CN113063935B - 一体化自放大的间接竞争免疫层析试纸及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种一体化“自放大”的间接竞争免疫层析检测试纸，试纸包括支撑层、固定在支撑层上的吸附层和保护层；吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫一、结合垫二、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层；纤维素膜层上依次设置有检测线和质控线；结合垫一吸附有靶标物单克隆抗体，结合垫二吸附有纳米材料标记的人工抗原及纳米材料标记的生物素。该试纸抗体无需标记，加保护液干燥于结合垫一，避免了标记抗体过程中抗体的折叠及损伤，且可以精确的控制抗体用量；以纳米颗粒标记人工抗原作为探针，检测线上拦截的每个抗体都能精准结合两个标记抗原，实现了信号自放大，使免疫层析试纸的灵敏度更高。
Description
技术领域
本发明涉及一种免疫层析检测方法，具体涉及一种用于半抗原检测的一体化“自放大”的间接竞争免疫层析试纸及检测方法。
背景技术
免疫层析技术是近些年发展起来的一种快速免疫检测技术，它的基本原理是抗体和抗原之间的相互作用，以硝酸纤维素膜为载体，标记抗原或抗体作为示踪剂的一种层析检测技术。与传统的免疫分析方法相比，免疫层析技术具有特异性强、检测结果准确、设备操作简单、测量快速、成本低、不需要熟练的技术人员或昂贵的设备等优点，完全符合即时检测要求。目前，免疫层析技术已经被广泛应用在医药、畜牧业、农业及食品安全等领域。
在食品安全领域，基于竞争原理的小分子抗原免疫层析技术应用最为广泛，然而现有检测模式常会遇到抗原及抗体等免疫试剂可以成功建立ELISA检测方法，但不能成功建立免疫层析试纸；而且在很多应用中试纸灵敏度仍然需要改进。究其原因主要有以下三个方面：1、抗体在标记过程中出现了折叠，且为了稳定标记材料加入了过量抗体；2、人工抗原拦截抗体效率低，为了提高显色必须加入过量的标记抗体提高显色；3、胶体金标记抗体时无信号放大作用，量子点等荧光材料实现信号放大的同时则需要检测仪器判定结果，让检测复杂化。现有的小分子免疫层析检测模式无法解决这一问题，因此迫切需要一种简便、灵敏的试纸检测模式，为免疫层析试纸的研发提供更好的工具。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种用于半抗原检测的一体化“自放大”间接竞争免疫层析试纸及检测方法。本发明以生物素-亲和素为例制备质控线；用抗体保护液稀释单克隆抗体并喷涂于结合垫一上，以胶体金等标记材料标记人工抗原及生物素混合后喷涂于结合垫二上；硝酸纤维素膜上检测线固定二抗或SPA，质控线固定亲和素。该检测试纸与传统试纸相比可以精确的控制抗体用量，并基于一个单抗拦截2个标记抗原，从而实现信号放大，使免疫层析试纸的灵敏度更高。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种一体化“自放大”的间接竞争免疫层析检测试纸，试纸包括支撑层、固定在支撑层上的吸附层和保护层；所述吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫一、结合垫二、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层；所述保护层固定在样品垫、结合垫一、结合垫二及吸水材料层上；纤维素膜层上依次设置有检测线和质控线；所述结合垫一吸附有靶标物单克隆抗体，结合垫二吸附有纳米材料标记的人工抗原及纳米材料标记的生物素。
所述纳米材料标记的人工抗原为胶体金、量子点或硅球纳米材料标记的靶标物人工抗原。
