CN105586317A - 一种黄曲霉毒素b1的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种黄曲霉毒素b1的单克隆抗体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105586317A
CN105586317A CN201610034681.2A CN201610034681A CN105586317A CN 105586317 A CN105586317 A CN 105586317A CN 201610034681 A CN201610034681 A CN 201610034681A CN 105586317 A CN105586317 A CN 105586317A
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
preparation
hole
cell
add
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610034681.2A
Other languages
English (en)
Inventor
谯仕彦
宋青龙
牛兰兰
付巍
张海燕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201610034681.2A priority Critical patent/CN105586317A/zh
Publication of CN105586317A publication Critical patent/CN105586317A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/14—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from fungi, algea or lichens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及杂交瘤细胞株及其产生的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体。本发明提供的杂交瘤细胞株保藏号为CGMCC？11199可以用于制备高效价抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达1:50000；本发明提供的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体灵敏度高、特异性好，可应用于测定黄曲霉毒素B1含量。

Description

一种黄曲霉毒素B1的单克隆抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种黄曲霉毒素B1的单克隆抗体及其应用。
背景技术
黄曲霉毒素B1主要存在于霉变的花生、谷物、果仁和大米中。因其对人、畜肝脏的剧烈损害而名列毒性之首。它们常存在于各种动物饲料和人类食品中。用污染的饲料饲养畜禽,会导致肉、乳及其制品的污染，所以必须注意检查特别容易受黄曲霉毒素污染的食品原材料，以及用这些原材料加工的食品中的黄曲霉毒素，这些食品有花生、核桃、开心果、杏仁、桃仁和李仁、椰丝、芝麻和各种粮食。人类食用被污染的食品会导致急性中毒,引起肝脏坏死出血,慢性中毒可引起肝癌。同时用被污染的饲料饲养畜禽会使畜禽生产率降低,增重减慢，造成重大经济损失。迄今为止，急性AFT中毒病例在世界上许多国家,尤其在发展中国家报道较多。因此各国对食品及饲料AFTB1的限量进行了规定,欧盟等国在2002年对粮食、花生及其产品中的AFTB1的限量进行了修订，再次提高上述农产品中的AFTB1的限量标准，如供人类直接食用的花生AFTB1限量为≤2μg/kg,作为食品原料进口的花生AFTB1限量为≤8μg/kg。我国也先后于1982、1992和1998年制定并实施了食品和饲料中AFTB1允许含量的强制性国家标准,但限量要求仍低于国外。
我国在食品中真菌毒素限量GB2761-2005版和2011版中，分别规定了花生、玉米、大米、植物油、豆类、发酵食品以及乳制品中黄曲霉毒素B1、M1的限量值，在2011年的新版本中并没有改变黄曲霉毒素B1在上述食品中的最高限量值。欧盟在2010年的2月27日颁布了(EU)No165/2010号法规中，规定了谷物，油籽，调味料和坚果中的黄曲霉毒素含量的最高限量。该规则修订(EC)No1881/2006条例中关于食品中黄曲霉毒素的最大限量值。该条例已于2010年3月6日起正式生效。
