CN101329344A - 一种豚鼠气单胞菌胶体金快速检测试纸条 - Google Patents

Abstract

一种豚鼠气单胞菌胶体金快速检测试纸条，涉及一种豚鼠气单胞菌检测试纸条及其在水产动物疾病诊断上的应用。该试纸条的特征在于：金标抗体结合垫上干燥结合了胶体金标记的抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体或抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体；免疫硝酸纤维素膜的检测线上包被了抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体或抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体、质控线包被了抗鼠IgG抗体或葡萄球菌A蛋白。本发明的检测试纸条操作简单、特异性好、灵敏度高、方便快速，不需要特殊仪器设备，不需专业培训，结果清晰易辨，易于推广。适合用于疾病诊断以及检疫的大批量现场检测，适合流行病学调查，对豚鼠气单胞菌的感染、污染诊断起辅助作用。

Description

一种豚鼠气单胞菌胶体金快速检测试纸条

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种豚鼠气单胞菌检测试纸条在水产动物疾病诊断上的应用。

背景技术

豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)是水产养殖中常见的致病菌，传染途径为通过损伤的皮肤或伤口侵袭宿主，具有发病快、流行广、导致死亡率高等特点，严重影响水产养殖业的发展。按常规的细菌分离鉴定诊断豚鼠气单胞菌复杂费时，易延误防治时机，因此，建立准确、及时的诊断技术是控制豚鼠气单胞菌危害的基本前提。国内对豚鼠气单胞菌病的诊断也进行了一系列的研究，如利用兔抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体、抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体建立的ELISA检测方法应用于豚鼠气单胞菌的免疫学检测，虽然他们都能在几小时内诊断出豚鼠气单胞菌，具有较高的特异性和灵敏度，但存在技术要求高、设备比较昂贵等缺点；另外，豚鼠气单胞菌噬菌体诊断技术虽然操作简便，但存在一定的交叉反应。已建立的这些方法都存在着不便于基层生产应用、设备要求高、检测时间长等缺点。针对豚鼠气单胞菌在水产动物中的流行状况以及防治要求，对豚鼠气单胞菌的诊断，不但要求较高的特异性和灵敏度，还需要快速、简便，适合于基层水产生产者、基层水产技术推广单位和水产动物检疫的使用。

胶体金免疫层析技术由于其快速、便捷，不需特殊设备，结果判断直观等优势，越来越受到人们的重视。本发明利用单克隆抗体和胶体金标记技术建立豚鼠气单胞菌胶体金免疫层析快速检测方法。

发明内容

本发明的目的在于公开一种豚鼠气单胞菌的胶体金快速检测试纸条，并提供该试纸条的制备方法，应用于水产病原检测，具有特异、准确、快速、操作简单、现场检测、高通量检测、易于推广应用的优势。应用该试纸条检测豚鼠气单胞菌全过程不超过10min。

本发明制备的检测豚鼠气单胞菌的胶体金快速检测试纸条，该试纸条从上到下依次重叠固定有吸水纸、免疫硝酸纤维素膜、金标抗体结合垫、样品垫，金标抗体结合垫上干燥结合了胶体金标记的抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体或抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体；免疫硝酸纤维素膜的检测线上包被了抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体或抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体、质控线包被了抗鼠IgG抗体或葡萄球菌A蛋白。

本发明提供的检测豚鼠气单胞菌的胶体金快速检测试纸条采用如下方法制备：

(1)金标抗体结合垫的制备：制备胶体金颗粒，并采用标记体系标记抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体或多克隆抗体，将金标抗体在支持膜上固相化；

(2)免疫硝酸纤维素膜的制备：在硝酸纤维素膜检测线位置上包被抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体或抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体，质控线位置上包被抗鼠IgG抗体或葡萄球菌A蛋白；

