CN110068688B

CN110068688B - 一种牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡

Info

Publication number: CN110068688B
Application number: CN201910429625.2A
Authority: CN
Inventors: 王荣智; 王俊程; 汪世华; 刘海梅; 李秀兰; 凌素美; 贾坤志
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2019-05-22
Filing date: 2019-05-22
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2039-05-22
Also published as: CN110068688A

Abstract

本发明属于抗体工程与免疫检测领域，具体涉及一种牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡。该纳米花免疫测流层析检测卡包括样品垫、纳米花金标垫、硝酸纤维素膜（NC膜）、吸水垫和塑料卡壳。所述的NC膜上设置有C线和T线，所述的C线上喷有羊抗鼠的IgG抗体，而所述的T线上包被有牛乳铁蛋白抗原。所述的金标垫上含有纳米花金标记的鼠源单克隆IgG抗体。本发明能够通过竞争法纳米花免疫检测卡，对牛奶中乳铁蛋白进行快速检测，其检测灵敏度为2.4 ng/mL,对牛奶中主要的酪蛋白、血清白蛋白和脱脂牛奶均无交叉反应，所建立的检测方法方便快捷可以直接用于乳产品中乳铁蛋白含量的快速检测。

Description

一种牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡

技术领域

本发明属于抗体工程与免疫检测领域，具体涉及一种牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡。

背景技术

乳铁蛋白（Lactoferrin，LF）也叫乳运铁蛋白，是转铁蛋白家族的一种多功能蛋白，其相对分子质量约为80 kDa，存在于所有哺乳动物的分泌液中，尤其是在牛乳中存在最为广泛。乳铁蛋白具有营养、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等作用，目前已经在食品、药品和化妆品中得到了广泛的应用。此外，在食品安全检测中它可以作为评价奶产品质量的一项重要指标，因此对于乳制品中乳铁蛋白含量的快速检测显得尤为重要。

目前，检测样品中乳铁蛋白含量的方法主要包括高效液相色谱法，离子交换层析，分光光度法，核酸适配体和表面等离子共振技术等方法。这些方法都利用分析化学的检测手段对样品进行分离和鉴定，可以实现乳铁蛋白的定量检测。然而，这些方法的操作都需要实验室技术人员的操作以及对样品的预处理，有些还会用到昂贵的实验仪器，因此对样品中乳铁蛋白的快速检测带来了一定的困扰。抗体可以在体内或体外通过结合抗原表位的方式参与免疫防御，免疫检测和免疫应答的过程，从而广泛应用于个包括医学在内的各个领域。抗原抗体反应具有比例性，可逆性和高度的特异性，因此可以被用作免疫检测以及免疫诊断，目前已经被广泛应用于免疫印迹（WB）、免疫组织化学（IHC）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫胶体和纳米花金层析技术（GICA）。应用纳米花金标免疫检测卡可以对乳铁蛋白进行快速大批量的定量检测，而且不需要对样品进行前处理，从而省去了繁琐的步骤和样品处理时间。与其他化学检测方法相比较而言，该检测卡具有灵敏度高，特异性强，快速，简便等特点，被广泛应用于食品安全检测中。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速和特异性较强的一种牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡，该检测能够满足竞争法纳米花标记免疫检测卡检测牛奶及其乳制品中乳铁蛋白的要求，实现对牛乳铁蛋白的快速灵敏检测。

为了实现上述目的，本发明提供了一种牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡，检测卡包括样品垫、纳米花金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料卡壳；所述的NC膜上设置有C线和T线，所述的C线上喷有羊抗鼠的IgG抗体，所述的T线上包被有牛乳铁蛋白抗原；所述的金标垫上含有纳米花标记的抗LF单克隆抗体；所述抗LF单克隆IgG抗体是由保藏编号为CGMCC NO. 17087的杂交瘤细胞株3E2分泌获得。杂交瘤细胞3E2菌株，于2019年1月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17087，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心地址为中国，北京，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

所述金标垫中所含有纳米花标记的抗LF单克隆抗体，是由纳米花金标记的抗LF单克隆IgG抗体溶液以100 mm/s和1.25 μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在金标垫上干燥后得到的；所述抗体溶液的浓度为0.04 mg/mL。