近年来，关于AFTB1的检测方法研究较多,大致可分为薄层层析法(TLC)、液相色谱法(HPLC)和酶联免疫法(ELISA)。薄层层析法虽为GB5009.22-2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定方法》中的第一检测法，但是该方法不专一，容易使样品中的其他荧光物质对其测定造成干扰。液相色谱法专一性较强，但实验过程繁琐，容易造成被测物质的损失，且所需仪器设备昂贵，降低了其推广性。酶联免疫法是当今测定黄曲霉毒素B1较常用的方法之一，该方法推出前国标一直使用的TLC法测定AFB1。用TLC法测定AFB1，步骤多，耗时长，所用试剂繁多，且只能实现半定量。在实验的操作过程中，实验员必须和毒素长时间直接接触，不适合大批量样品的检测，也无法实现快速。而ELISA法灵敏度高，分析速度快，简化了提取和纯化的步骤，整个实验仅需要2h，且可以一次测定多个样品，正是ELISA独特的优点，使得其在1998年就被写进当时的国家标准，作为第二法来辅助第一法(高效液相色谱法)，在使用色谱法之前先利用该法对样品进行初筛，有针对性的对样品进行定量检测。
在实际的检测活动中ELISA酶联免疫法的使用较为普遍，因为ELISA法不需要专用的大型设备、对操作人员要求也不高、成本也相对较低，所以ELISA法已经被很多企业和检验检测机构所采用，作为阳性样品的初筛工具。但由于同类分子的相似性，AFB1的ELISA等免疫检测方法容易对结构相似的其他黄曲霉毒素或化学物质产生一定的交叉反应性，影响实验的准确度。
发明内容
为获得一种灵敏度较高，特异性较强的，可适用于检测AFTB1的抗体及其应用，本发明人对此经过大量的深入研究，在付出了充分的创造性劳动后，从而完成了本发明。
一种可分泌AFTB1单克隆抗体的杂交瘤细胞4D5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC11199，保藏日期为2015年9月23日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
上述杂交瘤细胞4D5在制备AFTB1检测试剂或者检测设备中的应用。
一种由所述杂交瘤细胞4D5分泌的抗AFTB1单克隆抗体。
所述抗AFTB1单克隆抗体在制备AFTB1检测试剂或检测设备中的应用。
本发明提供的杂交瘤细胞株制备过程，步骤为：将黄曲霉毒素B1溶于0.5ml生理盐水中，加入等体积佐剂制成乳化剂，免疫雌性BALB/c小鼠3次，第一次免疫剂量为第二三次的2倍，最后一次加强免疫用与第三次一样免疫剂量无佐剂的AFTB1，免疫49天后进行细胞融合。用间接ELISA法检测细胞培养上清液，选出阳性产抗黄曲霉毒素B1抗体的单克隆孔，挑出阳性高，阻断情况好的单克隆孔继续做亚克隆，直至最后一次克隆有细胞的孔都为阳性产目的抗体。采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆。用间接ELISA法检测细胞培养上清液，选出阳性产抗黄曲霉毒素B1抗体的单克隆孔，挑出阳性高，阻断情况好的单克隆孔继续做亚克隆，直至最后一次克隆有细胞的孔都为阳性产目的抗体。
本发明提供的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体的制备方法，步骤如下：采用小鼠体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体。取健康BALB/c雌性小鼠，注入液体石蜡0.5ml，1～2周后备用。将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞用基础培养液制备成细胞悬液，细胞计数后，将细胞数调至106个/ml，注射小鼠腹腔lmL/只。7～10天后收集腹水，一只小鼠可获5～10mL腹水，3000rpm离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，分装，-70℃冻存。
按上述方案，所述单克隆抗体的纯化步骤为：
①腹水的预处理采用二氧化硅吸附法：取一定量的腹水，加等量巴比妥缓冲盐水(VBS)稀释。加适量二氧化硅粉末，室温30min，不时摇动。2000g离心20min，即得澄清的腹水。
