CN105087498B - 一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株1B2已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No. 10862。本发明将苯噻氰完全抗原与等量福氏免疫佐剂混合均匀后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。将免疫的小鼠的脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株1B2。此细胞株1B2分泌的单克隆抗体，对苯噻氰具有非常好的特异性，检测灵敏度（IC₅₀值为7μg/L）可以用于食品接触相关材料中苯噻氰的迁移量检测。

Description

一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测领域。

背景技术

苯噻氰（TCMTB）是一种十分经济、有效的绿色杀菌剂，它与美国Buckmam公司的BUSAN30L，法国Progiven公司的BIOCIDE MT30均属同一类产品，它能有效地应用于种子处理，对存在的主要细菌、真菌和藻类都有极强的灭杀和控制作用，对于种子拌种、浸种和喷雾治疗炭疽、稻瘟、猝倒、立枯和柑橘溃疡等病害有特效，因此，苯噻氰及其代谢产物在植物与土壤都有较大的残留。

目前检测苯噻氰的方法主要有气相色谱法（GC），液相色谱法（HPLC），分光光度法、电化学测定法、气质联用法等方法。但是这些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测，因此建立一种快速简便的苯噻氰检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异性和高灵敏度的单克隆单体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

发明内容

本发明的目的是提供一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对苯噻氰具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立苯噻氰的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为1B2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10862。

所述苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株1B2的制备，步骤为：

1）完全抗原的合成：

A液的制备：称取28.6mg TCMTB类似物2-苯并噻唑硫代乙酸BTAC，EDC（碳二亚胺）38.3mg，NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）23.0mg，用1mL无水DMF溶解，称为A液，室温搅拌反应8h；

B液的制备：称取BSA（牛血清蛋白） 112mg溶于20mL pH7.4的0.01mol/L PBS中，得到B液；

在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，得到偶联物BTAC-BSA混合液即为苯噻氰完全抗原，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

2）小鼠的免疫：

苯噻氰完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂；首免与加强免之间间隔一个月，加强免3次，加强免之间间隔21天；最后用苯噻氰完全抗原，不含佐剂，冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；

3）细胞融合与细胞株建立：

通过聚乙二醇PEG 4000法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株1B2；

4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ELISA法测定灵敏度和特异性。

通过苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株1B2分泌产生苯噻氰单克隆抗体。

将苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株1B2通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于食品接触相关材料中苯噻氰的快速检测，具体步骤如下：

（1）包被：将包被原TCMTB-OVA用0.05M pH 9.6 碳酸盐缓冲液从2µg/mL开始倍比稀释，100µL/孔，37℃反应2h；

（2）洗涤：将酶标板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

（3）封闭：拍干后，加入200µL/孔封闭液，37℃反应2h；洗涤后烘干备用；

（4）加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100µL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100µL/孔，37℃反应1h；

（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100µL的TMB显色液，37℃避光反应15min；

（6）终止和测定：每孔加入50µL 2M H₂SO₄终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值；

（7）结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即P/N≥2.1，所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价；

（8）标准曲线：配置0，1，2，5，10，20，50，100μg/L苯噻氰标准溶液，采用间接竞争ELISA绘制标准曲线，其IC₅₀为7μg/L。

溶液的配置如下：

碳酸盐缓冲液CBS：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液PBS：8.00 g NaCl，0.2 g KCl，0.2 g KH₂PO₄，2.9 g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05% 吐温-20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60mg TMB 溶于100mL乙二醇中；A、B液按1︰5体积比混合即为TMB显色液，现用现混。

本发明的有益效果：本发明获得的抗苯噻氰单克隆抗体细胞株，对苯噻氰有较好的检测灵敏度和特异性（IC₅₀值为7μg/L）。

生物材料样品保藏：一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株1B2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC No. 10862，保藏日期2015年5月19日。

附图说明

图1是1B2单克隆抗体的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将苯噻氰完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对苯噻氰有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例1 杂交瘤细胞株1B2的制备

（1）完全抗原的合成

称取28.6mg TCMTB类似物2-苯并噻唑硫代乙酸（BTAC），EDC（碳二亚胺）38.3mg，NHS（N-羟基琥珀酰亚胺）23.0mg，用1mL无水DMF溶解（称为A液），室温搅拌反应8h。称取BSA（牛血清蛋白） 112mg溶于20mL pH7.4的0.01mol/L PBS中（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，得到偶联物BTAC-BSA混合液即为苯噻氰完全抗原，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（2）动物免疫

选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取苯噻氰完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免3次，加强免之间间隔21天。三免后7天采血，使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在四免后18天冲击免疫，只使用苯噻氰完全抗原，不使用佐剂，腹腔注射。

（3）细胞融合

在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照1︰10 的计数比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

（4）细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HAT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用苯噻氰为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对苯噻氰标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株1B2。

实施例2 苯噻氰单克隆抗体的制备

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞株1B2，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

使用间接竞争ELISA，测定苯噻氰单克隆抗体的IC₅₀为：7μg/L，说明对苯噻氰有很好的灵敏度，可用于苯噻氰免疫分析检测。

实施例3 苯噻氰单克隆抗体的应用

将杂交瘤细胞株1B2通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于苯噻氰的快速检测，具体步骤如下：

（1）包被：将包被原TCMTB-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从2µg/mL开始倍比稀释，100µL/孔，37℃反应2h；

（2）洗涤：将酶标板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；

（3）封闭：拍干后，加入含0.01%明胶的碳酸盐缓冲液作封闭液，200µL/孔，37℃反应2h；洗涤后烘干备用；

（4）加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100µL/孔，37℃反应1h；充分洗涤后，用含0.01%明胶的PBS加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100µL/孔，37℃反应1h；

（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100µL的TMB显色液，37℃避光反应15min；

（6）终止和测定：每孔加入50µL 2M H₂SO₄终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值；

（7）结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N≥2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。

（8）标准曲线：配置0，1，2，5，10，20，50，100μg/L苯噻氰标准溶液，采用间接竞争ELISA绘制标准曲线，其IC₅₀为7μg/L。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2 g KCl，0.2 g KH₂PO₄，2.9 g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；

PBST：含0.05% 吐温-20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按1︰5体积比混合即为TMB显色液，现用现混。

1B2单克隆抗体的交叉反应率如表1所示。

表1

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims (3)

1.一株苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株，其命名为1B2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 10862。

2.苯噻氰单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No. 10862的苯噻氰单克隆抗体杂交瘤细胞株1B2所分泌产生。

3.权利要求2所述苯噻氰单克隆抗体的应用，其特征在于：其应用于食品接触相关材料中苯噻氰的快速检测。