CN110058019A - 一种猪瘟抗体阻断检测试纸 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种猪瘟抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，抗原垫吸附猪瘟病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“|”和质控线C“|”印迹，检测线T为抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb2或抗猪瘟病毒多克隆抗体pAb1印迹，质控线C为抗小鼠IgG抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹。本发明试纸实现了猪瘟病毒中和抗体的快速检测，可实现对猪瘟母源抗体和免疫抗体水平的实时监测，以及疫苗免疫效果的免疫评价，并且操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

Description

一种猪瘟抗体阻断检测试纸
技术领域
本发明涉及一种家畜疫病抗体检测器具，特别是涉及一种猪瘟抗体阻断检测试纸。
背景技术
猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fevervirus，CSFV)引起的一种以高热、出血和高死亡率为特征的高度接触性传染病，世界动物卫生组织(OIE)将其列入OIE疫病名录，为须申报的动物传染病，我国列为一类动物疫病。我国采用免疫猪瘟兔化弱毒(hog cholera lapinized vaccine，HCLV)疫苗预防和控制了CSF的大规模流行。但近年来CSF的流行和发病特点又发生新变化，多表现为非典型、慢性和隐性感染，出现了所谓“非典型猪瘟”、“温和型猪瘟”和“带毒母猪综合征”，其仍是危害养猪业的主要传染病之一。CSFV属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，与同属的牛病毒性腹泻病毒1型(bovine diarrhea virus 1，BVDV-1)、牛病毒性腹泻病毒2型(BVDV-2)、绵羊边界病毒(border disease virus，BDV)和长颈鹿瘟病毒(pestivirus ofgiraffe)具有很高的同源性，并存在血清学交叉反应。CSFV基因组为单股正链RNA，大小约1.23×104nt，由5’端非编码区(5’-untranslated region,5’-UTR)、一个开放阅读框(openreading frame,ORF)和3’-端非编码区(3’-UTR)构成，且5’端无甲基化“帽子”结构，3’端无多聚腺苷酸(poly A)结构。该大的ORF编码约3899个氨基酸残基的多聚蛋白前体，由病毒和宿主细胞蛋白酶加工形成12种成熟的病毒蛋白，即C、Erns、E1和E2等4种结构蛋白和Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B等8种非结构蛋白。依据5’-UTR、E2和NS5B基因序列差异，CSFV分为3个基因群，10个基因亚群，即1.1、1.2、1.3，2.1、2.2、2.3，3.1、3.2、3.3和3.4。流行病学调查显示，我国2000年后的CSFV流行毒株分为3个基因亚群，即1.1、2.1和2.2，其中2.1基因亚群在我国猪瘟流行中占主导地位。
目前，我国猪瘟的防控采取以疫苗免疫为主的策略，动物母源抗体是影响猪瘟疫苗免疫效果的重要因素，对动物母源抗体和免疫抗体水平的监测是制定和优化猪瘟免疫程序的重要依据；同时，免疫动物的血清抗体水平，尤其是中和抗体水平是猪瘟疫苗免疫评价的重要指标。目前常用猪瘟抗体检测方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)和病毒中和试验(VN)等。间接ELISA具有较高的灵敏性，适于大量的血清学监测，可以标准化而且结果易于分析，但不能区分中和与非中和抗体，无法准确评价免疫保护效果。VN试验是最敏感而特异的中和抗体检测方法，猪瘟中和抗体水平与免疫保护直接相关，但该技术方法不但费时，操作繁琐，费用昂贵，而且病毒培养必须在III级生物安全实验室(P3)操作，技术和安全措施要求极高，无法实现临床样品的大量、实时检测。因此，虽然上述检测方法可检测猪瘟抗体水平，但均存在试验操作复杂，耗时长，需要特定的专业技能和仪器设备等，成本昂贵，常限于实验室内进行，很难在基层普及和推广，不适合大批量样本的普查。此外，当前广泛流行的猪瘟病毒流行毒株与我国普遍使用的疫苗毒株HCLV在遗传学、免疫反应和保护效力等方面存在较大差异，免疫动物中猪瘟强毒感染仍然时有发生，同时由于缺乏血清学标志和配套的鉴别诊断方法，其在我国的大规模应用使得通过酶联免疫吸附试验(ELISA)等抗体检测技术很难区分弱毒免疫和野毒感染，不利于猪瘟的控制和净化。
免疫层析试纸是在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一种新型体外检测技术，是理想的即时检测(point-of-care test,POCT)和现场检测技术，具有更加灵敏、特异、简便、快速等优点，尤其是可实现“傻瓜式”操作，即不需要任何附加仪器设备即可进行现场检测，并在1～5min内判定结果，广泛应用于各种分析物的定性和半定量快速检测，包括抗原、半抗原、抗体和核酸，已成为当今快速敏感的免疫学检测技术之一。因此研制动物疫病病原和抗体检测胶体试纸产品具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是研制适用于猪瘟抗体检测与疫苗免疫评价的猪瘟抗体阻断检测试纸，本试纸特异、敏感、快捷、简便，易在生产实践中推广应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种猪瘟抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，抗原垫吸附猪瘟病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“|”和质控线C“|”印迹，检测线T为抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb2或抗猪瘟病毒多克隆抗体pAb1印迹，质控线C为抗小鼠IgG抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹。
所述试纸以单克隆抗体阻断模式检测猪瘟中和抗体，在检测膜显现两条红色条带“||”，且检测线T显色强度与空白对照相当，则为猪瘟抗体阴性；显现两条红色条带“||”，但检测线T明显弱于空白对照，则为猪瘟抗体弱阳性；只显现一条红色条带“|”，则为猪瘟抗体强阳性。
抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1具有病毒中和VN活性，特异识别E2蛋白中和抗原表位；单克隆抗体mAb2特异识别E2蛋白非中和抗原表位；猪瘟病毒检测抗原为猪瘟病毒抗原，E2重组蛋白或多肽抗原。
抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1和mAb2的制备方法为：
(1)猪瘟病毒免疫抗原的制备
以猪瘟病毒标准强毒株石门株接种猪肾细胞PK-15，48～60h收取病毒培养液，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，利用50kDa超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩，以Sepherose4 Fast Flow琼脂糖凝胶柱对猪瘟病毒进行凝胶过滤层析纯化，测定猪瘟病毒的半数细胞培养物感染量达10-7以上，荧光定量PCR测定纯化病毒拷贝数达1010以上；
(2)抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备
(2.1)杂交瘤细胞株的建立
将猪瘟病毒免疫抗原免疫小鼠，建立抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株；
(2.2)单克隆抗体的制备
(2.3)单克隆抗体的鉴定
(2.3.1)单克隆抗体的抗体效价
以酶联免疫吸附试验和免疫过氧化物酶单层细胞试验测定杂交瘤细胞培养上清和腹水的单抗效价，单抗上清和腹水的ELISA效价分别在1:400和1:105以上，IPMA效价分别在1:40和1:4000以上；
(2.3.2)识别病毒蛋白
以Western blot检测单克隆抗体识别猪瘟病毒病毒蛋白；
(2.3.3)单克隆抗体亚型鉴定
利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定猪瘟病毒单克隆抗体的免疫球蛋白亚型；
(2.3.4)病毒中和(VN)活性
以病毒中和试验测定单克隆抗体腹水对猪瘟病毒的中和活性，筛选获得具有病毒中和活性的单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb1，用于胶体金标记；
(2.3.5)单克隆抗体识别抗原表位分析
以叠加ELISA对CSFV单克隆抗体识别的抗原表位进行分析鉴定，以与单克隆抗体mAb1识别不同抗原表位的单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb2，用于检测线T印迹；
(2.4)单克隆抗体的纯化
以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。
猪瘟病毒抗原为经甲醛或β-丙内酯BPL灭活的猪瘟病毒培养物。
猪瘟病毒抗原的具体制备方法为：以猪瘟病毒疫苗毒株HCLV接种猪睾丸细胞ST，48-60h收取病毒培养液，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，利用50kDa超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩，以Sepherose 4 Fast Flow琼脂糖凝胶柱对猪瘟病毒进行凝胶过滤层析纯化，测定猪瘟病毒的半数细胞培养物感染量TCID50达10-7以上；分别在CSFV培养物中加入终浓度为0.1％～0.5％的甲醛溶液或0.02％～0.2％的β-丙内酯，充分混匀，分别置4℃灭活48h或37℃灭活9h，制备CSFV灭活病毒抗原。
重组抗原为利用大肠杆菌或转基因水稻表达纯化的E2重组蛋白。
重组抗原的具体制备方法为：
(1)大肠杆菌表达E2蛋白
根据CSFV兔化弱毒C株全基因序列合成经大肠杆菌密码子优化的E2基因，并亚克隆入大肠杆菌表达载体pET-32a构建重组表达质粒，将重组质粒pET32a-E2转化大肠杆菌RosettaTM(DE3)，以1mmol/L IPTG诱导表达E2重组蛋白，表达蛋白经8mol/L尿素变性溶解后经Ni-NTA亲和层析纯化和复性，获得纯度90％的E2表达蛋白，以E2抗原检测试纸测定其抗原活性，制备E2蛋白重组抗原；
(2)转基因水稻表达E2蛋白
根据CSFV流行毒株E2基因序列合成经水稻密码子优化的E2基因，并相继亚克隆入中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300，构建转基因水稻重组表达质粒，通过农杆菌介导水稻遗传转化，筛选获得E2转基因水稻纯合子株系，E2抗原检测试纸检测表明E2蛋白在水稻胚乳中高效表达；以镍亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析对转基因水稻表达蛋白进行纯化，获得纯度95％的E2表达蛋白，以E2抗原检测试纸测定其抗原活性，制备E2蛋白重组抗原。
多肽抗原为抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1和mAb2抗原表位多肽与载体蛋白偶联的人工抗原；具体制备方法为：利用多肽合成仪以固相多肽合成方法合成单克隆抗体mAb1和mAb2抗原表位多肽，在多肽N端均加入Cys，用于载体蛋白偶联；将mAb1和mAb2的抗原表位多肽按摩尔比4:1、2:1、1:1、1:2和1:4混合，利用异型双功能试剂SMCC将多肽与牛血清白蛋白、免疫球蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白按不同摩尔比进行偶联，获得不同多肽混合比的多肽偶联抗原，以Dot-Blot或猪瘟病毒抗原检测试纸测定E2偶联多肽抗原活性，并测定抗猪瘟病毒血清对胶体金标记抗体的阻断效率，获得最佳多肽配比和多肽/载体蛋白的偶联多肽抗原，制备E2蛋白多肽抗原。
抗原垫的制备方法为：将玻璃纤维棉切成条状，以含0.1mol/L NaCl、0.2％Tween20(v/v)和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH 7.2)溶液分别将猪瘟病毒抗原、E2重组蛋白和多肽抗原做系列稀释，并以15μL/cm将猪瘟病毒检测抗原喷点于玻璃棉，干燥；将抗原垫置于塑料袋，加干燥剂室温密闭保存备用；利用吸附不同检测抗原的抗原垫装配试纸，以不同浓度抗猪瘟病毒阳性血清测定试纸阻断效果，通过对不同抗原及其浓度的组合筛选，获得抗原垫的最佳工作浓度为：病毒抗原100μg/mL，重组蛋白200μg/mL，多肽抗原100μg/mL。
以CSFV灭活病毒或疫苗为免疫抗原，通过杂交瘤细胞技术生产鉴定抗猪瘟病毒单克隆抗体，利用免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)和病毒中和试验(VN)筛选猪瘟病毒的广谱中和单克隆抗体，以叠加酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选识别不同抗原表位的单克隆抗体，以合成多肽鉴定单克隆抗体识别的抗原表位。筛选鉴定的单克隆抗体mAb1具有病毒中和(VN)活性，特异识别E2蛋白中和抗原表位，用于胶体金标记；筛选鉴定的单克隆抗体mAb2特异识别E2蛋白非中和抗原表位，或以猪瘟灭活疫苗免疫的抗猪瘟病毒多克隆抗体pAb1，可用于检测线T印迹；以小鼠IgG为免疫抗原制备兔抗小鼠IgG多克隆抗体pAb2，pAb2或金黄色葡萄球菌SPA可用于质控线C印迹；以甲醛溶液或β-丙内脂灭活猪瘟病毒培养物制备的病毒抗原，大肠杆菌或转基因水稻表达纯化E2蛋白制备的重组抗原，单克隆抗体mAb1和mAb2抗原表位多肽与载体蛋白偶联制备的多肽抗原，可用于抗原垫。