所述人工抗原由小分子半抗原与载体蛋白偶联制备而成；偶联人工抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
所述样品垫、结合垫一及结合垫二用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成；支撑层用不吸水的韧性材料制成；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；
所述检测线和质控线为平行排列的“‖”直线式印迹，或为“十十”字型排列印迹，或为“┬┬”字型排列印迹，或为“┴┴”字型排列印迹，或为“├├”字型排列印迹，或为“┤┤”字型排列印迹。
所述检测线喷涂有羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或SPA；所述质控线喷涂有亲和素。
结合垫一吸附的为2,4-D单克隆抗体，结合垫二吸附的为胶体金标记的2,4-D人工抗原及胶体金标记的生物素。
结合垫一的制备方法为：用金标蛋白重悬液将2,4-D单克隆抗体稀释为20μg/mL，用喷涂仪将2,4-D单克隆抗体溶液喷涂于玻璃纤维棉上，4℃低温真空干燥，制备出结合垫一；所述金标蛋白重悬液为20mmol/L硼酸缓冲液，含1％(w/v)的BSA、3％(w/v)海藻糖和0.03％ (w/v)叠氮钠。
结合垫二的制备方法为：
(1)将2,4-D-BSA人工抗原用超纯水稀释到1mg/mL，按9μL2,4-D-BSA溶液加1mL胶体金溶液的比例，把浓度为1mg/mL的2,4-D-BSA溶液逐滴加入到100mL胶体金溶液中，室温反应30min，加入10％(v/v)的BSA至终浓度为1％，室温反应10min，4℃、12000r/min 离心30min，弃上清，沉淀用25mL金标蛋白重悬液重悬；采用同样的方法制备金标生物素-BSA 溶液，4℃保存备用；
(2)喷金时，将金标2,4-D-BSA及金标生物素-BSA按质量比为1:1混合，得到混合液，用喷涂仪按8μL/cm将混合液喷涂于玻璃纤维棉上，4℃低温真空干燥，制备出结合垫二。
所述的间接竞争免疫层析试纸的检测方法，包括以下步骤：将80-150μL样品溶液滴加到试纸样品垫上或将试纸的测试端警示线以下插入待测样品溶液中，5-10分钟判定检测结果，当检测线显色时，说明样品中不含待检物或含有的浓度小于检测限；当检测线不显色时，说明样品中含有待检物的浓度大于检测限；质控线始终显色，当质控线不显色时，说明操作有误或者试纸失效。
所述的间接竞争免疫层析试纸在食品安全检测、环境检测及违禁农兽药检测领域的半抗原检测中的应用。
本发明有益效果：
本发明试纸以竞争模式为基础制备而成，与传统竞争模式相比有如下优势：
1、灵敏度高。(1)抗体无需标记，加保护液干燥于结合垫一上，避免了标记抗体过程中抗体的折叠损伤，并可精确控制抗体的用量，从而增加试纸灵敏度。(2)纳米材料标记抗体改为纳米材料标记人工抗原，过量的标记抗原可以保证每个被拦截的单抗结合2个标记抗原，从而实现信号的放大，增加试纸灵敏度。而且过量的标记抗原即不影响抗体与样品中抗原的结合，也不干扰SPA拦截单抗，增加显色的同时不影响试纸灵敏度。(3)检测线由固定人工抗原改为固定二抗/SPA，使检测线的拦截效率增加，且降低了由于人工抗原的抗原性对试纸灵敏度及显色的影响。可见，本发明的间接竞争免疫层析试纸，具有“自放大”和“精准控制”的优点。
2、本发明的试纸选择独立质控(C)线，不与试纸中任何组分反应的一对可以特异性结合的物质，既可以选用生物素-亲和素系统，又可以选用无交叉反应的抗原抗体。
3、简便、快速。使用本发明试纸，无需其它任何试剂和仪器，可现场操作。将80-150μL 样品溶液滴加到试纸样品垫上，或将试纸的测试端警示线以下插入待测样品溶液中，5-10分钟左右即可判定检测结果。