(3)将吸水纸、免疫硝酸纤维素膜、金标抗体结合垫、样品垫、底板组装成胶体金快速检测试纸条。

本发明的积极效果在于：

(1)低价格：产品生产流程简单，生产成本低；

(2)检测速度快：全过程10min内完成；

(3)可用于生产现场检测、高通量检测；

(4)高质量：本方法制备而成的试纸条特异性好、灵敏度高、重复性好；

(5)操作简单：本方法制备而成的试纸条以胶体金作为指示标记，快速定性，结果准确、快速，操作简便，只需要加样检测与结果记录步骤；

(6)易于推广使用：操作人员无需专业培训，按说明书即可完成操作。

附图说明

附图为本发明豚鼠气单胞菌胶体金快速检测试纸条的组装结构图：1、样品垫2、金标抗体结合垫3、检测线位置4、质控线位置5、免疫硝酸纤维素膜6、吸水纸7、底板。

具体实施方式

本发明的具体实施方式参照下面的实施例进行详细说明，但并不局限于此。

具体来说，本检测试纸条采用如下方法制备：

(1)抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体的制备：取杂交瘤细胞株在体外常规培养、传代后，用Balb/c小鼠腹腔注射制备腹水，并经过纯化提纯单克隆抗体；

(2)胶体金颗粒的制备：采用还原剂将氯金酸还原成胶体金颗粒；

(3)抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体胶体金标记物的制备：将上述胶体金溶液的pH值调值7.6-10，将胶体金溶液与抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体混合均匀，并使胶体金与抗体形成稳定的胶体金复合物，在通过纯化、浓缩后形成胶体金标记物；

(4)抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体的制备：用豚鼠气单胞菌多次免疫新西兰兔，获得血清，纯化得多克隆抗体；

(5)将抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体金标记物喷涂在支持膜上，将豚鼠气单胞菌单克隆抗体或多克隆抗体和抗鼠IgG抗体喷涂在硝酸纤维素膜上，烘干；

(6)将免疫硝酸纤维素膜、金标抗体结合垫、样品垫、吸水垫等依次粘在底板上；

(7)将粘好的底板材料切成一定宽度的试纸条。如果制作成试纸板则再将制成的试纸条装到一定大小的塑料盒内即可。

实施例1.胶体金颗粒的制备

1 材料与方法

1.1 试验材料

三角瓶500mL一个，三角瓶100mL一个、量筒500mL一个、量筒100mL一个、柠檬酸、氯金酸、移液管10mL一条、电子天平

1.2 试验方法

1.2.1 三角瓶、量筒、移液管经洗净并用双蒸水冲洗，再经1％双氯硅烷/氯仿浸泡1h，烘干。

1.2.2 将三角瓶、量筒、移液管用超纯水清洗干净备用。

1.2.3 用超纯水配置0.01％四氯化金溶液500mL、1％柠檬酸溶液10mL。

1.2.4 取500mL三角瓶一个，加500mL0.01％氯金酸溶液，加热至沸腾；

1.2.5 取8mL 1％柠檬酸钠加入上述溶液中，迅速混匀，再保持沸腾15min，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红。

2、试验结果

经过电子显微镜、紫外分光光度计波长扫描观察测定，光谱扫描最大吸收峰在254nm处，所制备的胶体金颗粒均匀度较高，电子显微镜测定颗粒直径为25nm。

实施例2.单克隆抗体的建株

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 仪器CO₂培养箱，无菌罩，台式离心机，液氮罐，倒置显微镜，荧光显微镜，酶联免疫检测仪，手持电动移液器，单孔、多孔微量移液枪。

1.1.2 材料50mL和100mL细胞培养瓶；圆底离心管50mL；塑料离心管5-20mL；康氏管、华氏管；移液管1-20mL；弯头、直头滴管，菌种瓶(玻璃、塑料)1-1.5mL；橡皮头，96、24孔细胞培养板；96孔酶标板，1-50mL注射器。

