CN105586316A - 一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105586316A
CN105586316A CN201510990139.XA CN201510990139A CN105586316A CN 105586316 A CN105586316 A CN 105586316A CN 201510990139 A CN201510990139 A CN 201510990139A CN 105586316 A CN105586316 A CN 105586316A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell strain
hybridoma cell
qns
monoclonal antibody
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201510990139.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN105586316B (zh
Inventor
柳爱春
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Original Assignee
Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hangzhou Institute of Agricultural Sciences filed Critical Hangzhou Institute of Agricultural Sciences
Priority to CN201510990139.XA priority Critical patent/CN105586316B/zh
Publication of CN105586316A publication Critical patent/CN105586316A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105586316B publication Critical patent/CN105586316B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0648—Splenocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株命名为杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12，已于2015年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC？NO.C2015118；地址为中国武汉武汉大学。本发明以环丙沙星与牛血清白蛋白形成的偶联物为抗原，免疫BALB/c小鼠，再将免疫后的小鼠的脾脏细胞与复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得杂交瘤细胞株；该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体灵敏度高，特异性强，可用于喹诺酮类药物的快速、准确免疫检测和免疫分析。

Description

一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
喹诺酮类(QuinoIones，QNs)是一类化学合成的抗菌药，由于这类药物高效低毒、价格低廉，所以多年来被广泛应用于畜禽、水产养殖领域，用于预防和治疗疾病。过量或不当使用喹诺酮类药物会造成其在动物农产品中残留和蓄积。喹诺酮类药物品种繁多，其在动物体内还会转化生成多种其它喹诺酮类药物，而且即使用的是兽用药，在体内也会转化成临床药物品种。
人体摄入被QNs污染的农产品后，除了可能会引起关节病变、消化道反应、肝肾毒性、血液系统毒性等不良反应，长期食用含低剂量的抗菌素，机体还会产生耐药性，甚至产生超级细菌，从而不利于该类药物对人类疾病的治疗。
目前，对于喹诺酮类药物残留的检测方法主要有高效液相色谱法、液相-串联质谱法，这些方法具有定量精度高的特点，但仪器成本高、操作复杂、检测时间长、不能用于现场检测，因而不适用于基层单位的应用，无法满足农产品市场准入制度实施对检测方法时效性的需求。利用抗体与抗原的反应为核心发展起来的免疫学检测方法主要有：酶联吸附免疫法(ELISA)和免疫胶体金法(GICT)分别具有高通量检测和操作简便、快速等优点，因而尤其适合在基层单位的应用和现场快速检测。
