CN112345753A - 一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层析试纸条 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子(AuNC@PDA)为信标载体制备的免疫层析试纸条，在底板上依次搭接粘贴滤纸、样本垫、AuNC@PDA标记抗体复合物玻璃纤维垫、喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水纸，制成免疫层析试纸条，用于定量检测样本中的待测物浓度，制得的试纸条具有稳定性高、检测灵敏度高的特点。

Description

一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层 析试纸条
技术领域
本发明属于医学检验和食品安全检测领域，具体涉及一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子(AuNC@PDA)为信标载体制备的免疫层析试纸条，来定量检测样本中的待测物浓度。
背景技术
免疫层析技术是一种基于抗原抗体特异性反应的检测方法，具有检测速度快、特异性好、操作简单和费用低等优点，相比于其它方法更能满足现场大批量检测的需求，因此近年来发展迅猛，被广泛应用于食品安全、医学检验和环境污染物监测等领域。其中胶体金免疫层析试纸条是应用最广泛的一种免疫层析产品，但其灵敏度较差且易受基质干扰。因此近年来的免疫层析技术主要有三个发展方向：一是采用免疫磁分离富集技术从复杂基质中分离浓缩目标物以避免样品基质的干扰；二是通过信号放大系统(如生物素-链霉亲和素系统等)以提高免疫层析方法的灵敏度；三是采用新型标记物(如荧光微球)，提高信号输出或转变信号输出类型，以达到提高灵敏度的目的。
金花(AuNF)一般具备多枝结构，相比于传统的胶体金具有更大的比表面积、光吸收和酶催化活性，因而广泛应用于传感器探针领域。然而，传统的金花一般经由复杂的种子生长两步法合成，并且合成的金花粒径均一性不高，限制了金花的开发与应用。此外，作为纳米探针，金花的光学性质是其关键参数，直接影响了检测方法的灵敏度，而光学性质由金花枝杈的特性决定。因此，简易合成均匀的具备复杂多枝结构的金花纳米粒子是十分有必要的。
稳定性和生物相容性是纳米探针的另外两个重要参数。稳定性决定了检测方法的可靠性以及检测产品的储存期；生物相容性影响了纳米探针与识别分子的偶联，从而影响方法的普适性。一般地，探针表面修饰一层生物膜是很好的提高探针稳定性和生物相容性的策略，最早发现于贻贝中的聚多巴胺即是很好的生物膜材料，它可以修饰在任意材料的表面，同时具有很好的稳定性和生物相容性，因而被广泛用作纳米材料表面修饰。
基于上述情况，发明人通过一锅法合成了一种聚多巴胺包裹的复杂花状金纳米粒子—聚多巴胺包菊花金纳米粒子(AuNC@PDA)作为探针，应用于医学检验和食品安全快速检测等领域并提高试纸条稳定性和检测灵敏度。目前，尚未有将AuNC@PDA作为探针应用于免疫层析法中的相关报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种以AuNC@PDA为信标载体制备的免疫层析试纸条。
本发明的另一个目的是提供上述试纸条的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
本发明提供了一种以AuNC@PDA为信标载体制备的免疫层析试纸条，它包括底板以及在底板上搭接粘贴的滤纸、样本垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其中，所述玻璃纤维垫包被有AuNC@PDA标记抗体的复合物，该玻璃纤维垫的制备方法包括如下步骤：
(1)AuNC@PDA的制备：将3.6～18mL盐酸多巴胺(4mg/mL)溶于72mL Tris-HCl缓冲溶液(0.01～0.1M,pH 7～10)中，于剧烈搅拌下，加入5.4～22mL氯金酸溶液(0.1％，w/v)与之避光反应15-40h。反应结束后离心(转速为4000～15000r/min，时间为10～30min)取沉淀物，清洗沉淀物后将沉淀物复溶于磷酸盐缓冲溶液(0.01～0.05M，pH 6～8)中，即制得AuNC@PDA；
(2)AuNC@PDA标记抗体的制备：向制得的AuNC@PDA中加入待标记抗体，混匀后，室温搅拌反应2h，之后，加入封闭剂，室温反应2h，离心取沉淀，得到的沉淀复溶，制成AuNC@PDA复合物；
(3)AuNC@PDA标记抗体的玻璃纤维垫：将制得的AuNC@PDA标记抗体复合物喷涂到玻璃纤维垫上即可。
进一步的，所述AuNC@PDA标记抗体的玻璃纤维垫中的待标记抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体。
进一步的，步骤(2)中所述AuNC@PDA标记抗体的制备包括如下具体步骤：取AuNC@PDA超声1～5min，再用0.01～0.05M pH 6.0～8.0的磷酸盐缓冲液调节微球浓度至0.01～0.2mg/mL，加入待标记抗体使其终浓度为1～50μg/mL，振荡混匀后，室温搅拌反应2h，之后，加入封闭剂，使其终浓度为1～2％，室温反应2h，然后在5000～10000r/min转速下离心20～40min，沉淀用0.01～0.05M pH 6.0～8.0的磷酸盐缓冲液复溶为起始体积的1/10，制成AuNC@PDA复合物于4℃保存备用；