②辛酸－硫酸铵沉淀法纯化IgG：向一份预处理过的腹水中加入两份0.06M、pH5.0的乙酸缓冲液，用0.1NHCl调pH至4.8。于室温搅拌下在30min内逐滴缓慢加入辛酸，每ml稀释前的腹水加33μl，4℃静置2h，15000g离心30min，弃沉淀。上清经砂心漏斗过滤，加入1/10体积的0.1MPBS；用1NNaOH调pH至7.4。于4℃冰浴下于30min内加入0.277g/ml的(NH4)2SO4，使其达到45％的饱和度；静置1h以上。4℃下10000g离心30min，弃上清。沉淀溶于适量pH7.4，含137mMNaCl，2.6mMKCl，0.2mMEDTA的PBS中，对50～100倍的PBS于4℃透析过夜。4℃下10000g离心30min，除去不溶性沉渣。
③亲和层析纯化IgG：
(1)柱子用结合buffer平衡10个柱体积(约10ml)；
(2)样品用0.45μm的滤器过滤去除不溶物，与结合buffer按1:1(V:V)混合。用注射器进样，然后依次用10个柱体积(约10ml)洗脱BufferB1和BufferB2洗脱，并分别加入0.5ml和1.3ml中和BufferC；
(3)收集BufferB1洗脱液和BufferB2洗脱液，对5mMPBS透析，浓缩备用。
即得纯化好的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的杂交瘤细胞株可以用于制备高效价抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，抗黄曲霉毒素B1小鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达1:100000，培养液效价1:20000～1:100000之间。
本发明提供的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体灵敏度高、特异性好，对黄曲霉毒素B1的亲合常数在108～1011M-1之间。
本发明提供的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体可应用于测定黄曲霉毒素B1含量。
附图说明
图1校准曲线图
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1、杂交瘤细胞株的筛选
1、动物饲养及处理
健康雌性BALB/c小鼠先饲养观察1周，无异样，断尾取血，以间接竞争ELISA分析血清，阴性者用于制备抗体，阴性血清-20℃保存备用。
1.1动物免疫
将黄曲霉毒素B1溶于0.5ml生理盐水中，加入等体积佐剂制成乳化剂，免疫雌性BALB/c小鼠。第三次免疫后7～10d测定血清效价。免疫程序见表1。
表1动物免疫程序
1.2血清效价的测定
免疫后的BALB/c小鼠尾部采血0.1ml，3000rpm离心5min，收集血清，4℃保存。用ELISA法测定血清效价。
(1)包被抗原：用包被缓冲液将包被抗原稀释至适当的工作浓度(2μg/ml)；加入到酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；然后弃去孔内的液体。
(2)封板：每孔加封板液200μl，37℃湿盒孵育1h，然后用洗涤缓冲液洗3次，每次90s(简称洗涤，下同)，拍干。
(3)加待测血清样品：将血清样品倍比稀释后加入酶标板中，每孔100μl；同时设空白对照、阴性对照和阳性对照各2孔。37℃孵育0.5h，洗涤、拍干。
(4)加酶标第二抗体：先用稀释液将酶标第二抗体稀释到适当的工作浓度，每孔加入100μl，置37℃孵育0.5h；然后洗涤、拍干。
(5)加底物溶液：各孔加新鲜配置的底物A、底物液B各100μl，37℃孵育15min。
(6)终止反应：每孔加终止液50μl。
(7)判定结果：测定OD450nm，以空白孔调零，若待测孔OD值大于或等于阴性对照孔的2.1倍，即为阳性，这样可以得出血清的效价(结果见表2)。
经第3次免疫后，测定小鼠血清中抗体的效价，效价最高达到1：4.2×105(表2)。
表2免疫动物的血清效价
2、细胞融合
(1)免疫细胞悬液的制备：
取免疫效价高的BALB/c小鼠，融合前3天超免。处死小鼠，在75％酒精中浸泡消毒5min。取出小鼠，移入超净工作台，小鼠腹部朝上固定在解剖版上，剪开腹部皮肤和腹膜，找到脾脏。注意无菌操作。取出脾脏后，将脾脏上的结缔组织去除干净，置于包有120目尼龙纱布的小烧杯，用少量DMEM培养液湿润纱布和脾脏。剪碎脾脏，用摄子轻轻研磨，用少量DMEM培养液冲洗，脾细胞被过滤到烧杯中。离心收集脾细胞。