本发明有益的积极效果：
猪瘟抗体阻断检测试纸实现了猪瘟病毒中和抗体的快速检测，可实现对猪瘟母源抗体和免疫抗体水平的实时监测，以及疫苗免疫效果的免疫评价，并且操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，如疫病监测、海关检疫、卫生防疫、集约化养殖到个体养殖等，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。检测试纸条具有下列各项优点：
(1)免疫保护评价。传统试纸以间接法检测抗体，即试纸以显示“||”为阳性，以显示“|”为阴性，只能检测总的抗体水平，无法检测中和抗体水平；猪瘟抗体阻断检测试纸基于广谱中和单克隆抗体阻断模式对猪瘟病毒中和抗体进行检测，即试纸以显示“|”为阳性，以显示“||”为阴性，可有效检测母源抗体或免疫抗体的中和抗体水平，替代经典ELISA方法，实现对母源抗体和疫苗免疫的免疫保护评价。
(2)特异性强，敏感性高。猪瘟抗体阻断检测试纸利用特异性检测抗原和广谱中和单克隆抗体以抗体阻断模式制备而成，单克隆抗体的特异性强和敏感性高，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无共价键形成，二者通过异性电荷间的范德华力相结合，胶体金对标记抗体的反应性影响很小，且具有较高的标记率。
(3)操作简便快速。使用抗体阻断检测试纸时无需任何其它试剂，待检样品加入试纸加样孔，5～10min即可判定检测结果，而常规ELISA不仅操作复杂，而且检测时间需1～2h，因此显著优于ELISA试验。
(4)显示检测结果形象、直观准确。抗体阻断检测试纸以单克降抗体阻断模式检测猪瘟中和抗体，以在检测膜上显示红色“||”和“|”条带作为中和抗体检测的阴性和阳性标记，即显现两条红色条带“||”，且检测线T显色强度与空白对照相当为猪瘟抗体阴性，表示被检测血清样品无猪瘟抗体；显现两条红色条带“||”，但检测线T明显弱于空白对照为猪瘟抗体弱阳性，表示被检血清样品含有低水平猪瘟中和抗体；只显现一条红色条带“|”为猪瘟抗体强阳性，表示被检血清样品含有高水平猪瘟中和抗体，结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阴性和假阳性误判。
(5)成本低，投资少。使用抗体阻断检测试纸，不需另配仪器设备及其它试剂，使现场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。
附图说明
图1为CSFV单克隆抗体的IPMA检测。
图2为CSFV单抗与E2重组蛋白的Western blot分析。
图3为猪瘟抗体阻断检测试纸的剖视结构示意图。
图4为猪瘟抗体阻断检测试纸卡的俯视结构示意图。
图中，1：支撑板，2：抗原垫，3：金标垫，4：检测膜，5：吸水垫，6：检测线T印迹，7：质控线C印迹，8：试纸卡，9：加样孔。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
猪瘟抗体阻断检测试纸可广泛应用于猪和野猪猪瘟中和抗体水平监测和免疫评价。制备猪瘟抗体阻断检测试纸，首先需制备猪瘟病毒免疫抗原，进而制备抗猪瘟病毒多克隆抗体和单克隆抗体，并筛选猪瘟病毒广谱中和单克隆抗体，鉴定单抗识别中和抗原表位，识别猪瘟病毒E2蛋白的中和单克隆抗体mAb1用于制备胶体金标记物，识别猪瘟病毒不同抗原表位的单克隆抗体mAb2或猪瘟病毒多克隆抗本pAb1用于印制检测线T印迹“|”，其次需制备兔抗小鼠IgG抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA，用于印制质控线C印迹“|”，最后需制备经灭活的猪瘟病毒抗原、E2蛋白重组抗原或表位多肽抗原，用于制备抗原垫。
(1)猪瘟病毒免疫抗原的制备
以猪瘟病毒标准强毒株石门株接种猪肾细胞(PK-15)，48～60h收取病毒培养液，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，利用50kDa超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩，以Sepherose4 Fast Flow琼脂糖凝胶柱对猪瘟病毒进行凝胶过滤层析纯化，测定猪瘟病毒的半数细胞培养物感染量(TCID50)达10-7以上，荧光定量PCR测定纯化病毒拷贝数达1010以上。
(2)抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备
(2.1)杂交瘤细胞株的建立
将猪瘟病毒免疫抗原与弗氏免疫佐剂等量混合，充分乳化，以50～100μg/只免疫Balb/c系小鼠3次，每次间隔15～30d；第3次加强免疫后3～4d，将免疫小鼠眼球放血，拉颈致死，于75％(v/v)酒精浸泡5～10min，无菌取其脾细胞；剪碎并经100目尼龙网过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞；将1×108个的脾细胞与2～5×107个的SP2/0骨髓瘤细胞混合，1000r/min离心10min，弃上清，在37℃的水浴中将0.7～1mL的40％-50％(w/v)PEG4000(pH8.5～pH 9.0)缓缓加入细胞，温育1min后，缓慢加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min离心10min，弃上清，将细胞重悬于HAT选择培养基中(1×105个/mL)，并加入96孔培养板(100～200μL/孔)，置37℃5％CO2培养箱中培养。培养7～10d后，取杂交瘤细胞培养上清以酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选阳性杂交瘤细胞。以猪瘟病毒标准强毒石门株感染猪肾细胞(PK-15)，经甲醇固定后，5％(w/v)脱脂奶37℃封闭1h；加待检细胞培养上清50μL/孔，设HAT培养基和小鼠免疫血清为阴性和阳性对照；加1:500辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠IgG抗体(50μL/孔)，37℃作用30min；每步反应后均用含0.05％Tween-20的PBS充分洗涤；以底物AEC室温显色10～20min，用水冲洗中止显色后，在显微镜下观察显色结果。选取强阳性、细胞生长旺盛的克隆孔，通过连续3次有限稀释克隆化，扩大培养后冻存细胞，建立抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株8株：21D11、9A6、3A9、19A8、10F1、13H8、15A10和11E12(图1)。
(2.2)单克隆抗体的制备
以体内诱生腹水制备单克隆抗体腹水。取经降殖烷或液体石蜡致敏的经产Balb/c小鼠，腹腔注射对数生长期的杂交瘤细胞107个/只，7～10d后抽取腹水，离心后取上清，分装，冻存。
(2.3)单克隆抗体的鉴定
(2.3.1)单克隆抗体的抗体效价
以酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)测定杂交瘤细胞培养上清和腹水的单抗效价，单抗上清和腹水的ELISA效价分别在1:400和1:105以上，IPMA效价分别在1:40和1:4000以上(表1)。
表1 CSFV单克隆抗体效价测定
(2.3.2)识别病毒蛋白
利用单克隆抗体以Western blot分别检测单克隆抗体识别猪瘟病毒病毒蛋白，结果显示8株单抗均特异识别E2蛋白(图2)，其中有9A6、15A10、11E12均与E2蛋白反应，且15A10、11E12的特异性较强。
(2.3.3)单克隆抗体亚型鉴定
利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒分别测定猪瘟病毒单克隆抗体的免疫球蛋白亚型，结果显示，19A8、10F1为IgG1，其余均为IgG2，其中11E12、9A6、3A9、13H8为IgG2a，15A10、21D11为IgG2b。
(2.3.4)病毒中和(VN)活性
以病毒中和(VN)试验测定8株单克隆抗体腹水对猪瘟病毒的中和活性，筛选获得具有病毒中和活性单克隆抗体9A6，中和效价为1:200，作为单克隆抗体mAb1，用于胶体金标记。
(2.3.5)单克隆抗体识别抗原表位分析
以叠加ELISA对CSFV单克隆抗体识别的抗原表位进行分析鉴定。首先利用包被抗原的酶标板以间接ELISA测定各单抗的工作浓度，绘制抗原饱和曲线。在叠加ELISA试验中，根据抗原饱和曲线适当稀释单抗，并配对加入酶标板各孔，37℃孵育1～2h；分别加入酶标二抗和TMB进行显色，读取各孔OD450值，按下列公式计算叠加系数(AI)：AI＝[2×OD1+2/(OD1+OD2)-1]×100％，其中OD1+2为配对单抗孔的OD450值，OD1和OD2为两个独立单抗孔的OD450值。两个单抗的AI值小于40％判为识别相同或相近抗原表位；AI值大于40％判为识别不同抗原表位。E2蛋白单克隆抗体叠加ELISA结果显示，9A6与11E12和15A10的AI值大于40％，识别E2蛋白不同抗原表位，用于胶体金标记；11E12和15A10的AI值小于40％，识别E2蛋白相同或相近抗原表位，作为单克隆抗体mAb2，用于检测线T印迹(表2)。
表2 CSFV E2单抗识别的差异表位筛选
(2.4)单克隆抗体的纯化
以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。取1mL小鼠腹水，加入2mL 0.06mol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.0)，以0.1mol/L HCl调至pH 4.5；于室温搅拌下逐滴加入33μL辛酸，4℃静置2h，15000r/min离心30min，弃沉淀；在离心上清中加入1/10体积0.01mol/L PBS(pH7.4)，以0.1mol/L NaOH调至pH 7.4；于冰浴条件下加入饱和硫酸铵至终浓度45％，4℃静置2h，10000r/min离心30min，弃上清；以适量PBS重悬沉淀，对PBS透析过夜，换液3次。以分光光度计法或考马斯亮蓝染色法(Bradford法)测定纯化单克隆抗体IgG的蛋白含量在1mg/mL以上，以免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)测定小鼠腹水和纯化IgG的抗体效价在1:1000以上，分装，冻存。
(3)抗猪瘟病毒多克隆抗体的制备
以50～100μg/kg体重的猪瘟弱毒疫苗经肌肉注射免疫健康仔猪3～4次，末次免疫10天后，静脉采血，以IPMA测定其血清抗体效价在1:1000以上时，心脏采血或颈动脉放血，收集高免血清，以无水硫酸钠(Na2SO4)提取免疫猪血清IgG，取1体积免疫血清加2体积0.01mol/LPBS(pH7.2)混合，加入无水Na2SO4至终浓度18％，37℃水浴30min，4000r/min离心20min，弃上清，以适量PBS(pH7.2)重悬沉淀，加终浓度16％的Na2SO4，37℃沉淀30min，4000r/min离心20min，弃上清，再以适量PBS(pH7.2)重悬沉淀，以终浓度14％的Na2SO4沉淀，4000r/min离心20min，弃上清，以适量PBS(pH7.2)重悬沉淀，对PBS(pH7.2)过夜透析，换液2～3次，测定抗体效价和蛋白浓度(10～20mg/mL)，所制备抗猪瘟病毒多克隆抗体pAb1可用于检测线T印迹。
(4)兔抗小鼠IgG多克隆抗体的制备
以纯化小鼠IgG免疫2.0kg左右健康新西兰兔，首次免疫以弗氏完全佐剂乳化抗原，皮下多点注射50μg/只，共免疫3次，每次加强免疫间隔3周，以弗氏不完全佐剂乳化抗原肌肉注射，最后一次加强免疫2周后，以琼脂扩散试验(AGP)测定免疫血清抗体效价高于1:40时，采集高免兔全血，分离血清，以辛酸-硫酸铵法纯化兔抗小鼠IgG，方法同(2.4)单抗纯化，辛酸用量为45μL/mL血清，测定抗体效价和蛋白浓度(10～20mg/mL)，所制备兔抗小鼠IgG多克隆抗体pAb2可用于质控线C印迹。
(5)检测抗原的制备
(5.1)病毒抗原
以猪瘟病毒疫苗毒株HCLV接种猪睾丸细胞(ST)，48～60h收取病毒培养液，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，利用50kDa超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩，以Sepherose 4 Fast Flow琼脂糖凝胶柱对猪瘟病毒进行凝胶过滤层析纯化，测定猪瘟病毒的半数细胞培养物感染量(TCID50)达10-7以上。分别在CSFV培养物中加入终浓度为0.1％～0.5％的甲醛溶液或0.02％～0.2％的β-丙内酯(BPL)，充分混匀，分别置4℃灭活48h或37℃灭活9h，取灭活病毒接种ST细胞检测病毒是否完全灭活。通过病毒灭活试验检测，确定以终浓度0.1％甲醛溶液4℃灭活48h或0.02％β-丙内酯(BPL)37℃灭活9h可完全灭活病毒，以CSFV抗原检测试纸测定其抗原活性，制备CSFV灭活病毒抗原。
(5.2)重组抗原
(5.2.1)大肠杆菌表达E2蛋白
根据CSFV兔化弱毒C株全基因序列(GenBank:Z46258.1)合成经大肠杆菌密码子优化的E2基因，并亚克隆入大肠杆菌表达载体pET-32a构建重组表达质粒，将重组质粒pET32a-E2转化大肠杆菌RosettaTM(DE3)，以1mmol/L IPTG诱导表达E2重组蛋白，表达蛋白经8mol/L尿素变性溶解后经Ni-NTA亲和层析纯化和复性，获得纯度90％的E2表达蛋白，以E2抗原检测试纸测定其抗原活性，制备E2蛋白重组抗原。
(5.2.2)转基因水稻表达E2蛋白
根据CSFV流行毒株E2基因序列合成经水稻密码子优化的E2基因，并相继亚克隆入中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300，构建转基因水稻重组表达质粒，通过农杆菌介导水稻遗传转化，筛选获得E2转基因水稻纯合子株系，E2抗原检测试纸检测表明E2蛋白在水稻胚乳中高效表达。以镍亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等对转基因水稻表达蛋白进行纯化，获得纯度95％的E2表达蛋白，以E2抗原检测试纸测定其抗原活性，制备E2蛋白重组抗原。