1.1.3 培养基RPMI-1640，小牛和胎牛血清，8-氮杂鸟嘌呤，HAT，HT。

1.1.4 试剂双抗，7.5％NaHCO₃，PEG，DMSO，液体石蜡，兔抗鼠酶标二抗、

1.2 杂交融合实验

1.2.1 杂交瘤细胞复苏

1.2.1.1 SP2/O细胞的制备收集SP2/O细胞，于50mL离心管内，1000r.min^-1离心5min，弃上清，将SP2/O细胞重悬在10mL培养基中备用。

1.2.1.2 Balb/c小鼠免疫脾细胞的制备取三免3～5d内的免疫小鼠无菌将脾脏完整地剪下，移到平皿中，剪除多余的脂肪和结缔组织，用弯头眼科镊子的背部反复轻压脾脏，充分捣碎脾内细胞，用培养液将含有脾细胞的悬液吹打数次，然后将脾细胞移到离心管内，1000r.min^-1离心5min，弃上清，在手背部反复磨擦，直至细胞团基本散开。

1.2.1.3 将低渗处理的脾细胞离心，弃上清，松弛细胞团，重悬在10mL培养基中，并进行计数。

1.2.2 杂交融合

1.2.2.1 SP2/O细胞和免疫脾细胞按1∶2～1∶5比例混合，混匀，同上离心5min，弃上清，同上松弛细胞团。

1.2.2.2 缓慢加入1mL细胞融合剂，同时不断地旋转离心瓶。

1.2.2.3 3min内缓慢加入3mL RPMI-1640。

1.2..2.4 3min内缓慢加入9mL RPMI-1640。

1.2.2.5 3min内缓慢加入20mL RPMI-1640。两掌中搓捻离心管3min。同上离心，弃上清，松弛细胞团。将细胞重悬在15％牛血清和HAT的全价选择培养基。按每mL10⁵个SP2/O细胞中做进一步稀释，并移到一无菌的加样槽中，用8孔微量移液器，将细胞分装到96孔培养板中，每孔0.1mL，5％CO₂中培养到第五d，每孔加0.1mL新的HAT培养液，继续培养5d。

1.2.2.6 于第8～12d，观察杂交瘤细胞的生长情况，待杂交瘤细胞长至占孔底二分之一时或培养液颜色偏黄时，在细胞板上做好标记，首先是板的标记，然后是孔的坐标，分别将待检的上清移到无菌处理的旧板内，每孔取0.1mL，然后进行抗体活性测定。第二批及第三批长大的细胞，按上述方法分批检测，对于有杂交瘤细胞生长细胞孔，生长时间超过12d的进行半量换液。当用于检测的上清移走后，马上加入等量新鲜的HT培养基。

1.3 细胞克隆

取对数生长期的细胞，吹打成细胞悬液，滴加培养基中混匀后滴1滴于计数板上计数，调整使终浓度大约20cells.mL^-1，然后向96孔培养板每孔滴加1滴(约含1个细胞)，5％CO₂37℃培养。隔天观察克隆细胞生长情况，挑选只含一个细胞克隆的孔，做好标记并补加培养液，继续培养。待克隆长至孔底面积的1/3～1/2时，转至24孔板扩大培养。

1.4 阳性杂交瘤细胞的扩大培养

初筛检测为抗体阳性的杂交瘤细胞扩大到24孔细胞培养板：先用100μL微量移液枪吹打原孔悬浮细胞，将细胞移到24孔板中，加1mL新鲜的HT培养基同时在原孔中也加0.1mL HT培养基5％CO₂培养24～48h，进行2次检测。

1.5 阳性杂交瘤细胞的特异性分析

用ELISA、间接荧光法(FA)或其他方法如菌体凝集试验、血球凝集抑制、中和保护试验等对扩大培养的细胞进行进一步的分析检测。对于检测出良好特异性的或具有其他功能的杂交瘤细胞尽快进行克隆。