(2)饲养细胞的制备：
取小鼠，放血致死，收集血液，制备血清留作阴性血清备用。于75％的酒精中浸泡消毒5min。在超净台中小鼠腹部朝上，固定在解剖板上，无菌操作剪开腹部皮肤，,露出腹膜。用酒精棉球对腹膜进行消毒。小心提起腹膜，腹腔注射5mL4℃预冷的不完全DMEM培养基，反复柔打腹部数次，再吸回注射器中，注入离心管。1000rpm离心10min，弃上清。先用5mlHAT培养液将沉淀细胞悬浮并混匀，作细胞计数，然后根据细胞计数结果，补加HAT培养基至40mL，充分混匀。按照将饲养细胞悬液加入4块96孔培养板，每孔0.1ml。置于37℃、5％C02培养箱中培养。
(3)骨髓瘤细胞悬液的制备：
融合前一周复苏SP2/0骨髓瘤细胞于完全DMEM培养液中。用20μg/ml的8-氮杂鸟嘌呤来处理骨髓瘤细胞，使其对HAT呈均一的敏感性。选择呈对数生长的细胞，于融合前48～36h，将骨髓瘤细胞扩大培养于100ml细胞培养瓶中，每瓶加10ml培养液，置37℃、5％CO2温箱内培养。融合当天，用弯头滴管将细胞从瓶壁轻轻吹下，收集于50ml离心管内。1000rpm离心5min，弃去上清。沉淀中加入30ml不完全培养液，同上离心洗涤一次。然后将细胞重悬至10mlDMEM培养液中，混匀。取瘤细胞悬液，加台酚兰染液进行活细胞计数后备用。
(4)细胞融合：
分别吸取含1×108个脾细胞和2～3×107个骨髓瘤细胞的悬液量，加入到一只50ml离心管中，补加不完全培养液至30ml，充分混匀。用1000rpm离心7min，将上清尽量弃去。轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状。一手均匀转动离心管，另一手用1ml吸管吸取50％的PEG溶液1ml，并沿转动的管壁(尽量接近细胞处)加入，从加入到加完的时间控制在60s左右，然后立即将细胞悬液全部吸入吸管(时间控制在30s左右)，静置30s，再将其吹入离心管内(时间也控制30s左右)。立即在5min内加入25ml不完全培养液，使PEG稀释而失去促融作用。具体加法是第1min加1ml，第2min加4ml(均应边加边轻轻转动离心管)，随后的3min内将剩余液体加完。所有操作过程保持在37℃。用800rpm离心7min，弃去上清。加入10mlHAT培养液，轻轻吹吸沉淀的细胞，使其悬浮并混匀。将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml(相当于2滴)。然后将培养板置37℃，含5％CO2的培养箱内培养。
(5)选择性培养融合后4～5d显微镜下观察杂交瘤细胞的生长情况，并作记录，如发现污染，对有污染的孔采用高浓度抗生素清洗处理，融合后5～6d，取单克隆孔的培养上清液，ELISA法检测其效价及阻断情况，融合后7～10d，细胞集落约显微镜下1/3～1/2视野大小，更换为HT培养液，换液时，用消毒的8孔移液器和灭菌枪头每孔吸去0.1ml细胞上清液，每个枪头只用于一个孔，随后用滴管吸取HAT培养液，每孔滴加两滴约0.1ml，封盖，37℃，含5％CO2的培养箱内培养。
(6)杂交瘤细胞株的筛选及扩大培养
用间接ELISA法检测细胞培养上清液，选出阳性产抗黄曲霉毒素B1抗体的单克隆孔，挑出阳性高，阻断情况好的单克隆孔继续做亚克隆，直至最后一次克隆有细胞的孔都为阳性产目的抗体。本实验采用有限稀释法对杂交瘤细胞进行克隆。
有限稀释法可以弥补因细胞计数不准确带来的误差。按照前面的方法制备饲养细胞悬液，取阳性较高，抗体敏感性好的孔，用弯头吸管吹打均匀，以HT培养基分别倍比稀释至1个/孔或0.5个/孔，检测培养上清。挑选保持强阳性的孔继续进行亚克隆。为保证细胞生长，每一次亚克隆制备饲养细胞滴加96孔板中，为保证饲养细胞沉降完全，一般融合前一日制备。
实施例2、单克隆抗体的大量制备及纯化
1、单克隆抗体的大量制备
采用小鼠体内诱生腹水的方法制备单克隆抗体。取健康BALB/c雌性小鼠，注入液体石蜡0.5ml，1～2周后备用。将扩大培养的阳性克隆杂交瘤细胞用基础培养液制备成细胞悬液，细胞计数后，将细胞数调至106个/ml，注射小鼠腹腔lmL/只。7～10天后收集腹水，一只小鼠可获5～10mL腹水，3000rpm离心10min，弃脂肪层和细胞层，收集中间澄清层，分装，-70℃冻存。
2、单克隆抗体的纯化