开发药物残留检测免疫试剂盒所面临的主要难题除了检测结果假阳性、假阴性率偏高，还有其核心原料(抗体)批量小、批间差异大且价格昂贵。出现假阳性和假阴性分别是由于方法的特异性和灵敏度不够，而免疫学检测方法的特异性和灵敏度又主要由抗体所决定。常用的单克隆抗体生产方法是将杂交瘤细胞输入动物体内，当动物腹部膨大产生腹水时，再抽取腹水获得抗体，但此方法不足之处为小鼠腹水量少而且动物个体差异使每只动物所产抗体的质量和产量均有较大差异，从而造成抗体批量小且批间差异大；而有些国家和地区禁止在动物体内制备抗体。
申请公布号为CN102618502A的发明专利申请文献公开了一种分泌抗喹诺酮类药物单抗的杂交瘤细胞株及其单抗应用，该细胞株的保藏编号为CGMCCNO5608，能够分泌亚型为IgG1κ链的单克隆抗体，经间接竞争ELISA分析表明该单抗与环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、达氟沙星等喹诺酮类药物有特异反应，IC50为3.65ng/mL；可用于检测食品中喹诺酮类药物的残留。
申请公布号为CN101792738A的发明专利申请文献公开了一种环丙沙星单克隆抗体细胞株及其单克隆抗体，该细胞株由骨髓瘤细胞与产生抗环丙沙星抗体的脾细胞融合制备而成，保藏编号为CCTCCNO.C200947，能够与环丙沙星、恩诺沙星攒在90％的交叉反应，而氧氟沙星、双氟沙星、沙拉沙星、氯霉素、孔雀石绿均无交叉反应，IC50为3.45ng/mL，实现在水产品中快速检测残留的环丙沙星。
发明内容
本发明提供了一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞株能够在体外培养条件下大量分泌高灵敏度、高特异性的抗喹诺酮类药物的单克隆抗体。
一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12，已于2015年8月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(ChinaCenterforTypeCultureCollection，简称CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO.C2015118；中国典型培养物保藏中心的地址为：中国.武汉.武汉大学。
本发明提供了所述杂交瘤细胞株在制备喹诺酮类药物检测试剂盒中的应用。
本发明提供了所述杂交瘤细胞株在制备用于检测喹诺酮类药物的试纸条中的应用。
本发明提供了一种所述杂交瘤细胞株的制备方法，包括：
(1)将牛血清白蛋白和环丙沙星混合制备偶联物，再用所述偶联物免疫动物，获得能够产生抗喹诺酮类药物抗体的脾细胞；
(2)将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆后，获得所述杂交瘤细胞株；
其特征在于，所述牛血清白蛋白与环丙沙星的投料比为1:10～30；所述偶联物的偶联比为2～6:1。
作为优选，所述的筛选和克隆在无抗菌素的条件下进行。
具体地，所述的动物为BALB/c小鼠。
本发明还提供了一种单克隆抗体，该单克隆抗体由所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
具体地，所述单克隆抗体的亚型为IgG1λ链，与喹诺酮类药物有特异性反应。
作为优选，所述单克隆抗体通过体外培养的方式获得。
本发明还提供了所述的单克隆抗体在检测喹诺酮类药物中的应用。
本发明还提供了所述的单克隆抗体在检测动物源食用农产品残留喹诺酮类药物中的应用。
作为优选，所述的喹诺酮类药物为环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、麻保沙星、培氟沙星、洛美沙星、双氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、加替沙星、噁喹酸、氟罗沙星和司帕沙星中的至少一种。
本发明还提供了一种喹诺酮类药物的检测试剂盒，含有所述的单克隆抗体。
具体地，所述的试剂盒中含有所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体、酶标板、喹诺酮类药物标准品，酶标记物(酶标二抗)、底物和终止液，其中，酶标板上包被有人工合成的抗原(竞争物)。使用时，待待检样品与抗体加入酶标板完成反应后，再加入酶标记物，若样品中含有喹诺酮类药物，则会与酶标板上的抗原竞争结合抗体，再加入底物反应，终止显色。显色强度与样品中残留的喹诺酮类药物量成反比。根据喹诺酮类药物标准品做出的标准曲线，计算出样品中的喹诺酮类药物的含量。
本发明还提供了一种用于检测喹诺酮类药物的试纸条，包括：样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，所述标记物垫包被有胶体金标记、荧光标记或量子点标记的由所述杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生的单克隆抗体。