2 试验结果

通过细胞融合后的阳性克隆化、特异性筛选，共建立3株抗豚鼠气单胞菌细胞株单克隆细胞株。分别为1F10、0E10、1C4。

实施例3.单克隆抗体腹水的制备

1 材料与方法

1.1 试验材料

Balb/c小鼠，6～8周龄；液体石蜡121℃灭菌15min，4℃保存备用1mL、2mL塑料一次性无菌注射器，针头(5#、6#)；对数生长期的杂交瘤细胞。

1.2 试验方法

1.2.1 Balb/c小鼠诱导注射杂交瘤前1～2周，每只小鼠腹腔注射灭菌的液体石蜡0.2mL，分笼饲养。

1.2.2 注射杂交瘤先取少量细胞上清液检测抗体的活性和滴度，对数生长期内的杂交瘤细胞吹打收集，1000～1500r.min^-1离心5min沉淀细胞，用不含血清的培养基约0.5～1mL重悬，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5mL。

1.2.3 收集腹水约7～10d后观察小鼠腹部，有明显腹水者用12#针头由腹腔下侧穿刺回收腹水，3000r.min^-1离心5min，沉淀红细胞及血细胞，收集上层淡黄色的腹水，次日测定腹水效价，做好标记，长期保存的冻于-80℃，短期可冻于-20℃。

2 试验结果

通过腹水制备，共获取抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体腹水3株，各约20mL。实施例4.单克隆抗体的纯化

1 材料与方法

1.1 试验材料

饱和硫酸铵pH 7.1、超纯水、0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PB)pH 7.2、辛酸。

1.2 试验方法

1.2.1 血清10mL经10000r.min^-1离心10min去除沉淀，上清加10mL纯水2倍比稀释。

1.2.2 20％饱和硫酸铵(SAS)沉淀向20mL血清稀释液内缓慢滴加冰冷的硫酸铵5mL，边滴加边混匀，则液体的硫酸铵终浓度为20％饱和度。室温静置2h。

1.2.3 4000r.min^-1离心10min，去除沉淀，上清滴加SAS 3.57mL，终浓度30％饱和度，4℃静置过夜。

1.2.4 5000r.min^-1离心10min，分离沉淀和上清。沉淀重悬于4mL生理盐水成4.5mL溶液，在磁力搅拌的条件下滴加SAS 1.9mL至终浓度30％饱和度，继续磁力搅拌30min(压加冰杯冷却)，4℃反应2h，4000r.min^-1离心10min，沉淀重悬于4mL生理盐水成4.5mL溶液，滴加SAS 3mL至终浓度60％饱和度，4000r.min^-1离心10min，沉淀4℃保存备用。

1.2.5 取鼠腹水两次硫铵沉淀后透析过夜.

1.2.6 用紫外分光光度计测其浓度.

1.2.7 把蛋白稀释至8～10mg.mL^-1再用相应浓度的醋酸液2倍体积作用0～10min后加入辛酸，室温作用25min，4℃作用30min。

1.2.8 4000r.min^-1离心10min后，取上清弃沉淀，PBS透析。

实施例5.抗鼠IgG抗体的制备

1 材料与方法

1.1 试验材料

经纯化后的鼠抗豚鼠气单胞菌的多抗血清7mg、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、新西兰兔。