腹水的预处理采用二氧化硅吸附法：取一定量的腹水，加等量巴比妥缓冲盐水(VBS)稀释。加适量二氧化硅粉末，室温30min，不时摇动。2000g离心20min，即得澄清的腹水。
辛酸－硫酸铵沉淀法纯化IgG：向一份预处理过的腹水中加入两份0.06M、pH5.0的乙酸缓冲液，用0.1NHCl调pH至4.8。于室温搅拌下在30min内逐滴缓慢加入辛酸，每ml稀释前的腹水加33μl，4℃静置2h，15000g离心30min，弃沉淀。上清经砂心漏斗过滤，加入1/10体积的0.1MPBS；用1NNaOH调pH至7.4。于4℃冰浴下于30min内加入0.277g/ml的(NH4)2SO4，使其达到45％的饱和度；静置1h以上。4℃下10000g离心30min，弃上清。沉淀溶于适量pH7.4，含137mMNaCl，2.6mMKCl，0.2mMEDTA的PBS中，对50～100倍的PBS于4℃透析过夜。4℃下10000g离心30min，除去不溶性沉渣。
亲和层析纯化IgG：
(1)柱子用结合buffer平衡10个柱体积(约10ml)；
(2)样品用0.45μm的滤器过滤去除不溶物，与结合buffer按1:1(V:V)混合。用注射器进样，然后依次用10个柱体积(约10ml)洗脱BufferB1和BufferB2洗脱，并分别加入0.5ml和1.3ml中和BufferC；
(3)收集BufferB1洗脱液和BufferB2洗脱液，对5mMPBS透析，浓缩备用。
融合后第8天，采用ELISA法检测96孔细胞板中的融合细胞的培养液。黄曲霉毒素B1杂交瘤细胞株中发现10个强阳性孔，选择强阳性克隆株进一步克隆化，经3次克隆，筛选出6株强阳性单克隆细胞，分别为3F6、2C7、5G4、3F5、6C3、6A2。
实施例3、单克隆抗体的鉴定
1、抗体的类及亚型
取阳性杂交瘤细胞的培养液，2000rpm离心8min去除细胞及其碎片，按照使用说明书用ImmunoPureMonoclonalAntibodyIsotypingKitI测定Mabs的类和IgG亚类及轻链的亚型，方法仍为前述间接法ELISA。
采用免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒进行鉴定,具体操作步骤如下：
(1)用无菌PBS以1:1000倍稀释各种亚类鉴定试剂，IgM、IgA、IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3。
(2)加入稀释的亚类鉴定试剂，0.1ml/孔。每种亚类试剂加2平行对照。
(3)37℃反应Ih。PBST洗3次，每次3min。
(4)加入细胞上清液，0.1ml/孔。
(5)37℃反应Ih，PBST洗3次，每次3min。
(6)加入羊抗鼠酶标二抗，用PBST以1:600稀释，0.1ml/孔。
(7)37℃反应30min，PBST洗3次，每次3min。
(8)加入TMB底物显色溶液，0.1ml/孔，37℃反应lOmin，显色者为阳性。
2、抗体的效价
用黄曲霉毒素B1包被酶标板，将腹水进行倍比稀释，用ELISA方法测定抗体的效价。
3、抗体亲和力的测定—非竞争性ELISA测定Mabs的亲和常数
采用非竞争性ELISA法测定杂交瘤细胞培养液中单克隆抗体的亲和常数，操作程序如下：
(1)用三种浓度(0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml)交联抗原包被酶标板，0.1ml/孔，4℃过夜，用封板液封闭酶标板(同上)。
(2)洗涤后，加入系列稀释的已知浓度的被检的杂交瘤细胞培养液，0.1ml/孔，37℃孵育1h。
(3)洗涤后，加入适宜浓度的HRP标记的兔抗鼠IgG抗体，0.1ml/孔，37℃孵育1h。
(4)洗涤后，加入底物(OPD)溶液，0.1ml/孔，37℃闭光显色20min。
(5)用50μl2MH2SO4终止反应后，测定各孔的OD492nm值。
以被检样品的不同浓度为横坐标，以其相应的OD值为纵坐标，绘制3条测定曲线，以各曲线上部趋于平坦的OD值为100％，计算OD值为50％时的Mabs的浓度[Ab]t，这样每份被检样品可得[Ab]t﹑[Ab]′t﹑[Ab]″t三个值，然后根据公式计算其亲和常数。
对所筛选出的6株分泌黄曲霉毒素B1抗体单克隆细胞的培养液进行鉴定。4株抗体有IgG和IgM两种类型，其中IgG有三种亚类，分别为IgG1、IgG2a和IgG2b，所有抗体的轻链的亚型均为κ链；亲合常数在108～1011M-1之间。