所述纳米花金的制备方法为：用100 mL ddH₂O溶解1 g HAuCl₄制备获得氯金酸溶液，每管1 mL分装于1.5 mL灭菌离心管中并用锡箔纸密封后于-20℃保存备用；取750 μL的氯金酸溶液加入100 mL ddH₂O中，加入500 μL的胶体金溶液混匀，再加入300 μL 1wt%的柠檬酸三钠摇匀，最后加入1 mL 30 mM的对苯二酚溶液,搅拌30 min即可得到纳米花金溶液。

所述纳米花金的粒径大小为79 nm。

所述T线上包被的牛乳铁蛋白抗原，是由1 mg/mL的牛乳铁蛋白标准品溶液以100mm/s和1.25 μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在T线上干燥后得到的。

所述C线上包被的羊抗鼠IgG的抗体是由1 mg/mL的羊抗鼠IgG的抗体溶液以100mm/s和1.25 μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在C线上干燥后得到的。

本发明的显著优点在于：通过竞争法纳米花金标免疫测流层析检测卡方法，对牛乳铁蛋白进行快速检测，其检测灵敏度为2.4 ng/mL, 对牛奶中主要的酪蛋白、血清白蛋白和脱脂牛奶均无交叉反应，所建立的检测方法方便快捷可以直接用于乳产品中乳铁蛋白含量的快速检测。

附图说明

图1 单克隆抗体3E2的SDS-PAGE纯化结果鉴定，其中泳道1为marker；泳道2为未纯化的腹水；泳道3为纯化后的单克隆抗体。

图2 小鼠腹水和纯化单克隆抗体3E2效价测定结果。

图3 纳米花免疫测流层析检测卡的结构示意图。

图4 纳米花免疫测流层析检测卡特异性分析。

图5 纳米花免疫测流层析检测卡灵敏度分析。

图6 纳米花免疫测流层析检测卡实际样品检测。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 本发明单克隆抗体3E2的纯化与鉴定

1) 单克隆抗体腹水的制备

选取9~10周龄的Balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射500 μL液体石蜡致敏。致敏后7~10 d，选取96孔细胞培养板中的生长状态良好的杂交瘤细胞进行细胞计数后（约10⁵~10⁶个）注射到致敏的小鼠腹腔。倘若注射操作不当会导致小鼠的死亡，在注射细胞后应注意每天观察小鼠的状态。大约10~12 d，小鼠的腹部出现明显的膨胀而且行动缓慢，说明腹腔内杂交瘤细胞已经大量繁殖产生了腹水。待小鼠的腹部继续膨胀变大直到小鼠奄奄一息时；即可采用无菌针头扎入小鼠的下部腹腔收集腹水，腹水收集完毕后于13300 r/min 4℃离心10 min。离心后的腹水分三层，最下层是血细胞，中间相为单克隆抗体，最上层是脂肪等结缔组织碎片。用移液器吸取中间相置于新的离心管中，-80℃超低温冰箱保存。

2) 单克隆抗体的纯化

单克隆抗体的纯化采用辛酸硫酸铵法和Protein G Resin法。

辛酸硫酸铵法：从-80℃超低温冰箱中取出腹水融化后吸取1 mL置于离心管中，2500 r/min室温离心5 min。用移液枪吸出上清加入3 mL 60 mM的CH3COONa（pH 4.0）缓冲液，用0.1 mol/mL NaOH溶液调pH至4.5。在室温下，将33 μL正辛酸逐滴缓慢的加入上述溶液中，继续搅拌30 min，冰上静置反应2 h，然后以10000 r/min 4℃离心20 min收集上清，加入1/10体积的0.1 M PBS，再调pH值至7.4。量取上步骤溶液的体积，在冰上逐滴缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，注意一边加一边搅拌，加完以后在冰上静置30 min。然后全部溶液转移至离心管内，10000 r/min 4℃离心20 min收集沉淀，用1/10体积的0.01 M PBS重悬抗体沉淀，最后用0.01 M PBS透析抗体并用PEG-20000浓缩。