1.2 试验方法

1.2.1 免疫剂量每只新西兰兔注射抗原1.5mL。

1.2.2 免疫程序首免抗原加等量的完全弗氏佐剂，腹腔注射1.5mL，2～3周内进行二免，抗原加等量不完全弗氏佐剂，一个月后三免，并进行抗体效价检测。

1.2.3 免疫结束，通过颈动脉割取血，经5000r.min^-1离心后收集血清，无菌分装，-80℃保存备用。

2 试验结果

获得兔抗鼠IgG抗体血清60mL。

实施例6.抗体的亲和纯化

1 材料与方法

1.1 试验材料

含IgG的样品、PBS、装有2mL固相化的蛋白A小型层析柱、透析袋、分步收集器、蠕动泵、UV监测器、pH计。

结合缓冲液  0.1mol.L^-1Tris-HCl pH7.5+0.15mol.L^-1NaCl。

洗脱缓冲液  0.1mol.L^-1Gly-HCl pH2.8+0.15mol.L^-1NaCl。

中和缓冲液  1mol.L^-1Tris-HCl pH 8.0。

1.2 试验方法

1.2.1 样品(血清、腹水)。

1.2.2 样品与结合缓冲液1∶1稀释混合。

1.2.4 至少用10mL结合缓冲液，以1mL.min^-1速度，洗涤柱中的2mL亲和层析介质。

1.2.5 上样。

1.2.6 样品进入凝胶后，用结合缓冲液洗柱(至少10个柱体积)，直至A280nm小于0.03。

1.2.7 用洗脱缓冲液洗脱所结合的IgG，分布收集每管2mL。

1.2.8 收集过程中，每管立即加入0.1mL中和缓冲液，以中和洗脱所得的IgG液。

1.2.9 含IgG的各管对PBS透析，其后根据抗体的稳定性，加入防腐剂，4℃或冷冻保存。

2 试验结果

获得兔抗鼠多克隆抗体血清5mg，3个细胞株的单克隆抗体各2mg。

实施例7.配对抗体的选择

1 材料与方法

1.1 试验材料

0.1mol.L^-1PBS pH7.41000mL，HRP酶底物OPD 500mL，邻苯二胺(OPD)，H₂O₂(30％)，PBST(PBS+0.1％Tween-20)2000mL，封闭液(抗体稀释液)100mL，2mol.L^-1H₂SO₄。

1.2 试验方法

1.2.1 包被包被量根据具体条件有所不同，包被蛋白用PBS稀释至浓度范围1μg·mL^-1～50μg·mL^-1，可设不同抗体稀释度来确定最佳使用量。每孔50μL。4℃过夜或者室温3h后封闭。

1.2.2 封闭弃去包被液，以含2％牛血清的PBST封闭，每孔80μL，1.5～2h后弃去封闭液，经PBST洗涤一次拍干。

1.2.3 一抗一抗用抗体稀释液稀释至适当浓度，每孔50μL，室温孵育1.5h左右，PBST洗三遍，拍干。

1.2.4 二抗用抗体稀释液稀释(约1∶1000～1∶2000)，每孔50μL，室温孵育1h，PBST洗三遍，蒸馏水洗一遍，拍干。

1.2.5 显色加H₂O₂活化的OPD每孔50μL，置37℃湿盒(避光)，每十分钟观察一次，当显色较强时(大约15min后，显棕黄色)，加终止液2mol.L^-1H₂SO₄每孔50μL，置于酶联免疫检测仪中492nm波长处读数。

2 试验结果

纯化后的豚鼠气单胞菌单克隆抗体的效价分别为10⁴，兔抗鼠IgG抗体效价为10⁶。间接测定表明鼠单克隆抗体与兔多克隆抗体的可形成夹心免疫复合物。

实施例8.抗体的胶体金标记以及金标抗体结合垫的制备

1 材料与方法

1.1 试验材料

胶体金溶液、单克隆抗体、10％NaCl、25mmol·L^-1K₂CO₃、1mol·L^-1HCl、1.5mL试管、玻璃纤维素膜。

1.1 试验方法

1.1.1 蛋白与胶体金结合最佳pH测定

1.1.1.1 取若干个1.5mL试管，分别加入1.5mL 25nm胶体金。

1.1.1.2 用0.05mol·L^-1K₂CO₃和0.1mol·L^-1HCl将胶体金溶液的pH分别调为3、4、5、6、7、8、9、10、11。

1.1.1.3 分别加入单克隆抗体20μL，浓度为1mg·mL^-1，迅速混匀，室温下放置30min。

1.1.1.4 每孔分别加入5％KCl 50μL，混匀后静置4h。

1.1.1.5 观察颜色变化较小的组，记录pH(X)值。

1.1.1.6 将pH调为X-0.8、X-0.6、X-0.4、X-0.2、X、X+0.2、X+0.4、X+0.6、X+0.8、X+1，重复(1.1.1.1)-(1.1.1.5)步。