实施例4、抗体的应用
将杂交瘤细胞株分泌的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体用于制备黄曲霉毒素B1检测试剂盒，制备方法包括以下步骤：
以下方法所使用抗体是黄曲霉毒素B1单抗。
(1)使用浓度为1:50000的单克隆抗体包被酶标板；
(2)黄曲霉毒素B1竞争性ELISA标准曲线的建立(结果见图1)；
(3)应用黄曲霉毒素B1直接竞争ELISA试剂盒测定样本中黄曲霉毒素B1的含量。
所述步骤(2)具体实验方案如下：
①、用包被缓冲液将包被抗体稀释至适当浓度，每孔100μl包被酶标板，4℃过夜或37℃孵育2h，然后弃去孔内的液体；
②、向已包被抗体的酶标板中每孔加入封闭液150μl，37℃孵育2h，然后洗涤、拍干；
③、依次加入系列稀释度的黄曲霉毒素B1标准品50μl和适当稀释的酶标抗原100μl，同时设置空白和阴性对照各2孔，25℃15min，洗涤、拍干；
④、于各反应孔中加入新鲜配置的底物A/B液100μl，室温反应5min；
⑤、每孔加2MH2SO450μl终止反应；
⑥、用酶标仪测定吸光度值，空白对照的读数为本底。以有黄曲霉毒素B1标准品浓度对数为横坐标，以OD值为纵坐标，制作标准曲线，计算待测样品中有黄曲霉毒素B1的含量。
所述步骤(3)具体操作步骤如下：
①试剂配制
1×样品提取工作液的配制：根据用量，将20×浓缩样品提取液与蒸馏水按1:19的比例稀释至工作浓度(1份20×浓缩样品提取液+19份蒸馏水)。
1×洗涤工作液的配制：根据用量，将10×浓缩洗液与蒸馏水按1:9的比例稀释至工作浓度(1份10×浓缩洗液+9份蒸馏水)。
②样品前处理
称取2g±0.02g样本于50mL离心管中，加入10mL70％甲醇；振荡提取3次(每次振荡30s，静置1min)，静置3min；取上层清液500μL，加入500μL样本稀释液，混匀；用2MNaOH调节pH至6.5-8.0；4000rpm离心5min，或用whatmanNO.1滤纸过滤；取上清200μL备用。
③样品检测
检测前保证试剂达到20～25℃。
④预混：取适量预混板条置于96孔板架中，未使用的板条放入自封袋中干燥保存，加校准品/待测样本60μL，并记录其位置。然后在每孔中加入酶标试剂120μL，使用多道移液器吸打混匀，或用酶标仪水平震荡混匀。
加样：取适量检测板条置于96孔板架中，未使用的板条放入自封袋中干燥保存。用多道移液器采取吸二打一的方式向检测板孔中加入100μL已预混好的液体。
⑤孵育：盖上盖板膜，25℃避光孵育15min。
⑥洗板：甩掉微孔中溶液，注满洗涤工作液，浸泡10s后倒掉，重复4次，于吸水纸上拍干。
⑦显色：根据用量，将底物液A与B液等体积轻轻混合后(现用现配)，使用多道移液器按100μL/孔加入显色。
⑧孵育：盖上盖板膜，25℃避光孵育5min。
⑨终止：使用多道移液器加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，立即于450/630nm双波长下读取吸光度值。
结果计算
百分吸光率的计算：
校准品或样品的百分吸光率等于标准品或样品的百分吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100％，即
百分吸光度值(％)＝B/B0×100％
B—校准品溶液或样品溶液的平均吸光度值
B0—校准品1的平均吸光度值
2.5.2校准曲线的绘制与计算
以校准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素B1校准品浓度的对数为横坐标，绘制校准曲线图(见图1)。将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中黄曲霉毒素B1的实际浓度。
所述试剂盒性能参数：
(1)样品线性回归与预期浓度相关系数R2≥0.99。
(2)批内变异系数≤10％，批间变异系数≤15％
(3)分析灵敏度：2ng/ml
(4)有效期：12个月。

Claims (9)

1.杂交瘤细胞株4D5,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC11199。
2.抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，由所述权利要求1所述保藏号为CGMCC11199的杂交瘤细胞株4D5分泌产生。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体对黄曲霉毒素B1的亲合常数为108～1011M-1。
