CN110423729A - 一株分泌抗异丙威单克隆抗体的杂交瘤细胞株gty及其应用 - Google Patents

一株分泌抗异丙威单克隆抗体的杂交瘤细胞株gty及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株分泌抗异丙威单克隆抗体的杂交瘤细胞株GTY及其应用，属于食品安全免疫检测领域。杂交瘤细胞株GTY，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.17393。将异丙威的完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化免疫BALB/c小鼠。首免用完全弗氏佐剂，多次加强免用不完全弗氏佐剂，最后一次冲刺免疫。将高效价低IC50小鼠脾细胞，通过PEG法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经培养、筛选；再经间接竞争酶联免疫法筛选细胞并三次亚克隆，得到杂交瘤细胞株GTY。此细胞株分泌的单克隆抗体，对异丙威具有较好的特异性和检测灵敏度，可实现对水果、蔬菜中异丙威残留量的检测，为食品中异丙威残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

Description

一株分泌抗异丙威单克隆抗体的杂交瘤细胞株GTY及其应用
技术领域
本发明涉及一株分泌抗异丙威单克隆抗体的杂交瘤细胞株GTY及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
异丙威，又名叶蝉散、灭扑威，是一种氨基甲酸酯类农药，因其具有胃毒、触杀和熏蒸等作用，广泛用于防治水稻害虫，现已在全世界广泛使用。然而，它对动物和人类都有毒害。近年来由于大量不科学地使用也导致人畜中毒现象时有发生，因此许多国家和地区对这种农药在水果蔬菜中的残留量都制定了严格的限量标准。常用于测定氨基甲酸酯类农药的分析方法有高效液相色谱（HPLC），气相色谱（GC）和HPLC-MS等。每种方法都有其优点，但同时也存在弊端。例如这些方法虽选择性好、灵敏度高，但分析时间长，有机溶剂消耗量大且所使用的仪器昂贵。相比较而言，酶联免疫吸附分析(ELISA)技术因特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、纯化步骤少、分析容量大、检测成本低、适用于做成试剂盒现场筛选等优点在农药残留分析中得到了广泛应用。而建立高效的免疫学检测方法的一个重要前提即需筛选出针对异丙威的高特异性单克隆单体。
发明内容
本发明的目的是提供一株分泌抗异丙威单克隆抗体的杂交瘤细胞株GTY及其应用，由该细胞株制备的抗体对异丙威具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立异丙威的免疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株分泌抗异丙威单克隆抗体的杂交瘤细胞株GTY，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17393。
抗异丙威单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.17393的异丙威单克隆抗体杂交瘤细胞株GTY分泌产生。
所述抗异丙威单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中异丙威残留的分析检测。
本发明提供的抗异丙威单克隆抗体杂交瘤细胞株GTY的制备基本步骤为：
（1）半抗原结构：
（2）完全抗原异丙威-KLH的制备：称取1.5mg 异丙威衍生物（异丙威衍生物与钥孔血蓝蛋白（KLH）摩尔比为3000：1），2.1mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min；再称取3.4mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到衍生物溶液中，室温搅拌反应6-8 h(称为A液)。取8mg KLH，用0.01M硼酸盐缓冲溶液（BB, pH=8.6）稀释至4mg/mL（称为B液），再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原异丙威-KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；
（3）小鼠的免疫：将异丙威完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
（4）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞： 融合前 7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。 融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到 （1-4）×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min： 第1min，将1mL的PEG 4000 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5min。 离心（800 rpm，10 min），弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20%胎牛血清、2% 50×HAT的RPMI-1640选择性培养基（HAT培养基），按照200μL/孔加到 96 孔细胞板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液（HT培养基）进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用异丙威为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对异丙威标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得抗异丙威单克隆抗体细胞株GTY。
（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106 异丙威杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
6.1包被：将包被原异丙威-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1µg/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
6.3封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
6.4加样：酶标板的每孔里先加入50μL异丙威标准品溶液，再加入50μL稀释后的单克隆抗体，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37 ℃避光反应15min；
6.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体异丙威的IC50为：2.09ng/mL，说明对异丙威有很好的灵敏度，可用于异丙威免疫分析检测。
本发明的有益效果：本发明提供的细胞株GTY分泌的单克隆抗体，对异丙威具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为2.09ng/mL），可实现对水果、蔬菜中异丙威残留量的检测，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏：一株抗异丙威单克隆抗体杂交瘤细胞株GTY，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号为CGMCC No.17393。
附图说明
图1 GTY单克隆抗体的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
（1）半抗原结构：
（2）完全抗原异丙威-KLH的制备：称取1.5mg 异丙威衍生物（异丙威衍生物与钥孔血蓝蛋白（KLH）摩尔比为3000：1），2.1mg N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室温搅拌反应10min；再称取3.4mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到衍生物溶液中，室温搅拌反应6-8 h(称为A液)。取8mg KLH，用0.01M硼酸盐缓冲溶液（BB, pH=8.6）稀释至4mg/mL（称为B液），再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原异丙威-KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定；
（3）小鼠的免疫：将异丙威完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，对BALB/c小鼠进行颈背部皮下多点注射免疫（冲刺免疫除外）。首次免疫用完全弗氏佐剂，剂量为100μg/只；多次加强免疫用不完全弗氏佐剂且剂量减半即为50μg/只；冲刺免疫不用佐剂，直接用生理盐水稀释后腹腔注射，剂量再减半即为25μg/只。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔一个月，多次加强免疫之间间隔21天，冲刺免疫与最后一次加强免疫之间间隔18-21天。通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）观测小鼠免疫效果即检测小鼠血清的效价和抑制；
（4）细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
a、小鼠断尾取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入 75% 酒精中消毒，浸泡 5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，离心（1200rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
b、收集SP2/0细胞： 融合前 7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640 培养基在5% CO2培养箱中培养。 融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到 （1-4）×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
c、融合过程7min： 第1min，将1mL的PEG 4000 由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3min 和第4min，在1min内滴加1mL RPMI-1640培养基；第5min 和第6min，在1min内滴加2mL RPMI-1640 培养基；第7min，每10s 滴加1mL 的 RPMI-1640 培养基。然后37℃温浴5min。 离心（800 rpm，10 min），弃上清，细胞轻轻敲散，并向其内加入含20%胎牛血清、2% 50×HAT的RPMI-1640选择性培养基（HAT培养基），按照200μL/孔加到 96 孔细胞板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
（5）细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合后的第3天用HAT培养基对融合细胞进行半换液；第5天用含20% 胎牛血清，1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液（HT培养基）进行全换液；第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA法筛选出阳性细胞孔，第二步选用异丙威为标准品，用ic-ELISA法对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对异丙威标准品有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，七天后用同样的方法进行检测。按上述方法进行三次亚克隆，最终获得抗异丙威单克隆抗体细胞株GTY。
（6）单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106 异丙威杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法进行抗体纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀 IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01 M PBS溶液（pH7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存。
6.1包被：将包被原异丙威-OVA用0.05M pH9.6 碳酸盐缓冲液从1µg/mL开始3倍比稀释，100μL/孔，37℃反应2h；
6.2洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3min；
6.3封闭：拍干后，加入200μL/孔封闭液，37℃反应2h。洗涤后烘干备用；
6.4加样：酶标板的每孔里先加入50μL异丙威标准品溶液，再加入50μL稀释后的单克隆抗体，37℃反应30min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min；
6.5显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37 ℃避光反应15min；
6.6终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD 450值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体异丙威的IC50为：2.09ng/mL，说明对异丙威有很好的灵敏度，可用于异丙威免疫分析检测。
溶液的配置：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12 H2O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；
PBST：含0.05 % 吐温20的PBS；
TMB显色液：A液：Na2HPO4 .12H2O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000mL；B液：60mgTMB 溶于100mL乙二醇中。A、B液按体积比5：1混合即为TMB显色液，现用现混。