4、结果显示形象、直观、准确。试纸以显示“︱”(或“十”、“┬”、“┴”、“├”、“┤”)印迹作为检测结果阳性和阴性标记，即在纤维素膜上显示一条“︱”印迹，表示样品中含有一定浓度(试纸目测灵敏度浓度)及以上的靶标物，显示两条棕“‖”印迹，表示被检样品中不含靶标物或含量低于一定浓度。结果判定形象、直观、准确，简单明了，不易出现假阳性和假阴性等人为误判。
5、节省费用。使用快速检测试纸，无需另配仪器设备和其它试剂，可随时随地进行检测，费用低廉，能节省大量贵重仪器和设备费用。
本发明的检测原理为：
当检测样品为阴性时，样品流经结合垫一时抗体溶解，流经结合垫二时抗体与纳米材料标记的人工抗原反应形成纳米材料标记抗原抗体复合物，流经T检测线时被固定的二抗/SPA 截获，标记颗粒富积而出现明显直观的条带即为检测线，标记的生物素在流经C质控线时被亲和素截获形成质控线，即试纸显示2条条带说明样品为阴性；若检测样品为阳性时，样品流经结合垫一，样品中抗原与溶解的抗体结合形成抗原抗体复合物，复合物流经结合垫时将不再与标记人工抗原反应，抗原抗体复合物将不带纳米材料标记，当流经检测线时被固定的二抗/SPA截获，将不再显示条带，标记的生物素在流经质控线时被亲和素截获形成质控线，即试纸仅质控线显色，说明样品为阳性。
附图说明
图1为本发明试纸检测原理示意图。
图2为本发明试纸剖面示意图。
图中，1为覆盖在样品垫和结合垫一、结合垫二上的保护层，2为样品垫，3为支撑层， 4为结合垫一，5为结合垫二，6为纤维素膜层，7为检测线，8为质控线，9为覆盖在吸水材料层上的保护层，10为吸水材料层。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式进一步详细说明，这些实施例只是说明而并不表示本发明所有的可能性。本发明并不局限于这些实施例中提到的材料、反应条件或参数，本领域的技术人员可以按照本发明的原理，利用其它类似材料或反应条件实现本发明描述的免疫层析技术或制备出检测试纸，这些修改都在本发明的保护范围之内。
实施例1
一种一体化“自放大”的2,4-D间接竞争免疫层析检测试纸，试纸包括支撑层、固定在支撑层上的吸附层和保护层；所述吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫一、结合垫二、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层；所述保护层固定在样品垫、结合垫一、结合垫二及吸水材料层上；纤维素膜层上依次设置有检测线和质控线；所述结合垫一吸附的为2,4-D单克隆抗体，结合垫二吸附的为纳米材料标记的2,4-D人工抗原及纳米材料标记的生物素。
所述纳米材料标记2,4-D人工抗原为胶体金、量子点或硅球纳米材料标记的2,4-D人工抗原；所述人工抗原由小分子半抗原与载体蛋白偶联制备而成；所述偶联人工抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清白蛋白或钥孔血蓝蛋白。
所述样品垫、结合垫一及结合垫二用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成；支撑层用不吸水的韧性材料制成；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成。
所述检测线和质控线为平行排列的“‖”直线式印迹，或为“十十”字型排列印迹，或为“┬┬”字型排列印迹，或为“┴┴”字型排列印迹，或为“├├”字型排列印迹，或为“┤┤”字型排列印迹。
所述检测线喷涂有与靶标物单克隆抗体特异性结合的物质：羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG 或SPA；所述质控线喷涂有亲和素，与所述纳米材料标记的生物素形成质控线。