(5.3)多肽抗原
利用多肽合成仪以固相多肽合成方法合成单克隆抗体mAb1和mAb2抗原表位多肽，在多肽N端均加入Cys，用于载体蛋白偶联。将mAb1和mAb2的抗原表位多肽按摩尔比4:1、2:1、1:1、1:2和1:4等不同比例混合，利用异型双功能试剂SMCC将多肽与牛血清白蛋白(BSA)，猪、牛、羊、兔等免疫球蛋白(IgG)、卵清白蛋白(OVA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)等载体蛋白按不同摩尔比(10:1、5:1、2:1)进行偶联，获得不同多肽混合比的多肽偶联抗原，以Dot-Blot或猪瘟病毒抗原检测试纸测定E2偶联多肽抗原活性，并测定抗猪瘟病毒血清对胶体金标记抗体的阻断效率，获得最佳多肽配比(1:2)和多肽/载体蛋白(5:1)的偶联多肽抗原，制备E2蛋白多肽抗原。
(6)单克隆抗体的胶体金标记
(6.1)胶体金的制备
取100mL超纯水置于500mL洁净的锥形瓶，加入1mL 1％(w/v)氯金酸煮沸；在搅拌状态下迅速加入新鲜配制的1mL 1％(w/v)柠檬酸钠溶液，煮沸约3min至溶液颜色由黄色变为紫红色，继续煮沸2min；待溶液冷却至室温，补超纯水至100mL，以0.2mol/L K2CO3调pH至9.0，4℃避光可保存数月。
(6.2)最适标记蛋白浓度测定
取待标记抗猪瘟病毒单抗IgG对20mmol/L硼酸钠溶液(pH 8.0)4℃过夜透析。在微孔板中以25μL超纯水1:2、1:4、1:8……倍比稀释待标记猪瘟病毒单抗；各孔加入125μL胶体金溶液，室温静置5min；加入125μL 1mol/L NaCl溶液；各孔颜色随蛋白浓度的降低而由红色变为蓝色。以颜色未变蓝的单抗最高稀释度的蛋白浓度为胶体金最适标记浓度，胶体金标记时，蛋白浓度增加20％。
(6.3)单克隆抗体的胶体金标记
取2mL最适蛋白浓度的待标记单抗IgG，加入10mL胶体金溶液(pH 9.0)，迅速混匀，室温作用10～15min；加入1/10体积含10％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)的20mmol/L硼酸钠溶液，迅速混匀，室温作用10～15min；4℃15000r/min离心30min，小心移去上清；以含1％(w/v)BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬胶体金，同上离心，弃上清；重复洗涤1次，以1mL含1％(w/v)BSA的20mmol/L硼酸钠溶液重悬胶体金，4℃保存备用。
(7)抗原垫的制备
将玻璃纤维棉(Millipore C048)按规格切成15mm×300mm的条状，以含0.1mol/LNaCl、0.2％Tween 20(v/v)和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH 7.2)溶液分别将猪瘟病毒抗原、E2重组蛋白和多肽抗原做系列稀释，利用Airjet Quanti 3000以15μL/cm将猪瘟病毒检测抗原喷点于玻璃棉，置于50℃干燥箱干燥30min；将抗原垫置于塑料袋，加干燥剂室温密闭保存备用。利用吸附不同检测抗原(病毒抗原、重组蛋白和多肽抗原)的抗原垫装配试纸，以不同浓度抗猪瘟病毒阳性血清测定试纸阻断效果，通过对不同抗原及其浓度的组合筛选，获得抗原垫的最佳工作浓度为：病毒抗原100μg/mL，重组蛋白200μg/mL，多肽抗原100μg/mL。
(8)金标垫的制备
将玻璃棉切成1.5cm×30cm的长条，置于XYZ 3000喷点仪平台上，并以压条固定；取1mL胶体金标记物加入2mL含2％(w/v)BSA、3％(w/v)蔗糖、0.6mol/L NaCl、0.2％(v/v)Tween 20和0.1％(w/v)叠氮钠的20mmol/L硼酸钠溶液(pH 8.0)；利用Airjet Quanti 3000以15μL/cm将抗胶体金标记物溶液喷点于玻璃棉；置于50℃干燥箱干燥30min；将胶金垫置塑料袋，加干燥剂4℃密闭保存备用。
(9)检测膜的制备
将2.0cm×30cm的Millipore SHF1800420硝酸纤维素膜(NC)置于XYZ 3000喷点仪平台上，并以压条固定；用PBS(pH 7.2)将特异识别猪瘟病毒的单克隆抗体mAb2或多克隆抗体pAb1和兔抗鼠IgG或SPA稀释至1mg/mL，并分别放于贮存池；利用Biojet Quanti 3000以1μL/cm分别将单克隆抗体mAb2或多克隆抗体pAb1和兔抗小鼠IgG或SPA喷点于检测膜中央，形成检测线T和质控线C印迹，检测线与质控线相距0.5cm；置于42℃干燥箱30min或室温自然干燥；将检测膜置塑料袋，加干燥剂4℃密闭保存备用。
(10)吸水垫的制备
将吸水滤纸切成18mm×300mm条状，制备吸水垫，室温保存备用。
(11)支撑板的制备
将双面胶贴于PVC支撑板，切成7.5cm×30cm的长板，制备支撑板。
(12)试纸的组装
分别将检测膜、金标垫、抗原垫和吸水垫依次粘贴于支撑板上，组装成检测试纸：将硝酸纤维素检测膜平贴于75mm×300mm支撑板的中央，两端边距各为21mm；将8mm×300mm的金标垫平贴于检测膜检测线的下方，重叠检测膜2mm，然后均匀平压；将15mm×300mm的抗原垫平贴于胶体金抗原棉的下方，重叠胶体金抗原棉下端2mm；将18mm×300mm吸水滤纸平放于检测膜质控线的一端，重叠检测膜上端2mm。
(13)切割和包装
将组装好的半成品放入CM4000切割机中进行切割，规格为2.8mm×60mm，显色区应平整无压痕，有两条隐形线，分别是检测线(T线)、质控线(C线)，靠近样品端的为T线，靠近手柄端的为C线。切割好的试纸被装入预先制备好的试纸卡中，并用压壳机封好。制成的试纸卡用铝箔袋包装好，封口机封口后打上日期和批次，室温保存备用。
(14)猪瘟抗体阻断检测试纸的实施结构
参见图3～4，1为支撑板用不吸水薄片条，实施中可采用塑胶薄片条或采用不吸水的硬质纸片材，反应试剂载体吸附层由抗原垫2、金标垫3、检测膜4和吸水垫5组合而成，依次粘贴在支撑板1上；其中抗原垫为吸附检测抗原的玻璃纤维棉，检测抗原可用灭活的猪瘟病毒、E2重组蛋白或抗原表位多肽，金标垫为吸附胶体金标记的猪瘟病毒中和单克隆抗体mAb1的金标玻璃纤维棉，可采用精制玻璃纤维棉，检测膜实施中可采用硝酸纤维素膜，手柄端的吸水垫采用吸水纸，如滤纸或其它吸水纸均可，试纸条总长8cm，宽度0.4cm，检测线T印迹6为用特异识别猪瘟病毒不同抗原表位的单克隆抗体mAb2或猪瘟病毒多克隆抗体pAb1在硝酸纤维素膜上印制的检测线印迹“|”，质控线C印迹7为兔抗小鼠IgG多克隆抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA在硝酸纤维素膜上印制的质控线印迹“|”，在检测膜上的检测线印迹和质控线印迹组合排列为“||”，8为试纸卡，在试纸样品端有加样孔9。
(15)猪瘟抗体阻断检测试纸实施检测反应原理