4.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其制备方法为基于权利要求1所述杂交瘤细胞株4D5使用小鼠体内诱生腹水的方法制备，制备时，使用浓度为106个/ml的所述细胞株细胞注射小鼠腹腔，lmL/只。
5.根据权利要求2所述的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，在黄曲霉毒素B1检测中的应用。
6.根据权利要求2所述的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，在制备黄曲霉素B1检测试剂或检测设备中的应用。
7.根据权利要求2所述的抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体，在制备黄曲霉素B1定量检测试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的定量检测试剂盒，其特征在于：所述制剂盒包括使用浓度为1:50000所述单克隆抗体包被酶标板。
9.根据权利要求5所述的定量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒样品线性回归与预期浓度相关系数≥0.99，分析灵敏度为2ng/ml。
CN201610034681.2A 2016-01-19 2016-01-19 一种黄曲霉毒素b1的单克隆抗体及其应用 Pending CN105586317A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610034681.2A CN105586317A (zh) 2016-01-19 2016-01-19 一种黄曲霉毒素b1的单克隆抗体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610034681.2A CN105586317A (zh) 2016-01-19 2016-01-19 一种黄曲霉毒素b1的单克隆抗体及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105586317A true CN105586317A (zh) 2016-05-18

Family

ID=55926225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610034681.2A Pending CN105586317A (zh) 2016-01-19 2016-01-19 一种黄曲霉毒素b1的单克隆抗体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105586317A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106645688A (zh) * 2016-11-09 2017-05-10 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 一种快速检测黄曲霉毒素b1的方法及试剂盒
CN107083368A (zh) * 2017-04-10 2017-08-22 北京勤邦生物技术有限公司 一种分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102747043A (zh) * 2012-04-20 2012-10-24 中国农业科学院油料作物研究所 杂交瘤细胞株3g1及其产生的抗黄曲霉毒素b1单克隆抗体
CN104004717A (zh) * 2014-05-21 2014-08-27 无锡杰圣杰康生物科技有限公司 一株抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN104762267A (zh) * 2015-01-15 2015-07-08 北京科技大学 杂交瘤细胞afb1-2a4及其产生的黄曲霉毒素b1单克隆抗体