1.1.1.7 观察颜色变化较小的组为稳定组，该pH值为最适标记酸碱度。

1.1.2 最小蛋白浓度的确定

1.1.2.1 蛋白经过10000r.min^-1离心20min，弃沉淀。

1.1.2.2 抗体浓度调至1mg.mL^-1。

1.1.2.3 用0.05mol.L^-1K₂CO₃和0.1mol.L^-1HCl将胶体金溶液调至最适pH值。

1.1.2.4 10000r.min^-1离心20min，弃沉淀。

1.1.2.5 取一96孔滴定板，每个重复为3个孔，分别加入最佳pH的胶体金100μL。

1.1.2.6 各孔依次加入蛋白(1，2，3，4，5，6……25μL)，混匀，室温下放置40min。

1.1.2.7 加20μL 10％NaCl，混匀后静置4h。

1.1.2.8 观察颜色变化较小的组，记录加入的蛋白量，该蛋白浓度为抗体的最适标记浓度。

1.1.3 单克隆的胶体金标记

1.1.3.1 取两个50mL试管，分别加入10mL 25nm胶体金。

1.1.3.2 加入适量0.2mol.L^-1mol.L^-1K₂CO₃把调整pH。

1.1.3.3 冰浴条件下，加入抗体反应20min，4℃12000r·min^-1离心60min，弃上清。

1.1.3.4 用0.2mol·L^-1硼酸盐缓冲液(1％BSA、0.02％PEG、0.3％Tween-20、0.1mol.l^-1NaCl)10mL重悬沉淀。

1.1.3.5 4℃12000r·min^-1离心60min，弃上清。

1.1.3.6 重复(1.1.3.4-1.1.3.5)1次。

1.1.3.7 0.05mol·L^-1PB(1％BSA、0.02％PEG、12％蔗糖、0.3％Tween-20、1％NaN3，0.1mol·L^-1NaCl)重悬沉淀，4℃贮存备用。

1.1.4 金标抗体结合垫的制备

将标记好的免疫胶体金调整到合适的浓度，均匀的喷涂在支持膜上，在37℃温箱中过夜烘干后，密封包装置于4℃冰箱备用。

2 试验结果

形成其中1F10单克隆抗体的胶体金标记配方，配方组成为：标记体系pH值为9.6；最佳蛋白包被浓度为10μg.mL^-1，胶体稳定剂为PEG、牛血清白蛋白，浓度分别为0.02％，1％，抗体保护剂为蔗糖12％，离子浓度为0.05mol.L^-1的磷酸盐缓冲液和0.1mol·L^-1NaCl，表面活性剂为tween-20，浓度为0.3％。

同时将胶体金标记的抗体喷涂到支持膜上，冷冻干燥，制成金标抗体结合垫备用。

实施例9.免疫硝酸纤维素膜的制备

1 材料与方法

1.1 试验材料

Millipore 135硝酸纤维素膜，单克隆抗体，兔抗鼠多克隆抗体，bio-dot胶体金喷点系统。

1.2 试验方法

1.2.1 将硝酸纤维素膜用3％的甲醇溶液浸泡飘洗后，迅速轻柔洗干，干燥。

1.2.2 将上述的硝酸纤维素膜置于含有一定离子浓度、表明活性剂、聚合物浓度的缓冲液中漂洗润湿后，取出，37℃烘干备用。

1.2.3 将抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体、兔抗鼠IgG抗体分别加入bio-dot胶体金喷点系统的检测线、质控线的储存瓶中，调整划膜的位置，调整划膜的量与速度，进行喷膜划线。