本发明的试纸条中，所述反应膜的检测线(T线)处包被有环丙沙星-卵清蛋白偶联物(CIP-OVA)，所述反应膜的质控线(C线)处包被有二抗。所述二抗选用羊抗鼠IgG。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
本发明以环丙沙星与牛血清白蛋白形成的偶联物为抗原，免疫BALB/c小鼠，再将免疫后的小鼠的脾脏细胞与复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，并采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经多次筛选和克隆获得杂交瘤细胞株；该杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体灵敏度高，特异性强，可用于喹诺酮类药物的快速、准确免疫检测和免疫分析。
附图说明
图1为免疫抗原环丙沙星-牛血清白蛋白偶联物(CIP-BSA)的质谱图；
图2为单抗对环丙沙星(CIP)间接竞争ELISA的标准曲线；
图3为杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12的染色体标本；
图4为重组纯化蛋白(ProteinG)纯化抗体电泳图；
图5为免疫胶体金法检测猪肉添标样本中的喹诺酮类药物的结果。
具体实施方式
实施例1
杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12于2015年8月26日送达中国典型培养物保藏中心(地址：中国.武汉.武汉大学)，该细胞株的存活性于2015年9月10日检测结果为存活，保藏编号CCTCCNo:C2015118。
该杂交瘤细胞株通过环丙沙星(CIP)与牛血清白蛋白(BSA)的偶联物(CIP-BSA)为抗原免疫BALB/c小鼠，将免疫后小鼠的脾脏细胞与经复壮的SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，采用不添加抗菌素的培养基进行细胞培养，经过筛选和4次克隆获得。具体过程如下：
1.免疫抗原(CIP-BSA)的合成
(1)称取牛血清白蛋白(BSA)125mg，碳二亚胺(EDC)90mg，加4.5mL水溶解，制成A液。
(2)称取盐酸环丙沙星(Ciprofloxacinhydrochloride，简称CIP，CAS号:86483-48-9分子式:C17H19ClFN3O3分子量:367.8)15mg，加水1.5mL溶解后制成B液，将B液加入A液。
(3)将上述混合后的溶液置于摇床上，4℃避光震荡18h以上，上下颠倒5次。
(4)收集反应液，先用0.1mol/LNaOH溶液透析5h，再用PBS(7.4)透析3天，换水6次，得CIP-BSA溶液。
(5)用考马斯亮蓝染色法检测抗原蛋白浓度：CIP-BSA溶液稀释40倍，测得值0.2420mg/mL，原溶液浓度为9.68mg/mL。
(6)用高分辨率离子肼质谱检测CIP-BSA分子量为67995.2734道尔顿(见图1)，以相同方法测得BSA分子量为66366.2578道尔顿，计算偶联比为：
2.包被抗原(CIP-OVA)的合成
(1)称取卵清蛋白(OVA)125mg，EDC90mg，加4.5mL水溶解，制成B液。
(2)称取CIP15mg，加水1.5mL溶解后，加入B液。
(3)将上述混合后的溶液置于摇床上，4℃避光震荡18h以上，上下颠倒2次以上。
(4)收集反应液，先用0.1mol/LNaOH透析5h，再用0.02mol/LPBS(PH7.4)透析3天，换水6次，得CIP-OVA溶液。
(5)用考马斯亮蓝染色法检测抗原蛋白浓度：CIP-OVA溶液稀释40倍，测得值为0.3589mg/mL，原溶液浓度为14.536mg/mL。
3.免疫动物
首次免疫剂量约为100μg/只，例如取9.68mg/mLCIP-BSA溶液30μL+120μLPBS+150μL弗氏完全佐剂，充分乳化后，每批免疫3只6周龄的Balb/c小鼠，分4～5点皮下注射；第2次～第5次免疫抗原剂量为80μg/只，加弗氏不完全佐剂乳化，每隔2周免疫1次，腹腔免疫与皮下免疫间隔实施；第5次免疫3周后，以120μg/只的剂量从尾静脉加免。
4.血清抗体的检测
从第3次免疫开始，每次免疫第10天从小鼠尾部或眼框少量采血，用间接ELISA法检测血清抗体效价和对CIP的抑制率。
ELISA检测方法：以pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释将CIP-OVA稀释成300ng/mL的包被液，100μL/孔加入96孔板酶标板，4℃过夜，洗板后每孔加150μL10％脱脂奶粉，37℃封闭2小时，洗板后阴干备用；将血清用0.02mol/LpH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)做102～107倍梯度稀释测定抗体效价；用竞争ELISA方法检测抑制率，即在对照孔中加50μLPBS，在竞争孔中加50μL100ng/mLCIP标准溶液，将血清稀释至适当浓度，对照孔和竞争孔各加入50μL血清稀释液，后续步骤按间接ELISA方法操作；选对照孔OD值为0.8～1.2稀释度的一组计算