Claims (4)

1.一株分泌抗异丙威单克隆抗体的杂交瘤细胞株GTY，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年3月7日，保藏编号CGMCC No.17393。
2.抗异丙威单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.17393的异丙威单克隆抗体杂交瘤细胞株GTY分泌产生。
3.权利要求2所述抗异丙威单克隆抗体的应用，其特征在于：用于食品安全检测中异丙威残留的分析检测。
4.抗异丙威单克隆抗体杂交瘤细胞株GTY免疫用完全抗原的制备方法，其特征是步骤如下：称取1.5mg异丙威衍生物，其中异丙威衍生物与钥孔血蓝蛋白KLH摩尔比为3000：1，2.1mg N-羟基琥珀酰亚胺NHS，溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺DMF中，室温搅拌反应10min；再称取3.4mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，用100μL DMF充分溶解后，加入到衍生物溶液中，室温搅拌反应6-8h，称为A液；取8mg KLH，用0.01M硼酸盐缓冲溶液BB，pH=8.6稀释至4mg/mL，称为B液；再逐滴将A液缓慢加入到B液中，室温反应过夜；然后用0.01M PBS溶液透析，除去未反应的小分子半抗原，得到完全抗原异丙威-KLH，并通过紫外吸收扫描方法进行鉴定。
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