当待检样品加入猪瘟抗体阻断检测试纸加样孔后，待检溶液溶解抗原垫中的检测抗原，并通过虹吸带动待检抗体、检测抗原及金标抗体mAb1一起向硝酸纤维素膜扩散，并最终渗透到滤纸层中。当待检样品中不含有猪瘟抗体时，溶液中的检测抗原在扩散过程中与金标抗体mAb1结合，金标抗体-抗原复合物在检测膜上被检测印迹中的mAb2拦截，形成红色检测线T标记“|”，多余的金标抗体不能与检测印迹结合而继续扩散，在检测膜上被质控印迹中的pAb2或SPA，生成红棕色标记“|”，两种标记组合叠加，形成两条红色阴性标记“||”，且检测线T显色强度与空白对照相当，表示样品中不含有猪瘟抗体；当待检样品中含有猪瘟抗体时，样品中的猪瘟中和抗体先与检测抗原结合，封闭检测抗原与金标抗体mAb1的结合位点，抑制或完全阻断金标抗体-抗原复合物的形成，导致检测膜上的检测印迹mAb2不能有效拦截金标复合物而使检测线T显色减弱，表示样品中含有猪瘟中和抗体，中和抗体水平越高，检测线T越弱直至完全消失，试纸形成检测线T明显弱于空白对照的红色标记“||”为弱阳性，只显示一条质控线C红色标记“|”为强阳性。如果检测膜上没有红棕色标记显示，则表明试纸条已失效。
(16)猪瘟抗体阻断检测试纸检测实例操作方法
(16.1)检测血清样品的制备
采集待检血清，取100μL血清样品加入300μL PBS或生理盐水进行1:2、1:4、1:8……倍比稀释后进行检测。
(16.2)试纸检测
取1:2稀释的待检血清样品100μL，滴入试纸的加样孔(S)中，静置5～10min观察结果。
(16.3)检测结果判定
试纸显现两条红色条带(检测线和质控线)“||”，且检测线T显色强度与空白对照相当，为猪瘟抗体阴性，表示待检样品中不含有猪瘟抗体；显现两条红色条带“||”，但检测线T明显弱于空白对照，为猪瘟抗体弱阳性，表示待检样品中含有低水平猪瘟中和抗体；只显现一条红色条带(质控线)“|”为猪瘟抗体强阳性，表示待检样品中含有高水平猪瘟中和抗体；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。
(17)猪瘟抗体阻断检测试纸性能评价
(17.1)敏感性
用PBS或生理盐水1:2、1:4、1:8……倍比稀释不同亚型猪瘟病毒标准阳性血清，以猪瘟抗体阻断检测试纸和阻断ELISA试剂盒进行平行检测，并以TSR3000读条仪测定试纸检测线吸光值(ROD)，计算试纸检测CSFV抗体的半数抑制效价，评价猪瘟抗体阻断检测试纸的敏感性，结果显示试纸对猪瘟抗体半数抑制(弱阳性)的敏感性与阻断ELISA相当。
(17.2)特异性
用PBS或生理盐水1:2稀释猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒(FMDV)和猪圆环病毒2型(PCV2)等标准阳性血清，以猪瘟抗体阻断检测试纸进行平行检测，发现对应猪瘟病毒阳性血清完全阻断检测线T显色，为强阳性，其他相关病毒阳性血清检测线T显色无明显变化，为阴性，表明猪瘟抗体阻断检测试纸特异性强，与猪相关疫病抗体无交叉反应。
实施例一，猪瘟母源抗体水平监测，采集动物血清，取100μL血清样品加入300μLPBS或生理盐水进行稀释，制备待检血清溶液，以猪瘟抗体阻断检测试纸按(16)操作方法进行检测和结果判定，检测猪瘟母源抗体水平。试纸显现两条红色条带(检测线和质控线)“||”，且检测线T显色强度与空白对照相当，为猪瘟抗体阴性，表示待检血清样品中不含有猪瘟母源抗体；显现两条红色条带“||”，但检测线T明显弱于空白对照，为猪瘟抗体弱阳性，表示待检血清样品中含有低水平猪瘟母源抗体；只显现一条红色条带(质控线)“|”为猪瘟抗体强阳性，表示待检血清样品中含有高水平猪瘟母源抗体；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。猪瘟抗体阻断检测试纸对动物血清猪瘟中和抗体的检测可实现对动物母源抗体水平的实时监测，试纸强阳性表示血清含有高水平中和抗体，而弱阳性和阴性表示血清含有低水平或不含中和抗体，不能为动物提供完全保护，同时对猪瘟弱毒疫苗影响较小，为猪瘟疫苗首免日龄提供技术指导。
实施例二，猪瘟疫苗免疫效果评价，猪瘟灭活疫苗免疫后2～3周，采集免疫动物血清，取100μL血清样品加入300μL PBS或生理盐水进行稀释或1:2、1:4、1:8……倍比稀释，制备待检血清溶液，以猪瘟抗体阻断检测试纸按(16)操作方法进行检测和结果判定，检测猪瘟免疫抗体水平。试纸显现两条红色条带(检测线和质控线)“||”，且检测线T显色强度与空白对照相当，为猪瘟抗体阴性，表示待检血清样品中不含有猪瘟中和抗体；显现两条红色条带“||”，但检测线T明显弱于空白对照，为猪瘟抗体弱阳性，表示待检血清样品中含有低水平猪瘟中和抗体；只显现一条红色条带(质控线)“|”为猪瘟抗体强阳性，表示待检血清样品中含有高水平猪瘟中和抗体；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。猪瘟抗体阻断检测试纸对免疫动物血清猪瘟中和抗体的检测可实现对猪瘟疫苗(弱毒疫苗和灭活疫苗)免疫中和抗体水平的实时监测，试纸强阳性表示血清含有高水平中和抗体，而弱阳性和阴性表示血清含有低水平或不含中和抗体，不能为动物提供完全保护，实现对免疫猪瘟疫苗免疫效果的快速评价，为猪瘟疫苗免疫程序制定和调整提供技术指导。
实施例三，猪瘟抗体水平监测，在猪瘟疫苗免疫后的不同时间段，分别采集免疫动物血清，取100μL血清样品以PBS或生理盐水进行1:2、1:4、1:8……倍比稀释，制备待检血清溶液，以猪瘟抗体阻断检测试纸按(16)操作方法进行检测和结果判定，检测猪群猪瘟免疫抗体水平动态变化。试纸显现两条红色条带(检测线和质控线)“||”，且检测线T显色强度与空白对照相当，为猪瘟抗体阴性，表示待检血清样品中不含有猪瘟中和抗体；显现两条红色条带“||”，但检测线T明显弱于空白对照，为猪瘟抗体弱阳性，表示待检血清样品中含有低水平猪瘟中和抗体；只显现一条红色条带(质控线)“|”为猪瘟抗体强阳性，表示待检血清样品中含有高水平猪瘟中和抗体；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。猪瘟抗体阻断检测试纸对免疫动物血清猪瘟中和抗体的检测可实现对猪瘟疫苗(弱毒疫苗和灭活疫苗)免疫中和抗体水平变化的实时监测，试纸强阳性表示血清含有高水平中和抗体，而弱阳性和阴性表示血清含有低水平或不含中和抗体，不能为动物提供完全保护，需要及时进行猪瘟疫苗免疫，为猪瘟疫苗免疫程序制定和调整提供技术指导。
实施例四，野猪猪瘟病毒感染抗体监测，按一定比例采集野猪血清，取100μL血清样品以PBS或生理盐水进行1:2、1:4、1:8……倍比稀释，制备待检血清溶液，以猪瘟抗体阻断检测试纸按(16)操作方法进行检测和结果判定，检测野猪猪瘟抗体及其抗体效价。试纸显现两条红色条带(检测线和质控线)“||”，且检测线T显色强度与空白对照相当，为猪瘟抗体阴性，表示待检血清样品中不含有猪瘟抗体；显现两条红色条带“||”，但检测线T明显弱于空白对照，为猪瘟抗体弱阳性，表示待检血清样品中含有低水平猪瘟抗体；只显现一条红色条带(质控线)“|”为猪瘟抗体强阳性，表示待检血清样品中含有高水平猪瘟抗体；试纸未显现任何条带表明检测操作不当或试纸失效，需另取检测试纸重新检测。利用猪瘟抗体阻断检测试纸检测野生动物血清抗体，且抗体水平参差不齐，离散度较大，则表明动物可能存在猪瘟野毒感染，可结合流行病学、临床症状和病理变化做出诊断，为野生猪瘟疫病诊断提供参考。利用猪瘟抗体阻断检测试纸检测野生动物血清抗体时，由于野生动物未进行疫苗免疫，血清抗体阳性(弱阳性和强阳性)表示野生动物存在猪瘟病毒感染或曾感染猪瘟病毒，为野生猪瘟病毒流行病学调查和监测提供技术支撑。