本发明所涉及的杂交瘤细胞株来源于经5次免疫免疫的Balb/c小鼠，第五次免疫后10天所采的血清，用ELISA方法测得其效价为106，对100ng/mLCIP标准溶液的抑制率为72％，10天后，以120μg/只的剂量从尾静脉进行第六次免疫，3天后取小鼠脾细胞用于细胞融合。
5.SP2/0骨髓瘤细胞的复壮
将106的SP2/0细胞分4点注入Balb/c小鼠背部皮下，当瘤体膨大至约0.3cm时，将小鼠引椎处死，在无菌条件下取出瘤体，将其制成细胞悬液，采用密度梯度离心法纯化SP2/0细胞；将其用1640培养基+8％小牛血清，在37℃，5％CO2条件下培养2～3代；当细胞处于对数期时，用液氮冻存F1～F3代SP2/0细胞备用。
6.细胞融合
融合前5天复苏一管经复壮的SP2/0F3代细胞；融合前3天选血清效价在105以上且对CIP的抑制率较高的小鼠，对其进行尾静脉加免抗原；融合前2天SP2/0细胞改用含2％8-AG培养基选择培养24小时，融合前1天换成1640培养基+10％胎牛血清培养；融合当天取6周龄空白小鼠的腹腔巨噬细胞和脾细胞作为饲养细胞，加1640培养基+15％胎牛血清+2％HAT(HAT选择培养基)制成细胞悬液；
将加免后的小鼠引椎处死，在无菌条件下取脾脏，脾细胞与SP2/0细胞以6：1的比例在50％PEG4000介导下融合；经2次200g，12min低速离心去除PEG后，向融合细胞中慢慢加入160mL密度约为5×105个/mL的饲养细胞悬液，小心混匀后，以200μl/孔加入96孔细胞培养板(筛选板)中，共铺8块板。
7.细胞培养
细胞融合后在37℃，5％CO2条件下培养；第1～2周，用1640培养基+15％胎牛血清+2％HAT的选择培养基；第3～4周，改HAT为2％HT过渡培养基；第5周后，停用HT，并将胎牛血清添加量降为10％。第10天和第20天，各筛选板补分别充一次饲养细胞，为了提高细胞活力和分泌抗体的特异性，在细胞培养过程中不添加任抗菌素。
8.阳性孔筛选
细胞融合后第4天在显微镜观察到已有少量杂交瘤细胞开始增殖，做第一次半换液，即每孔吸去100μl培养基上清，加入100μL新鲜的HAT选择培养基；融合后第6～30天，每3～4天取细胞上清做ELISA检测，先测效价，按阳性孔与阴性孔的OD值之比(P/N)＞2.1判别阳性孔；一般情况下，选取ELISA测得的OD＞0.8的阳性孔，取其细胞上清做适当稀释后，再检测CIP标准溶液对ELISA反应的抑制率。
9、单克隆细胞株的建立
细胞融合后第7天，选择抗体效价最高，且抑制率较好(200ng/mLCIP抑制率为85％)的阳性孔5C8进行单克隆，再经过几次亚克隆获得本次融合的第一个细胞株；但本发明细胞株的原始阳性孔5H1在融合后第20天才被筛选出来，5H1孔的抗体效价不高，原倍细胞上清的OD值仅为0.61，但因其被100ng/mLCIP抑制率达90％，经过再次ELISA复检确认后，对其进行克隆，经过克隆后的5H1E9细胞生长速度明显加快，细胞上清的抗体效价提高了200倍，被20ng/mLCIP抑制率达93％；再做1次亚克隆后，抗体效价进一步提高，将包括5H1E9E8在内的3个细胞系用液氮冻存；再做2次亚克隆后建立5H1E9E8D7H12细胞株(简称CIPH12)，即为本发明所涉及的杂交瘤细胞株。
取CIPH12细胞培养基上清液，做梯度稀释后用ELISA方法测定抗体效价为2×104；取适当(测定抗体效价时OD值最接近1.0)3个梯度的稀释液，分别用0、0.25、0.5、1、2、4、8ng/mL环丙沙星标准溶液做竞争ELISA，测得细胞培养基上清液中单克隆抗体(单抗)对环丙沙星的50％抑制浓度(IC50)为0.396ng/mL(见图2)，且该单抗对恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、麻保沙星、培氟沙星、洛美沙星、双氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、加替沙星、噁喹酸、氟罗沙星和司帕沙星均有较高的亲和力；而与青霉素、氯霉素、链霉素、四环素和磺胺嘧啶等其它类别的抗菌素无交叉反应。
CIPH12细胞株扩增后，将其F0代冻存35管，其中10管于2015年8月26日送中国典型培养物保藏中心，该培养物的存活性由保藏中心于2015年9月10日检测完毕，结果为存活，保藏编号为CCTCCNo:C2015118。
10、杂交瘤细胞染色体标本的制作