在样品垫、结合垫一、结合垫二和吸水材料层上覆盖有保护膜，在样品垫与结合垫一交界处对应的保护膜上偏向样品垫一侧0.3-0.7cm处，印制有样品标记线。
实施例2
一体化“自放大”的2,4-D间接竞争免疫层析检测试纸的的制备方法，包括以下步骤：
1、2,4-D人工抗原的制备
称取2,4-D100mg加200μL甲醇溶解，再加入7mL PBS后溶液变浑浊，再逐滴加入1mol/LNaOH溶液至溶液澄清，随后用0.1M HCl调节溶液的pH值至中性，此为A溶液；称取15mg牛血清白蛋白(BSA)溶解在300μLPBS中，充分溶解后，此为B溶液；将A溶液在4℃搅拌状态下缓慢加入B溶液中，再加入100mg碳二亚胺(EDC)，4℃搅拌状态下反应 12h，将反应产物取出后，PBS流动透析72h，为2,4-D-BSA，同法制备2,4-D-OVA，-20℃冻存备用。
2、2,4-D单克隆抗体的制备
用制备的2,4-D-BSA，以每次20μg蛋白/200μL/只的用量免疫6～8周龄Balb/C小鼠，背部皮下分4～6点注射，共免4次，免疫间隔时间3周。首免，用无菌PBS稀释制备的2,4-D人工抗原，与等量弗氏完全佐剂(FCA)混合，充分乳化；加强免疫1次，用无菌PBS稀释 2,4-D-BSA，与等量弗氏不完全佐剂(FIA)混合，充分乳化，第4次免疫7天后测定血清抗体效价及抑制效价，筛选效价高，抑制效果好的小鼠作为融合小鼠。对融合小鼠进行超强免疫，将2,4-D-BSA用无菌的PBS稀释到50μg蛋白/200μL，不加佐剂直接腹腔注射。3～4天后将免疫的小鼠眶下窦采血，分离阳性血清；脱颈致死，用75％(v/v)的酒精浸泡小鼠5～ 10min消毒体表，无菌取其脾脏，将脾脏剪碎并研磨，经120目尼龙纱布过滤，1000r/min离心10min，收集脾细胞。将分离的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞按10:1的比例混合，1000r/min 离心10min弃上清，将细胞沉淀物于37℃水浴中缓缓加入0.7～1.0mL的50％聚乙二醇4000 (v/v)，1min内加完，前30s加0.1～0.3mL，中间15s加0.2～0.4mL，最后15s加完；然后缓缓加入无血清1640培养基15mL，以终止PEG的作用，37℃水浴5～10min，1000r/min 离心10min弃上清，将细胞沉淀物重悬于HAT(H-Hypoxanthine次黄嘌呤，A-Aminopterin氨基蝶呤，T--Thymidine胸腺嘧啶核苷)选择培养基中，并加入96孔细胞培养板中(8～10块)， 100μL～200μL/孔，置于37℃、5％的CO2培养箱中培养。培养10～14天，用间接ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行2次有限稀释克隆化，而后扩大培养，建立杂交瘤细胞株。
体内诱生腹水法批量制备抗体，取SPF级BALB/C小鼠，腹腔注射液体石蜡400μL/只， 7～10天后，把用培养基RMPI-1640稀释成浓度为1×106个细胞/mL的杂交瘤细胞，按500μL/ 只注射到腹腔中。待小鼠腹腔肿大，皮肤紧绷时，采取腹水，3000r/min离心5min，弃沉淀。然后辛酸硫酸铵法纯化腹水，1mL腹水中加入4mL乙酸乙酸钠缓冲溶液(pH 4.0)稀释腹水，用1M的NaOH溶液将腹水的乙酸乙酸钠缓冲溶液pH值调至4.5。然后缓慢搅拌加入130μL 辛酸，室温下搅拌反应30min，6000r/min离心30min，去沉淀，上清用滤纸过滤除去杂质，滤液与10倍浓缩的磷酸盐缓冲液(PBS)按体积比9:1混合，即滤液处于1倍PBS离子环境下，然后用1M的NaOH调pH至7.4，放入冰浴中冷却。按0.2778g/mL的浓度加入硫酸铵粉末，4℃下搅拌反应2h，6000r/min离心20min，去上清，1mLPBS溶解沉淀，PBS流动透析3d，6000r/min离心10min弃沉淀，-20℃冻存备用。经检测，所制备的单克隆抗体1F11 可特异地与2,4-D反应，可用于制备2,4-D免疫层析试纸。
