包被抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μL/孔，37℃孵育2h；

2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μL PBST溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次；以下洗涤方法相同；

3)封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃孵育2h；洗涤后烘干备用；

4)加样：酶标板上半部分加入0.01 M pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液，50μL/孔（上半部分称为0标），下半部分加入不同浓度的用0.01 M pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液稀释的MD标准品，将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50μL/孔（下半部分称为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；

5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的显色液（TMB与底物液体积比例1:5），37℃避光反应15min；

6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μL终止液（2mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值OD₄₅₀；

7)结果判读：以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照，加标OD值为0标一半的即是所加的标准品浓度。

（3）细胞融合与筛选：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为1450）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

a、无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

b、收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

c、将脾细胞和SP2/0细胞按照10:1（数量比）的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。

筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用MD标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对MD具有较好抑制的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌MD单克隆抗体的细胞株。

（4）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

本发明的有益效果：获得了能够分泌MD特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，可用于动物源食品中MD快速免疫检测方法的建立。

生物材料样品保藏：单克隆细胞株SS0708，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.14687，保藏日期2017年9月5日。

附图说明

图1是SS0708分泌的单克隆抗体的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，将筛选得到的对MD抑制较好的细胞株扩大培养，并经过腹水制备以及纯化，最终得到了具有较好灵敏度的MD单克隆抗体。

实施例1 MD单克隆抗体的制备

1、免疫原和包被原的制备：采用活化酯法，将MD与载体蛋白KLH偶联得到的MD-KLH作为免疫原，将MD与载体蛋白OVA偶联得到的MD-OVA作为包被抗原。具体合成步骤如下：S1. 称取10mg MD，溶于3 mL 0.1 M pH 6.0的一水合 2-（N-吗啡啉）乙磺酸（MES）溶液中；不断搅拌下，先加入24mg N-羟基琥珀酰亚胺，15 min 后，再加入31mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基-碳二亚胺）；在室温下，搅拌2h，得到活化液；S2. 称取20mg KLH 或者OVA，溶于1mL0.1 M pH 9.0碳酸盐缓冲溶液中；在不断搅拌下，逐滴加入活化液，室温下，反应4h后，将反应液用0.01 M pH 7.4的磷酸盐缓冲液透析，即可得到MD-KLH或者MD-OVA。

2、动物免疫与效价测定：采用小剂量短周期方案免疫健康BALB/c 雌性小鼠，首次免疫用100μg MD-KLH与等量弗氏完全佐剂混匀后进行皮下注射，间隔3周后，再用100μgMD-KLH与等量弗氏不完全佐剂加强免疫，此后每隔3周用半量MD-KLH加强免疫一次；冲刺免疫剂量减半，与等体积的生理盐水混合后采用腹腔免疫，用MD与鸡蛋清白蛋白（OVA）的偶联物MD-OVA作为包被抗原，通过间接竞争ELISA检测血清效价和抑制；

其具体ELISA 程序如下：

1)包被：将包被抗原用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液梯度稀释，100μL/孔，37℃孵育2h；

2)洗涤：将板内溶液倾去，每孔注入200μL PBST溶液，置于摇床上振荡3min，甩干，洗涤3次；以下洗涤方法相同；

3)封闭：拍干后，加入200μL /孔封闭液，37℃孵育2h；洗涤后烘干备用；

4)加样：酶标板上半部分加入0.01 M pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液，50μL/孔（上半部分称为0标），下半部分加入不同浓度的用0.01 M pH 7.4 磷酸盐缓冲溶液稀释的MD标准品，将抗血清从1:1000开始梯度稀释，50μL/孔（下半部分称为加标），上下部分对应加入不同稀释梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育30min，洗涤后拍干；

5)显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的显色液（TMB与底物液体积比例1:5），37℃避光反应15min；

6)终止和测定：取出酶标板，每孔加入50μL终止液（2mol/L的硫酸）终止反应，然后用酶标仪测定各孔的吸光值OD₄₅₀；

7)结果判读：以OD值大于或等于阴性血清对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。上下部分对照，加标OD值为0标一半的即是所加的标准品浓度。

3、细胞融合：在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为1450）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照10:1（数量比）的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2 %的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃，5% CO₂的培养箱中培养。

4、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。

筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用MD标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选出对MD标准品均具有较好抑制的孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，即可得到能稳定分泌MD单克隆抗体的细胞株。

5、单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

使用间接竞争ELISA和间接ELISA，测定单克隆抗体对MD的半数抑制率IC₅₀为3.75ng/mL；为动物源食品中MD的快速免疫检测提供了可能。

该单克隆抗体的ELISA标准曲线如附图所示。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株能分泌马杜霉素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株SS0708，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14687。

2.马杜霉素特异性单克隆抗体，其特征在于：其是由权利要求1所述保藏编号为CGMCCNo.14676的杂交瘤细胞株SS0708分泌产生，其IC₅₀为3.75 ng/mL。

3.权利要求2所述马杜霉素特异性单克隆抗体的应用，其特征在于用于动物源食品中马杜霉素残留的免疫检测。