取一瓶处于对数生长期的CIPH12细胞，加入100μg/mL的秋水仙素，至终浓度为0.1μg/mL，在37℃，5％CO2条件下培养约30min后，刮下细胞，离心去上清，收集细胞；加入8mL0.075mol/L的氯化钾，低渗处理25min；加入1mL固定液(甲醇和冰醋酸按3:1比例配制)进行预固定，用吸管轻轻吹打混匀细胞，200g离心6min，去上清；再加入8ml固定液，用吸管轻轻吹打混匀细胞，室温下静置30min后，200g离心6min，弃上清液，依法重复固定2次；弃上清液，视细胞数量余留适量固定液，轻轻吹散细胞制备成细胞悬液，于垂直120cm高度滴于冰水浸泡的洁净载玻片上，在酒精灯上过火，室温下阴干。将阴干的玻片标本加入Giemsa染液，并进一步做G显带处理。选50个分裂象做众数分析，染色体数目为87-116条，平均染色体数为96条(图3)。
11、单克隆抗体的体外制备
CIPH12细胞株的F1和F2代用于生产单克隆抗体，将5×105的细胞接入1000mL玻璃细胞瓶，加50mL1640培养基(含10％胎牛血清)；在37℃，5％CO2条件下培养约72小时后，当细胞进入对数生长期，收集细胞上清液，将1瓶细胞分成3瓶，并加入新鲜培养基；约48小时后，再收集细胞上清液；此后，约2～3天收集1次细胞上清液，并将培养量扩大2～4倍，控制细胞量不超过60％培养瓶底面积，细胞可连续传代。收集细胞上清液立即加入等体积的饱和硫酸铵，4℃放置2～16小时，10000g离心30min；弃上清，沉淀用0.02mol·L-1PBS溶解，再加入2：1体积比饱和硫酸铵，10000g离心30min，弃沉淀，取上清；加饱和硫酸铵至占总体积的42％，4℃放置2小时后10000g离心30min，弃上清，沉淀经透析后获得初步纯化抗体，用考马斯亮蓝染色法测定蛋白浓度，合计收集10个工作日共获得19.8克初步纯化抗体蛋白，小管分装后，-80℃保存。
12、抗体亚型的确定
通过IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3、IgM、IgE、IgA、κchain、λchain分型二抗-HRP检测，本发明细胞株所产抗体亚型为IgG1λchain(λ链)。
13、抗体的纯化和保存
ProteinG对抗体进一步纯化，以0.1mol/L柠檬酸缓冲液(pH3.0)洗脱抗体后，立即用1mol/L的Tris-HCl(pH9.0)将洗脱液pH值调至中性。用间接ELISA方法检测纯化前、后抗体效价，纯化抗体回收率为70.5％；纯化时流穿液(CT)中未检测到抗体效价。将纯化后抗体、CT和细胞上清做SDS-PAGE电泳检测，检测结果表明抗体重链和轻链的分子量分别约为55kd和25kd(见图4)，流穿液和细胞上清中的杂蛋白主要是BSA。
将纯化的抗体1mL/管无菌分装，经冷冻干燥后，密封-20℃保存。
实施例3间接竞争ELISA方法检测鸡肉中氟喹诺酮残留
(1)包被：以pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释将CIP-OVA稀释成300ng/mL的包被液，100μL/孔加入96孔板酶标板，4℃过夜，洗板后每孔加150μL10％脱脂奶粉，37℃封闭2小时，洗板后阴干备用。
(2)抗体稀释：将上述经初步纯化抗体用PBS稀释1000倍，4℃保存备用。
(3)样本预处理：准备做QNs药物代谢的鸡胸肉和腿肉样本10个和对照样本3个，每个样本取50g鸡肉，用均质机搅碎均匀；称取2.0g匀质样本于5mL离心管中；加入4mL酸化乙腈，剧烈振荡3min后，室温下3220g离心5min，取上清提取液转移至10mL离心管，沉淀中加4mL酸化乙腈重复提取一次，合并提取液，用氮气吹干；向吹干的离心管中加入1mL正己烷和1mLQNs复溶液，振荡1min；静置分层后吸取下层溶液，高浓度的样本液用PBS稀释，待检；同时用对照样本做0.25、0.5、2μg/kg添加回收试验。
(4)测定：将样本液和0、0.25、0.5、1、2、4、8ng/mL的QNs系列标准溶液对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置；加系列标准溶液和样本液50μL到对应微孔中；每孔加50μL抗体溶液，用盖板膜盖板后，37℃孵育1小时；加250μL洗涤缓冲液洗板3次；加入100μL酶标二抗，37℃孵育1小时；加250μL洗涤缓冲液洗板6次，用吸水纸拍干；加入100μL显色液，室温避光显色20min；加入100μL终止液；用酶标仪于450nm处，测定每孔吸光度值。
(5)结果计算：用标准溶液或样本液的吸光度值(B)比0标准溶液的吸光度值(B0)计算用相对吸光度值(％)对应QNs标准溶液自然对数做半对数坐标系统曲线图；对应样本液中QNs浓度从校正曲线算出；鸡肉中 式中A为样本液的相对吸光度值对应的QNs浓度，n为样本稀释倍数，m为样本质量。
(6)方法的灵敏度、准确度和精密度：方法最低定量限(LOQ)为0.25μg/kg；回收率61％～118％；样本变异系数小于25％。
实施例4免疫胶体金(GICT)法检测猪肉中氟喹诺酮残留
(1)胶体金溶液的制备：胶体金颗粒的平均大小为30nm，制备方法为在100mL去离子水中加入1mL1％柠檬酸三钠，煮沸后迅速加入2mL1％氯金酸，继续煮沸10min，冷却后，4℃下保存备用。
