CN104004717A

CN104004717A - 一株抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

Info

Publication number: CN104004717A
Application number: CN201410214953.8A
Authority: CN
Inventors: 匡华; 胥传来; 张勋; 徐丽广; 马伟; 刘丽强; 宋珊珊; 吴晓玲
Original assignee: Jie Shengjiekang Bio Tech Ltd Wuxi; Jiangnan University
Current assignee: Di Tengmin bio tech ltd, Wuxi; Jiangnan University
Priority date: 2014-05-21
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2014-08-27
Anticipated expiration: 2034-05-21
Also published as: CN104004717B

Abstract

一株抗黄曲霉毒素通用单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明所述细胞株1G6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7210。黄曲霉毒素完全抗原与等量QuickAntibody免疫佐剂^TM混合均匀后，通过腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用B1-KLH，第二次免疫用M1-KLH，最后一次用M1完全抗原（不含佐剂）冲击免疫。将免疫小鼠的脾细胞通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选和三次亚克隆，得到该株杂交瘤细胞株1G6。此细胞株分泌的单克隆抗体，对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1具有较好的亲和力和检测灵敏度，可用于食品安全中黄曲霉毒素总量免疫检测。

Description

一株抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明一株抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，涉及杂交瘤细胞株1G6及其产生的抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

黄曲霉毒素(Anatoxins，AFT)由常见的黄曲霉（Aspergillus flarus）和寄生曲霉（A.parasiticus）侵染农产品、食品、饲料等产生的一类结构相似的有毒的次生代谢产物。目前已经分离出来的黄曲霉毒素有B1、B2、G1、G2、M1、M2、B2a、G2a等多种，其中以B1、B2、G1、G2和M1危害最大。

黄曲霉毒素对人及动物肝脏组织有很强的破坏作用，可导致肝癌，还具有致畸、致基因突变等危害，对人类和动物健康有极大的危害，世界卫生组织已经将其列为A类致癌物，因此世界各国均对食品和饲料中的黄曲霉毒素有很严格的限量。

目前检测AFT的方法主要有仪器方法和免疫检测方法。仪器检测方法虽然检测准确，但仪器昂贵，操作复杂，样品前处理繁琐。免疫分析方法相对于仪器检测方法，具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。在目前黄曲霉毒素通用型免疫检测方法中，其中的关键原料单克隆抗体对常见的5种黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2和M1）的灵敏与交叉相差很大，难以得到准确客观的结果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对常见的5种黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2和M1）均具有较好亲和力和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌产生的单克隆抗体，及该单抗在食品安全快速检测中的应用。

本发明所提供一种抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1具有较好的亲和力和检测灵敏度，可以用来建立黄曲霉毒素总量的免疫学检测方法，或黄曲霉毒素通用免疫亲和柱的制备。

本发明的技术方案：一株抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体杂交瘤细胞株1G6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 7210。

抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体，它由所述的杂交瘤细胞株1G6所分泌产生。

所述的抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体在黄曲霉毒素分析检测中的应用，对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1具有较好的亲和力和检测灵敏度，用于食品安全中黄曲霉毒素总量免疫检测。

本发明提供的1G6细胞株的制备步骤为：

（1）免疫原的制备与鉴定：黄曲霉素素（B1与M1）与羧甲基羟胺肟化反应后，通过活化酯法与蛋白载体相连，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（2）小鼠的免疫：将抗原与QuickAntibody免疫佐剂^TM混合均匀后，通过腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠。免疫过程总共三次：第一次用B1完全抗原免疫，第二次用M1完全抗原免疫，最后一次用M1完全抗原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；

（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT选择性培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株1G6；

（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：抗体亚型的鉴定采用小鼠单克隆抗体免疫胶体金亚型试剂盒方法，IC₅₀值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。

本发明的有益效果：（1）本发明获得的抗黄曲霉单克隆抗体细胞株，不仅对黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2有较好的检测灵敏度和亲和力，对M1同样有较好的灵敏度（IC₅₀值分别为为0.037，0.050，0.065，0.081，0.053μg/L；亲和力亲和常数分别为为8.04×10⁹ L/mol、4.34×10⁹ L/mol、3.78×10⁹ L/mol、2.68×10⁹ L/mol、3.94×10⁹ L/mol）；（2）一种新的制备通用型抗体的思路，在于用两种或更多结构相似的半抗原的完全抗原，连续间隔免疫，使动物体产生的抗体在亲和力成熟过程中，能够进化出和多种结构类似物的共有结构特异性结合，得到很好的通用型单克隆抗体细胞株。

生物材料样品保藏：一株抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体细胞株10号（1G6），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，登记编号为CGMCC No. 7210，分类命名为单克隆细胞株，保藏曰期为2013年1月23日。

附图说明

图1. 1G6单克隆抗体的亚型鉴定

图2. 1G6单克隆抗体对AFB1、B2、G1、G2和M1的标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将B1和M1完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对B1、B2、G1、G2和M1均有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。