通过辛酸硫酸铵纯化的单克隆抗体纯度较低，仍需要根据实验要求进一步纯化才能得到高纯度的单克隆抗体。Protein G亲和层析：平衡：用5~10倍层析柱体积的平衡缓冲液（20 mM Na₂HPO₄，0.15 M NaCl，pH 7.0）平衡层析柱材料，直到流出液与平衡缓冲液完全一致。上样：辛酸硫酸铵粗纯得到的抗体要用0.45 μm微孔滤膜过滤后才能上柱。把过滤后的溶液与等体积的平衡缓冲液（20 mM Na₂HPO₄，0.15 M NaCl，pH 7.0）混合，用计时器计时按照1 mL/min的速度收集流出液。把收集的流出液再次上柱后按照1 mL/min的速度流出，重复2~3次后于4℃静置2 h。洗涤：用30 mL的平衡缓冲液（20 mM Na₂HPO₄，0.15 M NaCl，pH7.0）洗涤层析柱，用计时器计时按照2 mL/min的速度流出。洗脱：用20 mL的洗脱缓冲液（0.1 M Gly，pH 2.5）洗脱结合在层析柱的单克隆抗体，用计时器计时按照1 mL/min的速度收集流出液。最后，收集洗脱下来的抗体溶液，立即加入1/10体积的中和缓冲液（1 M Tris，pH 8.5）直至pH值为7.4。用0.01 M PBS透析抗体并用PEG-20000浓缩后待用。透析抗体时，需要在4℃用0.01 M PBS缓冲液（pH 7.4）透析，每6 h更换一次透析液，透析4次后即可SDS-PAGE电泳分析。

3) 单克隆抗体SDS-PAGE分析

取10 μL纯化后的抗体加入20 μL 5×loading buffer混匀；取1.5 μL未纯化的腹水加入20 μL 5×loading buffer混匀。然后把样品置于1.5 mL离心管中沸水浴10~15 min使抗体完全变性后各取10 μL点样后SDS-PAGE电泳。最后经考马斯亮蓝染色后再脱色观察。如图1所示，腹水中含有大量的免疫球蛋白和其他的杂蛋白，经过纯化后的单克隆抗体只有重链（约50 kDa）和轻链（约25 kDa）。

4) 间接ELISA分析抗体活性

抗原包被在酶标板上，乳铁蛋白的单克隆抗体与抗原特异性结合，之后商品化的山羊抗小鼠-HRP孵育后与一抗结合，最后酶标二抗在TMB显色液中显色。根据酶标二抗在显色液中催化底物的量而显出不同深浅的颜色。本实验中把腹水和纯化后的单克隆抗体分别用作一抗，即可测定抗乳铁蛋白腹水和单克隆抗体的效价。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内生长的同时会分泌大量的抗体，经过辛酸硫酸铵和Protein G亲和层析后就可以得到高纯度的抗体，之后采用直接ELISA的方法检测其效价，结果如图2所示，纯化后的单克隆抗体效价已经达到1:64000，可以用于ELISA免疫检测方法的建立和后续的实验。

实施例2 本发明纳米花免疫层析检测卡的制备与鉴定

1）纳米花金溶液的制备

纯化透析后的抗体溶液（0.01 M PBS）会含有大量的盐离子，这些盐离子浓度会影响胶体金溶液的稳定性甚至使胶体金变性。所以单克隆抗体需要在ddH₂O透析24 h，每6 h更换一次透析液，透析后用PEG-20000浓缩备用。用100 mL ddH₂O溶解1 g HAuCl₄制备获得氯金酸溶液，每管1 mL分装于1.5 mL灭菌离心管中并用锡箔纸密封后于-20℃保存备用。取750 μL的氯金酸溶液加入100 mL ddH₂O中，加入500 μL的胶体金溶液混匀，再加入300 μL的柠檬酸三钠（1wt%）摇匀，最后加入1 mL的对苯二酚溶液（30 mM）,搅拌30 min即可得到纳米花金溶液。