3、结合垫一的制备
用金标蛋白重悬液(成分为：20mmol/L硼酸缓冲液含1％(w/v)的BSA、3％(w/v) 海藻糖和0.03％(w/v)叠氮钠)将2,4-D单克隆抗体稀释为20μg/mL，用喷涂仪将2,4-D单克隆抗体溶液喷涂于玻璃纤维棉上，4℃低温真空干燥，制备出结合垫一。
4、结合垫二的制备
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金溶液。99mL超纯水加入到洁净的带刻度的200mL锥形瓶中，锥形瓶置于加热磁力搅拌器上加热并搅拌，加入1mL 1％(w/v)氯金酸溶液，加热至沸腾，然后迅速加入1.6mL 1％(w/v)的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热溶液颜色经过透明- 黑色-深红色-酒红色变化，待颜色不再变化时再加热5min，室温冷却后，用超纯水将胶体金定容至100mL，4℃保存备用。
将2,4-D-BSA用超纯水稀释到1mg/mL浓度，按9μL2,4-D-BSA溶液加1mL胶体金溶液的比例，把浓度为1mg/mL的2,4-D-BSA溶液逐滴加入到100mL胶体金溶液中，室温反应30min，加入10％(v/v)的BSA至终浓度为1％，室温反应10min，4℃、12000r/min离心30min，弃上清，沉淀用25mL金标蛋白重悬液(20mmol/L硼酸缓冲液含1％(w/v)的BSA、3％(w/v) 海藻糖和0.03％(w/v)叠氮钠)重悬，同法制备金标生物素-BSA溶液，4℃保存备用。喷金时，将金标2,4-D-BSA及金标生物素-BSA按质量比为1:1混合后，用喷涂仪按8μL/cm将金标蛋白喷涂于玻璃纤维棉上，4℃低温真空干燥，制备出结合垫二。
5、试纸的组装
将亲和素喷涂于硝酸纤维素膜(NC膜)质控线C线位置；SPA喷涂在NC膜的检测线T线位置，42℃干燥4h，加干燥剂密封，制成纤维素膜层，备用。然后将样品垫、结合垫一、结合垫二、纤维素膜层、吸水材料层、保护层按照图1所示依次粘贴于支撑层底板上，各组份间重叠1-2mm，用切割机切成试纸。
6、免疫层析试纸的检测方法
取80-150μL待检样品加入到样品杯中混合均匀，然后将试纸测试端插入反应杯检测， 5-10min读取结果，当检测线及质控线同时显色时，即显示两条“‖”印迹，说明样品中不含 2,4-D或含有2,4-D的浓度小于检测限；当检测线不显色，仅质控线显色时，即在纤维素膜上显示一条“︱”印迹，说明样品中含有2,4-D的浓度大于检测限。
7、灵敏度检测
以浓度为6.25ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的2,4-D标准品PBS溶液为样品，采用上述方法制备的一体化2,4-D胶体金免疫层析试纸进行检测。结果显示，100ng/mL时试纸检测线不显色，其余浓度试纸检测线显色，因此判定本发明2,4-D新型胶体金免疫层析试纸的灵敏度为100ng/mL。
对比例
采用传统检测模式的2,4-D胶体金免疫层析试纸，其中硝酸纤维素膜上检测线吸附的为 2,4-D-BSA，质控线吸附的为SPA，采用胶体金标记2,4-D单克隆抗体制备结合垫。
使用时：将胶体金标记的2,4-D单克隆抗体喷涂在硝酸纤维素膜结合垫上，42℃干燥1h，加干燥剂密封备用。将SPA按0.2mg/mL浓度喷涂在NC膜的C线(质控线)位置，2,4-D人工抗原按0.9mg/mL浓度喷涂在NC膜的T线(检测线)位置，42℃干燥4h，加干燥剂密封备用。然后将NC膜、结合垫、样品垫、吸水层、保护层等依次粘贴于支撑底板上，各组份间重叠1-2mm，用切割机切成试纸。