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102747043A (zh) * 2012-04-20 2012-10-24 中国农业科学院油料作物研究所 杂交瘤细胞株3g1及其产生的抗黄曲霉毒素b1单克隆抗体
CN104004717A (zh) * 2014-05-21 2014-08-27 无锡杰圣杰康生物科技有限公司 一株抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN104762267A (zh) * 2015-01-15 2015-07-08 北京科技大学 杂交瘤细胞afb1-2a4及其产生的黄曲霉毒素b1单克隆抗体

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106645688A (zh) * 2016-11-09 2017-05-10 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 一种快速检测黄曲霉毒素b1的方法及试剂盒
CN107083368A (zh) * 2017-04-10 2017-08-22 北京勤邦生物技术有限公司 一种分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN107083368B (zh) * 2017-04-10 2020-01-31 北京勤邦生物技术有限公司 一种分泌抗总黄曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101281195B (zh) 检测生物毒素的胶体金免疫层析试纸及其检测方法
CN103146652B (zh) 抗喹乙醇单克隆抗体及其杂交瘤细胞株、其制备方法及用于检测饲料中喹乙醇的试剂盒
CN106093381B (zh) 链格孢毒素链格孢酚单甲醚胶体金免疫层析试纸条
CN102675463B (zh) 一种多菌灵单克隆抗体及其制备方法与应用
CN101565690B (zh) 恩诺沙星单克隆抗体及应用
CN102080066B (zh) 一种检测t-2毒素的方法及其专用试剂盒
CN105044365B (zh) 检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法
CN101863981A (zh) 一种抗双酚a单克隆抗体的制备方法
CN102590527B (zh) 检测杀虫晶体蛋白Bt Cry1Ab/Ac的方法及其专用酶联免疫试剂盒
CN104004717A (zh) 一株抗黄曲霉毒素通用型单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN107915774B (zh) 用于检测玉米赤霉烯酮及其代谢产物的单抗及酶联免疫方法与试剂盒
CN103215230A (zh) 杂交瘤细胞株afm1b7、其单克隆抗体及黄曲霉毒素m1流动滞后免疫时间分辨荧光速测试剂盒
CN102080067B (zh) 一种检测呕吐毒素的方法及其专用试剂盒
CN103333864B (zh) 抗弓形虫mic3蛋白单克隆抗体及其应用
CN105277708A (zh) 检测辣椒中黄曲霉毒素b1的酶联免疫试剂盒
CN100489530C (zh) 一种检测磺胺喹噁啉的方法及其专用酶联免疫试剂盒
CN101445558B (zh) 大豆球蛋白的单克隆抗体及其应用
CN105467115A (zh) 牛奶中检测黄曲霉毒素m1的免疫层析胶体金试纸条
CN101781365A (zh) 一种河豚毒素的人工抗原、相应的特异性抗体及其制备方法与应用
CN105131121A (zh) 检测呋喃唑酮代谢物的单抗、elisa方法及试剂盒
CN105586317A (zh) 一种黄曲霉毒素b1的单克隆抗体及其应用
CN102911919A (zh) 一种bar/PAT蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用
CN103509757B (zh) 杂交瘤细胞株15号及其产生的抗拟除虫菊酯的群选性单克隆抗体
CN105586316A (zh) 一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN104388392A (zh) 一种恩诺沙星单克隆抗体及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20160518