Claims (10)

1.一种猪瘟抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，其特征在于，抗原垫吸附猪瘟病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“|”和质控线C“|”印迹，检测线T为抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb2或抗猪瘟病毒多克隆抗体pAb1印迹，质控线C为抗小鼠IgG抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹。
2.根据权利要求1所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，所述试纸以单克隆抗体阻断模式检测猪瘟中和抗体，在检测膜显现两条红色条带“||”，且检测线T显色强度与空白对照相当，则为猪瘟抗体阴性；显现两条红色条带“||”，但检测线T明显弱于空白对照，则为猪瘟抗体弱阳性；只显现一条红色条带“|”，则为猪瘟抗体强阳性。
3.根据权利要求1所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1具有病毒中和VN活性，特异识别E2蛋白中和抗原表位；单克隆抗体mAb2特异识别E2蛋白非中和抗原表位；猪瘟病毒检测抗原为猪瘟病毒抗原，E2重组蛋白或多肽抗原。
4.根据权利要求3所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1和mAb2的制备方法为：
(1)猪瘟病毒免疫抗原的制备
以猪瘟病毒标准强毒株石门株接种猪肾细胞PK-15，48～60h收取病毒培养液，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，利用50kDa超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩，以Sepherose 4 Fast Flow琼脂糖凝胶柱对猪瘟病毒进行凝胶过滤层析纯化，测定猪瘟病毒的半数细胞培养物感染量达10-7以上，荧光定量PCR测定纯化病毒拷贝数达1010以上；
(2)抗猪瘟病毒单克隆抗体的制备
(2.1)杂交瘤细胞株的建立
将猪瘟病毒免疫抗原免疫小鼠，建立抗猪瘟病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株；
(2.2)单克隆抗体的制备
(2.3)单克隆抗体的鉴定
(2.3.1)单克隆抗体的抗体效价
以酶联免疫吸附试验和免疫过氧化物酶单层细胞试验测定杂交瘤细胞培养上清和腹水的单抗效价，单抗上清和腹水的ELISA效价分别在1:400和1:105以上，IPMA效价分别在1:40和1:4000以上；
(2.3.2)识别病毒蛋白
以Western blot检测单克隆抗体识别猪瘟病毒病毒蛋白；
(2.3.3)单克隆抗体亚型鉴定
利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定猪瘟病毒单克隆抗体的免疫球蛋白亚型；
(2.3.4)病毒中和(VN)活性
以病毒中和试验测定单克隆抗体腹水对猪瘟病毒的中和活性，筛选获得具有病毒中和活性的单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb1，用于胶体金标记；
(2.3.5)单克隆抗体识别抗原表位分析
以叠加ELISA对CSFV单克隆抗体识别的抗原表位进行分析鉴定，以与单克隆抗体mAb1识别不同抗原表位的单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb2，用于检测线T印迹；
(2.4)单克隆抗体的纯化
以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。
5.根据权利要求3所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，猪瘟病毒抗原为经甲醛或β-丙内酯BPL灭活的猪瘟病毒培养物。
6.根据权利要求5所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，猪瘟病毒抗原的具体制备方法为：以猪瘟病毒疫苗毒株HCLV接种猪睾丸细胞ST，48-60h收取病毒培养液，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，利用50kDa超滤膜对病毒培养液进行超滤浓缩，以Sepherose 4 Fast Flow琼脂糖凝胶柱对猪瘟病毒进行凝胶过滤层析纯化，测定猪瘟病毒的半数细胞培养物感染量TCID50达10-7以上；分别在CSFV培养物中加入终浓度为0.1％～0.5％的甲醛溶液或0.02％～0.2％的β-丙内酯，充分混匀，分别置4℃灭活48h或37℃灭活9h，制备CSFV灭活病毒抗原。
7.根据权利要求3所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，重组抗原为利用大肠杆菌或转基因水稻表达纯化的E2重组蛋白。
8.根据权利要求7所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，重组抗原的具体制备方法为：
(1)大肠杆菌表达E2蛋白
根据CSFV兔化弱毒C株全基因序列合成经大肠杆菌密码子优化的E2基因，并亚克隆入大肠杆菌表达载体pET-32a构建重组表达质粒，将重组质粒pET32a-E2转化大肠杆菌RosettaTM(DE3)，以1mmol/L IPTG诱导表达E2重组蛋白，表达蛋白经8mol/L尿素变性溶解后经Ni-NTA亲和层析纯化和复性，获得纯度90％的E2表达蛋白，以E2抗原检测试纸测定其抗原活性，制备E2蛋白重组抗原；
(2)转基因水稻表达E2蛋白
根据CSFV流行毒株E2基因序列合成经水稻密码子优化的E2基因，并相继亚克隆入中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300，构建转基因水稻重组表达质粒，通过农杆菌介导水稻遗传转化，筛选获得E2转基因水稻纯合子株系，E2抗原检测试纸检测表明E2蛋白在水稻胚乳中高效表达；以镍亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析对转基因水稻表达蛋白进行纯化，获得纯度95％的E2表达蛋白，以E2抗原检测试纸测定其抗原活性，制备E2蛋白重组抗原。