(2)胶体金标记抗喹诺酮类药物单克隆抗体的制备：取已制备好的100mL胶体金溶液，用0.1mol/L碳酸钾溶液调pH到8.0。边搅拌边加入1.5mg抗喹诺酮类药物单抗，搅拌20min，再逐滴加入2mL25mol/L聚乙二醇20000(PEG20000)，搅拌15min。20,000rpm离心15min，弃上清液，加入10mLpH7.4PBS缓冲液(含0.4mol/LPEG)清洗2次。将沉淀用5mL含2％BSA的PBS缓冲液(pH7.4)溶解，用0.22μm无菌过滤器过滤后，4℃保存备用。
(3)喹诺酮类药物免疫胶体金快速检测试剂条的组装
试剂条的各部分组成成分和功能如下：
A、塑料模板，起固定背衬和标示各功能区(加样孔、检测区、控制区)的作用。
背衬，由一面涂有不干胶的不吸水韧性材料制成，起固定支撑试剂板其他组成部分的作用。
B、样品垫，由玻璃纤维制成，起吸收样品溶液和缓冲样品溶液pH值的作用。
C、胶体金结合垫，由聚酯膜制成，其上有抗喹诺酮类药物单克隆抗体与胶体金颗粒的结合物，为样品溶液中有效成分和金标抗体反应提供场所。
D、硝酸纤维素膜，从样品垫到吸水垫方向上依次喷有检测线和控制线，将反应结果以肉眼可见的颜色表征出来。
E、吸水垫，由滤纸制成，将反应过程中多余的溶液吸收。
用点膜机把适当浓度的载体蛋白偶联物及羊抗鼠IgG喷在硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和控制线，37℃烘箱干燥8h。以同样方法，将制备好的金标记喹诺酮类药物单克隆抗体包被在胶体金结合垫上。
检测试剂组成为PVC背衬，在其上按顺序粘上样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。用切割机将贴好的大卡切割成4mm宽的条，装入塑料模板中制成检测试剂板，再放入带干燥剂的铝箔袋中密闭储存。
(4)样品制备：取经猪肉样本12个，每个取100克，分别用均质机搅碎均匀；称取2g匀质样本于5mL离心管中，加入4mL酸化乙腈；剧烈振荡3min后，室温下3220g离心5min；取上层溶液1mL到新5mL离心管中，65℃下空气吹干；向吹干的离心管中加入0.3mL正己烷和0.3mLQNs复溶液(主要成分为PBS)，用试剂板内置的滴管轻轻吹打润洗离心管内壁；静置分层后吸取下层溶液，待检。
(5)GICT法检测：从包装袋中取出试剂板，吸取待检样品溶液100μL滴加到加样孔中，加样后开始计时；在3～5min读取结果，其他时间判读无效。同时用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测作为对比。
(6)添标和交叉反应试验：用阴性样本分别添加1～10μg/kg环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星等16种QNs标准品；同时取阴性猪肉样品4份，分别加入20μL100mg/L氯霉素、链霉素、四环素或磺胺嘧啶标准品做不同类型抗菌素的交叉反应试验；添标样本和交叉反应试验样本预处理方法同上。
打开试剂板，平放于试验台，用滴管吸取待检样本溶液，于加样孔中垂直滴加3滴(约100μL)，加样后开始计时；结果在3～5min读取。
(7)结果判读
读取结果时，将试剂板水平置于观察者正面。
阴性(－)：T线显色比C线深或一样深，表示样品中喹诺酮类药物残留含量低于0.5ppb或不含喹诺酮类药物残留。
阳性(+)：T线显色比C线浅，或T线无显色，表示样品中喹诺酮类药物残留含量高于0.5ppb；T线显色比C线越浅，表示样品中喹诺酮类药物残留含量越高。
无效：未出现C线，可能是操作不当或试剂板已失效。应再次阅读说明书，并用新的试剂板重新测试。
(9)检测结果：添标样本的检测结果(见图5)，GICT试剂条对环丙沙星的检出低限可达2μg/kg，并与恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、丹诺沙星、沙拉沙星、麻保沙星、培氟沙星、洛美沙星、双氟沙星、依诺沙星、氟甲喹、加替沙星、噁喹酸、氟罗沙星和司帕沙星等其它QNs药物有特异反应；免疫胶体金方法所检的12个猪肉样本中，3个为阴性样本，9个为阳性样本，与LC-MS/MS检测结果相符合；交叉反应试验表明试剂条上的T线显色均比C线略深，判断为阴性，因此该GICT试剂条与氯霉素、链霉素、四环素或磺胺嘧啶的交叉反应率＜1％。

Claims (10)

1.一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，命名为杂交瘤细胞株5H1E9E8D7H12，保藏编号为CCTCCNO.C2015118。
2.如权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备检测喹诺酮类药物的试剂盒和试纸条中的应用。
3.一种制备如权利要求1所述杂交瘤细胞株的方法，包括：