2）纳米花标记LF单克隆抗体

用移液枪取10 mL纳米花金溶液于50 mL小烧杯中，加入300 μL 0.1 M K₂CO₃溶液，混匀后备用。按照纳米花标记最小蛋白量的20%为最适的抗体标记量（300 μLmAb），用移液枪慢慢滴加入锥形瓶中，于冰上继续搅拌30 min。称量0.1 g BSA并缓慢加入到上述溶液中，于冰上继续搅拌30 min。称量0.1g PEG-20000并缓慢加入到上述溶液中，于冰上继续搅拌30 min待完全溶解后4℃静置过夜。

3）金标抗体的纯化

把过夜静置的纳米花金标抗体分装至1.5 mL灭菌离心管中，4℃ 1000 r/min离心10 min，用移液枪轻轻吸取上清并转移至新的离心管中，弃沉淀。然后把新的离心管中的纳米花金标抗体，于4℃ 3000 r/min离心30 min，用移液器把上清全部吸出，收集中间层蓝紫色流动相。向含有蓝紫色流动相的离心管中加入原来纳米花金标抗体1/10体积的纳米花金标稀释液。（纳米花金标稀释液：10 mL PBS+0.1g BSA+0.05 g PEG-20000+0.2g 蔗糖+0.005g NaN₃）然后置于4℃保存备用。

4）纳米花金标垫与样品垫的处理

把金标垫和样品垫裁剪成4 mm宽的长条状，放入500 mL玻璃烧杯中，加入封闭液（100 mL PBS+1 g BSA+1 mL Tween-20）使纳米花金标垫和样品垫淹没，置于37℃恒温培养箱30 min，然后取出于37℃干燥保存。

5）纳米花金标抗体活性测定

制备好的纳米花金标抗体需要测试是否标记成功才能进行后续的实验，把LF抗原包被在测试线（T line），山羊抗小鼠抗体包被在控制线（C line），加入5 μL的纳米花金标抗体后组装成免疫试纸条。用移液枪加入100 μL 0.01 M PBS，反应时间10 min，通过金标检测卡的显色情况判断金标抗体是否能进行检测使用。纳米花免疫检测卡的组装结构示意图如图3所示。

实施例3 本发明纳米花免疫层析检测卡的检测应用

1）纳米花免疫层析检测卡特异性测定

依据的最优的乳铁蛋白浓度和山羊抗小鼠IgG浓度在划线喷金系统上把抗原和二抗划线于NC膜上。然后把划线的NC膜放置于37℃恒温培养箱干燥10 min，同时每个金标垫加入5.2.13最佳纳米花金标抗体使用量的纳米花金标抗体于37℃恒温培养箱干燥10 min。用0.01 M PBS把10种不同的完全抗原（BSA，OVA，KLH，Casein，HSA，IFN-γ，TLH，PBSM，GFP，LF）稀释至终浓度为20 μg/mL。然后向组装好的纳米花金标检测卡样品垫中依次加入100 μL稀释好的不同抗原，反应时间10 min，观察T线的消失情况。结果如图4所示：只有加入乳铁蛋白抗原的溶液中纳米花免疫检测卡的T线完全消失，检测结果为阳性。而加入其它9种蛋白抗原的检测卡中都显示出C线和T线，检测结果为阴性。这表明：纳米花免疫层析检测卡只与乳铁蛋白抗原反应，不和其它无关的抗原包括牛奶中含有的乳蛋白和牛血清白蛋白反应，证明该纳米花免疫层析检测卡方法特异性强，无交叉反应。