经灵敏度检测，2,4-D传统检测模式的胶体金免疫层析试纸的灵敏度为1000ng/mL。对比可知，本发明2,4-D新型胶体金免疫层析试纸比2,4-D传统胶体金免疫层析试纸的灵敏度提高了10倍。
Claims (4)
1.一种一体化“自放大”的间接竞争免疫层析检测试纸，其特征在于，试纸包括支撑层、固定在支撑层上的吸附层和保护层；所述吸附层从测试端依次为样品垫、结合垫一、结合垫二、纤维素膜层及手柄端的吸水材料层；所述保护层固定在样品垫、结合垫一、结合垫二及吸水材料层上；纤维素膜层上依次设置有检测线和质控线；所述结合垫一吸附有靶标物单克隆抗体，结合垫二吸附有纳米材料标记的人工抗原及纳米材料标记的生物素；
所述纳米材料标记的人工抗原为胶体金、量子点或硅球纳米材料标记的靶标物人工抗原；
所述检测线喷涂有羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或SPA；所述质控线喷涂有亲和素；
所述人工抗原由小分子半抗原与载体蛋白偶联制备而成；
所述结合垫一吸附的为2,4-D单克隆抗体，结合垫二吸附的为胶体金标记的2,4-D人工抗原及胶体金标记的生物素；
所述结合垫一的制备方法为：用金标蛋白重悬液将2,4-D单克隆抗体稀释为20µg/mL，用喷涂仪将2,4-D单克隆抗体溶液喷涂于玻璃纤维棉上，4℃低温真空干燥，制备出结合垫一；所述金标蛋白重悬液为20 mmol/L硼酸缓冲液，含1% w/v的BSA、3% w/v的海藻糖和0.03% w/v的叠氮钠；
所述结合垫二的制备方法为：
（1）将2,4-D-BSA人工抗原用超纯水稀释到1mg/mL，按9μ按 2,4-D-BSA溶液加1mL胶体金溶液的比例，把浓度为1mg/mL的2,4-D-BSA溶液逐滴加入到100 mL胶体金溶液中，室温反应30min，加入10% v/v的BSA至终浓度为1%，室温反应10min，4℃、12000r/min离心30min，弃上清，沉淀用25mL金标蛋白重悬液重悬；采用同样的方法制备金标生物素-BSA溶液，4℃保存备用；
（2）喷金时，将金标2,4-D-BSA及金标生物素-BSA按质量比为1:1混合，得到混合液，用喷涂仪按8µL/cm将混合液喷涂于玻璃纤维棉上，4℃低温真空干燥，制备出结合垫二。
2.如权利要求1所述的间接竞争免疫层析检测试纸，其特征在于，所述样品垫、结合垫一及结合垫二用玻璃纤维棉、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；吸水材料层用吸水滤纸制成；支撑层用不吸水的韧性材料制成；纤维素膜层用硝酸纤维素膜、纯纤维素膜或羧化纤维素膜制成；
所述检测线和质控线为平行排列的“‖”直线式印迹，或为“十十”字型排列印迹，或为“┬ ┬”字型排列印迹，或为“┴ ┴”字型排列印迹，或为“├├”字型排列印迹，或为“┤┤”字型排列印迹。
3.一种如权利要求1所述的间接竞争免疫层析试纸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将80-150μL样品溶液滴加到试纸样品垫上或将试纸的测试端警示线以下插入待测样品溶液中，5-10分钟判定检测结果，当检测线显色时，说明样品中不含待检物或含有的浓度小于检测限；当检测线不显色时，说明样品中含有待检物的浓度大于检测限；质控线始终显色，当质控线不显色时，说明操作有误或者试纸失效。
4.一种如权利要求1所述的间接竞争免疫层析试纸在食品安全检测、环境检测及违禁农兽药检测领域的半抗原检测中的应用。
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