实施例 1：杂交瘤细胞株1G6的制备

1、完全抗原的合成

取1 mg AFB1(或AFM1)溶于2 mL 甲醇-水-吡啶（4:1:1，V/V/V）混合液中，加入4 mg 羧甲基羟胺盐酸盐，85℃回流3 h，室温放置反应16~24 h。旋转蒸发，除去有机溶剂，加入1mL DMF，使其溶解，再加入0.45 mg EDC和0.3 mg NHS，避光混匀，室温搅拌反应4 h；另取5 mg KLH溶解于1 mL、0.1 M、pH 8.0的PBS溶液中；将上述活化后的黄曲霉毒素溶液慢速逐滴加入KLH溶液中，室温搅拌反应过夜后，4℃透析三天，-20℃分装保存。

2、动物免疫

选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取黄曲霉素素完全抗原（1 mg/mL）与等量QuickAntibody免疫佐剂^TM混合均匀后，通过腿部肌肉注射免疫BALB/c小鼠，每只50 μL。第一次免疫用B1-KLH免疫；第二次免疫用M1-KLH免疫，免疫间隔为21天；二免后10天采血，使用间接ELISA和间接竞争ELISA方法测定小鼠血清效价和抑制，选择抑制最好的小鼠，在二免后15天冲击免疫（第三次免疫），不使用佐剂，腹腔注射。

3、细胞融合

在冲击免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照1︰10 的比例混合，离心后用50% PEG融合，时间1 min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37 ℃，5%CO₂的培养箱中培养。

4、细胞筛选与细胞株建立

在细胞融合的第三天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第6天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第9天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用B1、B2、G1、G2和M1为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对5种标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株1G6。

5、单克隆抗体的制备与鉴定

取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞1G6，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化，获得的单抗置于 -20℃保存。

使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为 IgG1 型，轻链类型为κ型。

使用间接竞争ELISA和间接ELISA，测定单克隆抗体对B1、B2、G1、G2和M1的IC₅₀分别为：0.037，0.050，0.065，0.081，0.053μg/L（OTA、ZEN和FB的IC50均大于100μg/L），亲和常数分别为8.04×10⁹ L/mol、4.34×10⁹ L/mol、3.78×10⁹ L/mol、2.68×10⁹ L/mol、3.94×10⁹ L/mol，说明对5种黄曲霉毒素（B1、B2、G1、G2和M1）均有很好的灵敏度和亲和力，可用于黄曲霉毒素总量免疫分析检测和亲和柱的制备。

6、抗体应用

将杂交瘤细胞株1G6通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于黄曲霉毒素的ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

（1）用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的1.5μg/mL AFB1-BSA作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃ 包被2 h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3 min，拍干。

（2）用含0.01%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃ 封闭2 h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔250μL，每次3 min，拍干。

（3）用含30%甲醇的磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1μg/L的黄曲霉毒素B1标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 1︰16000稀释的抗黄曲霉毒素单克隆抗体，37℃ 反应半小时后，洗板拍干。

（4）每孔加入100 μL 用含0.01% 明胶的PBS 1︰3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃ 反应半小时后，洗板拍干。

（5）每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15 min后，每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止液，450 nm测吸光值。

（6）添加回收及样品前处理：称取5 g粉碎的花生样品置入100mL三角瓶中，分别添加1 ng、5 ng及10 ng AFB1。向样品中加入25 mL 80%甲醇PBS溶液（w/v）震荡均匀后，超声提取15 min，净置后上清用0.45μm滤膜过滤，滤液用含0.01% 明胶的PBS稀释4倍后，作为ELISA样品提取液，采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为72%，85%，93%。

表1. 1G6单克隆抗体对AFB1、B2、G1、G2和M1的IC₅₀和交叉反应率

	IC₅₀	交叉反应率
			AFB1	0.037	100.00%
AFB2	0.05	71.03%
			AFG1	0.065	56.92%
AFG2	0.081	45.68%
			AFM1	0.053	69.81%

溶液的配置：

碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000mL，4℃贮存备用；

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00 g NaCl，0.2 g KCl，0.2 g KH₂PO₄，2.9 g Na₂HPO₄·12 H₂O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2-7.4，定容至1000 mL；

PBST：含0.05% 吐温 20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O 18.43g，柠檬酸 9.33g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB 溶于100 mL乙二醇中。A、B液按1︰5混合即为TMB显色液，现用现混。

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。

Claims

1.一株抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体杂交瘤细胞株1G6，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 7210。

2.权利要求1所述的杂交瘤细胞株1G6分泌的抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体，其特征在于：它由所述的杂交瘤细胞株1G6所分泌产生。

3.权利要求2所述的抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体的应用，其特征在于在黄曲霉毒素分析检测中的应用，对黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1具有较好的亲和力和检测灵敏度，用于食品安全中黄曲霉毒素总量免疫检测。