(1)将牛血清白蛋白和环丙沙星混合制备偶联物，再用所述偶联物免疫动物，获得能够产生抗喹诺酮类药物抗体的脾细胞；
(2)将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经筛选、克隆后，获得所述杂交瘤细胞株；
其特征在于，所述牛血清白蛋白与环丙沙星的投料比为1:10～30；所述偶联物的偶联比为2～6:1。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的筛选和克隆在无抗菌素的条件下进行。
5.一种单克隆抗体，其特征在于，由权利要求1所述的杂交瘤细胞株或其传代细胞株分泌产生。
6.如权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的亚型为IgG1λ链。
7.如权利要求5所述的单克隆抗体在检测喹诺酮类药物中的应用。
8.如权利要求5所述的单克隆抗体在检测动物源食用农产品残留喹诺酮类药物中的应用。
9.一种喹诺酮类药物的检测试剂盒，其特征在于，含有如权利要求5所述的单克隆抗体。
10.一种用于检测喹诺酮类药物的试纸条，包括：样品垫、标记物垫、反应膜和吸样垫，其特征在于，所述标记物垫包被有胶体金标记或酶标记的权利要求5所述的单克隆抗体。
CN201510990139.XA 2015-12-24 2015-12-24 一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 Active CN105586316B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510990139.XA CN105586316B (zh) 2015-12-24 2015-12-24 一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510990139.XA CN105586316B (zh) 2015-12-24 2015-12-24 一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105586316A true CN105586316A (zh) 2016-05-18
CN105586316B CN105586316B (zh) 2019-03-12

Family

ID=55926224

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510990139.XA Active CN105586316B (zh) 2015-12-24 2015-12-24 一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105586316B (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520704A (zh) * 2016-11-28 2017-03-22 江南大学 一株抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体杂交瘤细胞株yh6及其应用
CN106867970A (zh) * 2017-01-22 2017-06-20 杭州市农业科学研究院 一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN112162052A (zh) * 2020-11-06 2021-01-01 深圳市格物正源质量标准系统有限公司 一种水产品中兽药多残留的测定方法
CN116925997A (zh) * 2023-07-27 2023-10-24 湖北医药学院 一种喹诺酮类药物作为egfr激活剂促进细胞增殖的用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101792738A (zh) * 2009-08-31 2010-08-04 上海海洋大学 一种环丙沙星单克隆抗体细胞株及其单克隆抗体

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101792738A (zh) * 2009-08-31 2010-08-04 上海海洋大学 一种环丙沙星单克隆抗体细胞株及其单克隆抗体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUSRI MANASPONG ET AL.: "Production and Characterization of a Monoclonal Antibody Against Enrofloxacin", 《J.MICROBIOL.BIOTECHNOL.》 *