9.根据权利要求3所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，多肽抗原为抗猪瘟病毒单克隆抗体mAb1和mAb2抗原表位多肽与载体蛋白偶联的人工抗原；具体制备方法为：利用多肽合成仪以固相多肽合成方法合成单克隆抗体mAb1和mAb2抗原表位多肽，在多肽N端均加入Cys，用于载体蛋白偶联；将mAb1和mAb2的抗原表位多肽按摩尔比4:1、2:1、1:1、1:2和1:4混合，利用异型双功能试剂SMCC将多肽与牛血清白蛋白、免疫球蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白按不同摩尔比进行偶联，获得不同多肽混合比的多肽偶联抗原，以Dot-Blot或猪瘟病毒抗原检测试纸测定E2偶联多肽抗原活性，并测定抗猪瘟病毒血清对胶体金标记抗体的阻断效率，获得最佳多肽配比和多肽/载体蛋白的偶联多肽抗原，制备E2蛋白多肽抗原。
10.根据权利要求1所述的猪瘟抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗原垫的制备方法为：将玻璃纤维棉切成条状，以含0.1mol/L NaCl、0.2％Tween20(v/v)和0.1％(w/v)叠氮钠的PBS(pH7.2)溶液分别将猪瘟病毒抗原、E2重组蛋白和多肽抗原做系列稀释，并以15μL/cm将猪瘟病毒检测抗原喷点于玻璃棉，干燥；将抗原垫置于塑料袋，加干燥剂室温密闭保存备用；利用吸附不同检测抗原的抗原垫装配试纸，以不同浓度抗猪瘟病毒阳性血清测定试纸阻断效果，通过对不同抗原及其浓度的组合筛选，获得抗原垫的最佳工作浓度为：病毒抗原100μg/mL，重组蛋白200μg/mL，多肽抗原100μg/mL。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112322591A (zh) * 2020-10-28 2021-02-05 兆丰华生物科技(南京)有限公司 一种猪瘟抗体检测试剂盒及制备方法
CN113030467A (zh) * 2021-03-13 2021-06-25 河南省农业科学院 一种自放大精准控制的间接竞争免疫层析试纸条及应用
CN113063938A (zh) * 2021-03-13 2021-07-02 河南省农业科学院 一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条及检测方法
CN113063935A (zh) * 2021-03-13 2021-07-02 河南省农业科学院 一体化自放大的间接竞争免疫层析试纸及检测方法
CN116064649A (zh) * 2022-11-24 2023-05-05 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种在本氏烟草中表达猪瘟病毒e2蛋白的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102015765A (zh) * 2008-02-05 2011-04-13 淡马锡生命科学研究院有限公司 用于h5亚型流感病毒通用检测的结合蛋白和表位阻断elisa
CN103360468A (zh) * 2013-07-31 2013-10-23 扬州大学 一种scd1多肽及抗鹅scd1多肽多克隆抗体的制备方法
CN103592436A (zh) * 2012-08-15 2014-02-19 华中农业大学 一种甲型h1亚型流感病毒抗体阻断elisa试剂盒及应用
CN104407137A (zh) * 2014-12-12 2015-03-11 河南省农业科学院 一种猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸
CN206378499U (zh) * 2017-01-10 2017-08-04 深圳芬德生物技术有限公司 一种禽流感抗体多滴度定量检测盒

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102015765A (zh) * 2008-02-05 2011-04-13 淡马锡生命科学研究院有限公司 用于h5亚型流感病毒通用检测的结合蛋白和表位阻断elisa
CN103592436A (zh) * 2012-08-15 2014-02-19 华中农业大学 一种甲型h1亚型流感病毒抗体阻断elisa试剂盒及应用
CN103360468A (zh) * 2013-07-31 2013-10-23 扬州大学 一种scd1多肽及抗鹅scd1多肽多克隆抗体的制备方法
CN104407137A (zh) * 2014-12-12 2015-03-11 河南省农业科学院 一种猪瘟病毒强毒株和弱毒株鉴别检测试纸
CN206378499U (zh) * 2017-01-10 2017-08-04 深圳芬德生物技术有限公司 一种禽流感抗体多滴度定量检测盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
尹梅: "猪瘟病毒抗体胶体金免疫层析快速检测试纸条的研制及初步应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *
祁喜涛 等: "猪瘟病毒表面抗原E2基因植物表达载体的构建", 《生物技术》 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112322591A (zh) * 2020-10-28 2021-02-05 兆丰华生物科技(南京)有限公司 一种猪瘟抗体检测试剂盒及制备方法
CN113030467A (zh) * 2021-03-13 2021-06-25 河南省农业科学院 一种自放大精准控制的间接竞争免疫层析试纸条及应用
CN113063938A (zh) * 2021-03-13 2021-07-02 河南省农业科学院 一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条及检测方法
CN113063935A (zh) * 2021-03-13 2021-07-02 河南省农业科学院 一体化自放大的间接竞争免疫层析试纸及检测方法
CN113063938B (zh) * 2021-03-13 2023-09-12 河南省农业科学院 一种高灵敏梯度半定量免疫层析检测试纸条及检测方法
CN113030467B (zh) * 2021-03-13 2024-02-02 河南省农业科学院 一种自放大精准控制的间接竞争免疫层析试纸条及应用
CN113063935B (zh) * 2021-03-13 2024-03-08 河南省农业科学院 一体化自放大的间接竞争免疫层析试纸及检测方法
CN116064649A (zh) * 2022-11-24 2023-05-05 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种在本氏烟草中表达猪瘟病毒e2蛋白的方法
CN116064649B (zh) * 2022-11-24 2023-11-21 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种在本氏烟草中表达猪瘟病毒e2蛋白的方法

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