2）免疫胶体金层析灵敏度测定

依据最优的乳铁蛋白浓度和山羊抗小鼠IgG浓度在划线喷金系统上把抗原和二抗划线于NC膜上。然后把划线的NC膜放置于37℃恒温培养箱干燥10 min，同时每个金标垫加入最佳纳米花金标抗体使用量的纳米花金标抗体于37℃恒温培养箱干燥10 min。用0.01 MPBS把乳铁蛋白标品稀释至终浓度为50 μg/mL，20 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，1.25 μg/mL，0.625 μg/mL，0.3125 μg/mL，0.156 μg/mL，0.039 μg/mL，0.019 μg/mL，0.0097 μg/mL，0.0048 μg/mL，0.0024 μg/mL，和0 μg/mL。然后向组装好的纳米花金标检测卡样品垫中依次加入100 μL稀释好的乳铁蛋白标准品，反应时间10 min，观察T线的消失情况。实验结果如下图5所示：随着待测样品中乳铁蛋白浓度的提高，T线逐渐的消失，直至抗原浓度达到5μg/mL时，测试区的蓝紫色条带完全消失。相反随着乳铁蛋白抗原浓度的降低，抗原的竞争越来越弱，T线的颜色越来越深，当乳铁蛋白的浓度为0.0024 μg/mL时免疫胶体金层析中C线和T线的显色情况与没有加乳铁蛋白的显色情况完全一样，此时已经达到了胶体金检测卡的下限。当检测样品中乳铁蛋白的浓度由0.0024 μg/mL增加至0.048 μg/mL时，T线明显颜色开始变浅，C线颜色明显加深，这是由于纳米花金标抗体与溶液中游离的乳铁蛋白结合的量开始变多从而导致与T线上包被的抗原结合量变少。综上所述，本研究制备的纳米花免疫免疫层析检测卡的最低检测限为2.4 ng/mL。

3）纳米花免疫胶体金层析实际样品检测

依据最优的乳铁蛋白浓度和山羊抗小鼠IgG浓度在划线喷金系统上把抗原和二抗划线于NC膜上。然后把划线的NC膜放置于37℃恒温培养箱干燥10 min，同时每个金标垫加入最佳纳米花金标抗体使用量的纳米花金标抗体于37℃恒温培养箱干燥10 min。从学校超市随机购买6种不同品牌的牛奶，然后向组装好的纳米花金标检测卡样品垫中依次加入100μL牛奶样品，反应时间10 min，观察T线的消失情况。结果如下图6所示：3号牛奶中纳米花免疫层析检测卡的T线完全消失，检测结果为阳性。而加入其它5种牛奶样品的检测卡中都显示出C线和T线，检测结果为阴性。这说明只有3号牛奶中含有乳铁蛋白，其余5种牛奶中均不含乳铁蛋白。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡，其特征在于：检测卡包括样品垫、纳米花金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和塑料卡壳；所述的硝酸纤维素膜上设置有C线和T线，所述的C线上喷有羊抗鼠的IgG抗体，所述的T线上包被有牛乳铁蛋白抗原；所述的金标垫上含有纳米花标记的抗LF单克隆IgG抗体；所述抗LF单克隆IgG抗体是由保藏编号为CGMCC NO. 17087的杂交瘤细胞株3E2分泌获得。

2.根据权利要求1所述的牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡，其特征在于，所述金标垫中所含有纳米花标记的抗LF单克隆IgG抗体，是由纳米花金标记的抗LF单克隆IgG抗体溶液以100 mm/s和1.25 μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在金标垫上干燥后得到的；所述抗体溶液的浓度为0.04 mg/mL。

3.根据权利要求2所述的牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡，其特征在于，所述纳米花金的制备方法为：用100 mL ddH₂O溶解1 g HAuCl₄制备获得氯金酸溶液，每管1 mL分装于1.5 mL灭菌离心管中并用锡箔纸密封后于-20℃保存备用；取750 μL的氯金酸溶液加入100 mL ddH₂O中，加入500 μL的胶体金溶液混匀，再加入300 μL 1wt%的柠檬酸三钠摇匀，最后加入1 mL 30 mM的对苯二酚溶液,搅拌30 min即可得到纳米花金溶液。

4.根据权利要求2所述的牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡，其特征在于，所述纳米花金的粒径大小为79 nm。

5.根据权利要求1所述的牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡，其中，所述T线上包被的牛乳铁蛋白抗原，是由1 mg/mL的牛乳铁蛋白标准品溶液以100 mm/s和1.25μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在T线上干燥后得到的。

6.根据权利要求1所述的牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡，其中，所述C线上包被的羊抗鼠IgG的抗体是由1 mg/mL的羊抗鼠IgG的抗体溶液以100 mm/s和1.25μL/cm的喷涂速度通过喷金点膜机喷涂在C线上干燥后得到的。