JUN-JIE CHEN AND JIN-QING JIANG: "Monoclonal antibody-based solvent tolerable indirect competitive ELISA for monitoring ciprofloxacin residue in poultry samples", 《FOOD AND AGRICULTURAL IMMUNOLOGY》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106520704A (zh) * 2016-11-28 2017-03-22 江南大学 一株抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体杂交瘤细胞株yh6及其应用
CN106520704B (zh) * 2016-11-28 2019-05-21 江南大学 一株抗喹诺酮类抗生素的群选性单克隆抗体杂交瘤细胞株yh6及其应用
CN106867970A (zh) * 2017-01-22 2017-06-20 杭州市农业科学研究院 一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN106867970B (zh) * 2017-01-22 2020-08-18 杭州市农业科学研究院 一种分泌抗孔雀石绿单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN112162052A (zh) * 2020-11-06 2021-01-01 深圳市格物正源质量标准系统有限公司 一种水产品中兽药多残留的测定方法
CN116925997A (zh) * 2023-07-27 2023-10-24 湖北医药学院 一种喹诺酮类药物作为egfr激活剂促进细胞增殖的用途
CN116925997B (zh) * 2023-07-27 2024-04-02 湖北医药学院 左氧氟沙星在制备促进细胞增殖中的药物的用途

Also Published As

Publication number Publication date
CN105586316B (zh) 2019-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101988924B (zh) 检测血液抗环瓜氨酸多肽抗体的试纸条及制备方法
CN102062777B (zh) 胶体金层析法原发性胆汁肝硬化检测试纸及其制备方法
CN104849467B (zh) 检测盐酸克仑特罗残留的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用
CN105586316A (zh) 一种分泌抗喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN102279269A (zh) 胱抑素c检测剂盒的制备方法
CN105044365B (zh) 检测恩诺沙星残留的时间分辨荧光免疫分析试纸的制备方法
CN101226195B (zh) 一种检测肿瘤型m2丙酮酸激酶的试剂盒及其制备方法
CN208607233U (zh) 同时定量检测喹诺酮、四环素和磺胺的试剂条和试纸卡
CN103575889A (zh) 一种检测万古霉素的试纸条及方法
CN103333864B (zh) 抗弓形虫mic3蛋白单克隆抗体及其应用
CN100489530C (zh) 一种检测磺胺喹噁啉的方法及其专用酶联免疫试剂盒
CN102879574A (zh) 转bar/pat基因植物及其衍生产品的快速检测试纸条
CN102766212A (zh) 用于检测氟喹诺酮类药物残留的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒
CN100476439C (zh) 一种检测动物源性食品中氟喹酮类药物的酶联免疫试剂盒
CN105131111B (zh) 一种人乳铁蛋白单克隆抗体对
CN107677807A (zh) 一种吉他霉素磁免疫化学发光检测试剂盒
CN105628923A (zh) 一种半定量免疫胶体金试纸条及其应用
CN103288661A (zh) 一种孔雀石绿半抗原制备方法及其应用
CN1979169A (zh) 腹泻性贝毒竞争酶联免疫定量检测试剂盒及其制备和应用
CN106443025A (zh) 一种通用型检测氟喹诺酮类药物的免疫金标卡及其制备方法
CN110927375A (zh) 一种检测喹乙醇残留的荧光微球免疫层析试纸条及其应用
CN102621311B (zh) 胶体金层析法抗ssb抗体检测试纸及其制备方法
CN101329344A (zh) 一种豚鼠气单胞菌胶体金快速检测试纸条
CN103424550A (zh) 一种检测氯霉素的试剂盒及方法
CN106754741A (zh) 一种分泌抗1‑氨基‑乙内酰脲单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant