CN106754735A

CN106754735A - 一株抗尼卡巴嗪残留标志物dnc单克隆抗体杂交瘤细胞株gw及其应用

Info

Publication number: CN106754735A
Application number: CN201611109676.XA
Authority: CN
Inventors: 匡华; 丁西; 胥传来; 徐丽广; 马伟; 吴晓玲; 刘丽强; 宋珊珊; 郑乾坤
Original assignee: DELISI GROUP Ltd; Jiangnan University
Current assignee: DELISI GROUP Ltd; Jiangnan University
Priority date: 2016-12-06
Filing date: 2016-12-06
Publication date: 2017-05-31

Abstract

一株抗尼卡巴嗪残留标志物DNC单克隆抗体杂交瘤细胞株GW及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明杂交瘤细胞株GW，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12014。抗尼卡巴嗪残留标志物（DNC）单克隆抗体，它由所述杂交瘤细胞株GW分泌产生。此细胞株GW分泌的单克隆抗体，对尼卡巴嗪残留标志物（DNC）具有较好的特异性（IC₅₀值为5μg/L），有较好的检测灵敏度和亲和力，可用于食品安全中尼卡巴嗪残留的特异性检测。

Description

一株抗尼卡巴嗪残留标志物DNC单克隆抗体杂交瘤细胞株GW 及其应用

技术领域

本发明涉及一株抗尼卡巴嗪残留标志物DNC单克隆抗体杂交瘤细胞株GW及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。涉及单克隆细胞株GW及其产生的抗尼卡巴嗪残留标志物（DNC）单克隆抗体。

背景技术

尼卡巴嗪为二硝基均二苯脲和羟基二甲基嘧啶组成的1:1复合物，其中二硝基均二苯脲（DNC）被视为尼卡巴嗪残留的标志物。作为一种广谱、高效、性能稳定的抗球虫饲料药物添加剂，它具有较强的抗原虫作用，同时对球虫病也有一定的防治作用。主要用以预防鸡盲肠球虫(柔嫩艾美耳球虫)和堆型、巨型、毒害、布氏艾美耳球虫(小肠球虫)。据试验，感染球虫后48h内用药，能有效地抑制球虫发育，若用药迟过72h，则效果明显降低。且尼卡巴嗪推荐剂量对机体对球虫免疫力很少或没有影响。在防治鸡球虫病的同时，它还能促进鸡的生长发育，节约饲料，提高养鸡的经济效益。然而，作为抗球虫药物，其在家禽肌肉及组织中会造成不同程度的残留，而大部分药物随粪便排出体外。这些粪便用以农业施肥，从而给生态环境带来不利影响，进而威胁到人民的生命健康。

目前检测尼卡巴嗪的方法主要是气相色谱法(GC)、液相色谱法(HPLC)、液质联用法（LC-MS）、液相二级质谱（LC-MS/MS）等仪器方法，但是这些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测，因此建立一种快速简便的尼卡巴嗪残留检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异性和检测灵敏度的单克隆单体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对尼卡巴嗪残留标志物（DNC）具有较好特异性和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。

本发明提供一种抗尼卡巴嗪残留标志物（DNC）单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的单克隆抗体对DNC具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立DNC的免疫学检测方法。

本发明提供一种对DNC具有较好特异性和检测灵敏度的单克隆抗体的制备方法。

本发明的DNC单克隆抗体，是由保藏号为 CGMCC No.12014 的小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株GW所分泌。

本发明提供的GW细胞株的制备基本步骤为：

（1）免疫完全抗原的合成：称取Ｎ-琥珀酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酸４-硝基苯胺（SAN,CAS:52299-14-6）4.86 mg（0.01 mmol），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）5.16 mg（0.025 mmol），N-羟基丁二酰亚胺（NHS）3.0 mg（0.025 mmol），将这三种药物溶于0.5 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，调节pH到5.0左右。在室温活化4 h之后，将活化液逐滴加入到溶解6 mg BSA的0.05 M 碳酸盐缓冲液中，室温反应过夜，即得到免疫完全抗原（SAN-EDC-BSA）混合液，通过透析分离偶联产物和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（2）异源包被的制备：称取谷氨酸-γ-ρ-硝基苯胺（ L-γ-Glutamyl-p-nitroanilide，GAN，CAS:67953-08-6） 3.63 mg ，用0.5 mL无水DMF溶解，然后逐滴加入72 µL 2.5% 戊二醛溶液。在室温搅拌活化30 min之后，将活化液逐滴加入到溶解6 mg OVA的0.05 M 碳酸盐缓冲液中，室温反应4 h，即得到异源包被（GAN-戊二醛-OVA）混合液，通过透析分离偶联产物和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（3）小鼠的免疫：尼卡巴嗪完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。最后一次用尼卡巴嗪完全抗原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；

（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株GW；

（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ELISA法测定灵敏度和特异性。

本发明的有益效果：

（1）本发明获得的抗尼卡巴嗪残留标志物（DNC）单克隆抗体细胞株，对DNC有较好的检测灵敏度和特异性（IC₅₀值为5 μg/L）；

（2）一种新的半抗原合成的思路，在于通过衍生得到半抗原，在用异原包被进行检测，得到灵敏度很好的单克隆抗体细胞株。

生物材料保藏保藏：抗尼卡巴嗪残留标志物（DNC）单克隆抗体杂交瘤细胞株GW已于2016年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.12014。该小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株GW也属于本发明的保护范围。

附图说明

图1.单克隆细胞株GW分泌的单克隆抗体对DNC的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将尼卡巴嗪完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对DNC有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例 1：杂交瘤细胞株GW的制备

1、完全抗原的合成

（1）免疫完全抗原的合成：称取将Ｎ-琥珀酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酸４-硝基苯胺（SAN,CAS:52299-14-6）4.86 mg（0.01 mmol），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）5.16 mg（0.025 mmol），N-羟基丁二酰亚胺（NHS）3.0 mg（0.025 mmol），将这三种药物溶于0.5 mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF），调节pH到5.0左右。在室温活化4 h之后，将活化液逐滴加入到溶解6 mg BSA的0.05 M 碳酸盐缓冲液中，室温反应过夜，即得到免疫完全抗原（SAN-EDC-BSA）混合液，通过透析分离偶联产物和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（2）异源包被的制备：称取谷氨酸-γ-ρ-硝基苯胺（ L-γ-Glutamyl-p-nitroanilide，GAN，CAS:67953-08-6） 3.63 mg ，用0.5 mL无水DMF溶解，然后逐滴加入72 µL 2.5%戊二醛溶液。在室温搅拌活化30 min之后，将活化液逐滴加入到溶解6 mg OVA的0.05 M 碳酸盐缓冲液中，室温反应4h，即得到异源包被（GAN-戊二醛-OVA）混合液，通过透析分离偶联产物和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

2、动物免疫

选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取尼卡巴嗪完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。三免后7天采血，使用间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在四免后18天冲击免疫，不使用佐剂，腹腔注射。

3、细胞融合

在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照计数比1︰10 的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃，5% CO₂的培养箱中培养。

4、细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用DNC为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对DNC标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株GW。

5、单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

使用间接竞争ELISA，测定单克隆抗体的IC₅₀分别为：5 μg/L，说明对DNC有很好的灵敏度，可用于尼卡巴嗪残留免疫分析检测。

单克隆抗体的交叉，其交叉实验如表1所示。

表1.GW单克隆抗体的交叉反应率

药物名称	IC₅₀ (μg/L)	CR（%）
			二硝基均二苯脲（DNC）	5	100
羟基二甲基嘧啶	>2000	0.25
			地克珠利	>2000	0.25
盐霉素	>2000	0.25
			二硝托胺	>2000	0.25
莫能霉素	>2000	0.25
			乙氧酰胺苯甲酯	>2000	0.25
磺胺喹噁啉	>2000	0.25

6、抗体应用

将杂交瘤细胞株GW通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于DNC的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

（1）包被：将异源包被原（GAN-戊二醛-OVA）用0.05 M pH 9.6 碳酸盐缓冲液从2 µg/mL开始倍比稀释，100 µL/孔，37℃反应2 h；

（2）洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3 min；

（3）封闭：拍干后，加入200 µL/孔封闭液，37℃反应2 h。洗涤后烘干备用；

（4）加样：将抗血清从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100 µL/孔，37℃反应1 h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100 µL/孔，37℃反应1h；

（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100 µL的TMB显色液，37℃避光反应15min；

（6）终止和测定：每孔加入50 µL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值；

（7）结果判读：以OD₄₅₀值大于或等于阴性对照孔的2.1倍（即P/N ≥ 2.1）所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价；

（8）样品前处理及添加回收：鸡肉匀质后，称取2±0.02 g，置于 50 mL离心管内，加乙腈8.0 mL，涡旋，超声10 min，5000 r/min 离心10 min。取上清液 4.0 mL于40~50℃下氮气吹干，加正己烷1.0 mL，加75%甲醇水溶液1.0 mL，充分涡旋混合，2000 r/min离心10 min，取下层溶液，用样品稀释液5倍稀释后采用间接竞争ELISA法测定。其回收率范围在93%~116%之间，批内、批间变异系数均小于18%。

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59 g，NaHCO₃ 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800 mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000 mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2 g KCl，0.2 g KH₂PO₄，2.9 g Na₂HPO₄·12H₂O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；

PBST：含0.05% 吐温20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43 g，柠檬酸 9.33 g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims

1.一株抗尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株GW，保藏编号为CGMCC No.12014 。

2.抗尼卡巴嗪单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述的杂交瘤细胞株GW所分泌产生。

3.权利要求2所述的抗尼卡巴嗪单克隆抗体的应用，其特征在于在尼卡巴嗪残留分析检测中的应用。