1.2.4 将划好检测线、质控线的硝酸纤维素膜置于37℃温箱中烘干2h后取出。

1.2.5 取出硝酸纤维素膜置于中性蛋白中浸泡润湿后立即取出，置于37℃温箱中烘干4h后，密封保存在4℃冰箱备用。

2 试验结果

制备了具有免疫活性的检测线和质控线，并将空白位点封闭了的免疫硝酸纤维素膜。

实施例10.试纸条的组装

1 材料与方法

1.1 试验材料

底板、吸水纸、免疫硝酸纤维素膜、金标抗体结合垫、样品垫、塑料外壳。

1.2 试验方法

1.2.1 将吸水纸、免疫硝酸纤维素膜、金标抗体结合垫、样品垫分别裁成宽为2.5cm、2cm、0.5cm、1.5cm的长条形。

1.2.2 将底板裁成宽6cm的长条形。

1.2.3 将免疫硝酸纤维素膜沿不干胶底板的长轴方向、距不干胶底板上边沿2.2cm、下边1.8cm位置粘贴。

1.2.4 将吸水纸与免疫硝酸纤维素膜重叠0.3cm处粘贴在硝酸纤维素膜的上方。

1.2.5 将金标抗体结合垫与免疫硝酸纤维素膜重叠0.1cm处粘贴在免疫硝酸纤维素膜的下方。

1.2.6 样品垫与金标抗体结合垫重叠0.1cm粘贴在金标抗体结合垫的下方。

1.2.7 将从上到下依次固定有将吸水纸、免疫硝酸纤维素膜、金标抗体结合垫、样品垫的底板裁切成宽×长为0.4cm×6cm的长条，即成测试条，与干燥剂一起装入铝箔袋内，密封贮存。

2 试验结果

经过组装、剪裁、干燥、密封步骤，即可组装成豚鼠气单胞菌胶体金快速检测试纸条。

实施例11.检测方法

1 材料与方法

1.1 试验材料

检测样本、豚鼠气单胞菌胶体金快速检测试纸条。

1.2 试验方法

1.2.1 待检样品的处理：固态样本如发病动物病灶组织、水产品或细菌培养物等样本，取25g加蒸馏水研磨离心或静置待沉淀取上层清液；血液、腹水等液体样本可直接抽取检测样本；含菌量较少的样品可经过培养基增菌后取菌液直接检测；

1.2.2 将豚鼠气单胞菌胶体金快速检测试纸条恢复室温；

1.2.3 拆开试纸条密封袋，取出检测试纸条，抽取检测样本150μL，缓慢加入检测卡上的加样孔内；

1.2.4 5min后观察检测试纸条的显色情况，记录结果。

2 试验结果

若质控线与检测线在5min内都显色，则结果判定为阳性，可进行病原菌的鉴定。

若质控线显色，检测线不显色则判定结果为阴性。

若检测线、质控线都不显色则结果判定为试纸条变质失效。

Claims (4)

1、一种豚鼠气单胞菌胶体金快速检测试纸条，该试纸条从上到下依次重叠固定有吸水纸(6)、免疫硝酸纤维素膜(5)、金标抗体结合垫(2)、样品垫(1)，其特征在于：金标抗体结合垫上干燥结合了胶体金标记的抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体或抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体；免疫硝酸纤维素膜的检测线上包被了抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体或抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体、质控线包被了抗鼠IgG抗体或葡萄球菌A蛋白。

2、一种权利要求1所述的豚鼠气单胞菌胶体金快速检测试纸条的制备方法，其特征在于：该试纸条的制备方法包括以下步骤：

(1)金标抗体结合垫的制备：制备胶体金颗粒，并采用标记体系标记抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体或多克隆抗体，将金标抗体在支持膜上固相化；

(2)免疫硝酸纤维素膜的制备：在硝酸纤维素膜检测线位置上包被抗豚鼠气单胞菌单克隆抗体或抗豚鼠气单胞菌多克隆抗体，质控线位置上包被抗鼠IgG抗体或葡萄球菌A蛋白；

(3)将吸水纸、免疫硝酸纤维素膜、金标抗体结合垫、样品垫、底板组装成胶体金快速检测试纸条。

3、根据权利2所述的豚鼠气单胞菌胶体金快速检测试纸条的制备方法，其特征在于：在权力要求2步骤(1)中所述的标记体系为：标记pH值为9.6；蛋白包被浓度为10μg·mL^-1，胶体稳定剂为0.02％PEG、1％牛血清白蛋白，抗体保护剂为蔗糖12％，离子浓度为0.05mol·L^-1的磷酸盐缓冲液和0.1mol·L^-1NaCl，表面活性剂为0.3％tween-20。

4.一种权利1所述的豚鼠气单胞菌胶体金快速检测试纸条在检测豚鼠气单胞菌上的应用。

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