进一步的，本发明的硝酸纤维素膜上包被有待测物人工偶联抗原或待测物抗体作为检测线，包被有抗鼠抗体或抗兔抗体(二抗)作为质控线；其中，该硝酸纤维素膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)使用0.01～0.5M pH 6.0～8.0的PBS(磷酸盐缓冲溶液)溶液分别调节包被物待测物人工偶联抗原或待测物抗体、抗鼠抗体或抗兔抗体至浓度为0.01～2.0mg/mL；
(2)将调整浓度后的待测物人工偶联抗原或待测物抗体喷涂于硝酸纤维素膜前部，作为检测线，将抗鼠抗体或抗兔抗体喷涂于硝酸纤维素膜后部，作为质控线；其中，检测线和质控线之间间隔一定距离，二者的喷量均为0.37～0.74μL/cm；
(3)将喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜于37℃过夜烘干处理后，在室温干燥的环境下保存备用。
进一步的，所述的待测物人工偶联抗原是指小分子待测物与大分子蛋白质通过化学偶联方法制备的具有免疫原性和反应原性的全抗原；其中，所述的小分子待测物涵盖医学检验领域和食品安全检测领域所需要检测的所有小分子物质；所述的偶联方法包括重氮法、碳二亚胺法、戊二醛法、混合酸酐法、琥珀酸酐法；所述的偶联大分子蛋白包括牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白；所述的偶联比为1:5～1:100，偶联后透析纯化，得到所需的人工偶联抗原。
进一步的，所诉待测物抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体。
进一步的，所述的一种以AuNC@PDA为信标载体制备成的免疫层析试纸条的组装，包括以下步骤：
⑴在底板上搭接粘贴下述材料：滤纸、样本垫、喷涂有AuNC@PDA-抗体复合物的玻璃纤维垫、喷涂有待测物偶联人工抗原或抗体作为检测线和抗鼠抗体/抗兔抗体作为质控线的硝酸纤维素膜和吸水纸，即组装成本发明的使用AuNC@PDA为信标载体制备的免疫层析试纸条大板。
⑵组装好的试纸条大板，通过切刀切成需要的宽度，即成本发明的使用AuNC@PDA为信标载体制备的免疫层析试纸条，该试纸条可以直接使用，也可以装入塑料卡壳中使用。
本发明提供的一种以AuNC@PDA为信标载体制备的免疫层析试纸条的检测过程包括：
经过处理后的检测样本加样到本发明制备的免疫层析试纸条，加样体积为100～200μL/条，反应时间为5～30分钟，之后，可以通过读取该试纸条上检测线和质控线的灰度数据，内置标准曲线计算检测样本浓度来实现定量检测，也可以通过肉眼观察检测线和质控线有无显色条带来实现定性判断。
本发明的有益效果是：
本发明制备的免疫层析试纸条首次以AuNC@PDA作为信标载体，相比于传统的金花和胶体金其稳定性高且信号强，制备得到的免疫层析试纸条稳定性高且检测灵敏度高。
附图说明
图1是免疫层析试纸条结构示意图，其中，1样本垫、2滤纸、3AuNC@PDA-抗体复合物玻璃纤维垫、4硝酸纤维素膜、5检测线、6质控线、7吸水纸、8PVC底板；
图2为竞争法AuNC@PDA免疫层析试纸条检测原理图，其中，1为检测线上的待测物人工偶联抗原，2为质控线上的抗鼠抗体或抗兔抗体，3为小分子待测物，4为AuNC@PDA-抗体复合物。
图3为双抗夹心法AuNC@PDA免疫层析试纸条检测原理图，其中，1为检测线上的待测物抗体，2为质控线上的抗鼠抗体或抗兔抗体，3为大分子待测物，4为AuNC@PDA-抗体复合物。
图4为本发明AuNC@PDA制备的试纸条检测HCG实物图。
图5为传统AuNF@PDA制备的试纸条检测HCG实物图。
如图1所示，该免疫层析试纸条的构成为：在PVC底板8上，依次搭接地粘贴喷涂有检测线5和质控线6的NC膜4、喷涂有AuNC@PDA-抗体复合物的金垫3、样本垫1、滤纸2和吸水纸7，粘贴好后通过切条机切成4×55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，即为一张完整的检测试纸条。
如图2所示，检测原理如下：待测样本加入到试纸条加样孔中并反应完成后，样本如果是阴性，样本随层析方向层析，结合垫上的AuNC@PDA-抗体复合物涌动到检测线位置，与检测线上的人工偶联抗原发生基于抗原抗体结合的免疫学反应而形成抗原抗体复合物，AuNC@PDA在检测线上聚集并显色，部分未与人工偶联抗原结合的AuNC@PDA-抗体复合物涌动到质控线位置，与相应的抗抗体结合从而质控线也显色；样本如果是阳性，则样本中的待测物先与AuNC@PDA-抗体复合物结合，结合了待测物的AuNC@PDA-抗体复合物不能再和检测线上的待测物人工偶联抗原结合，则检测线显色变浅甚至消失，质控线显示显色原理同阴性样本。
如图3所示，检测原理如下：待测样本加入到试纸条加样孔中并反应完成后，样本如果是阴性，样本随层析方向层析，结合垫上的AuNC@PDA-抗体复合物涌动到检测线位置，不能与检测线上的待测物抗体发生基于抗原抗体结合的免疫学反应，因此检测线上不显色，AuNC@PDA-抗体复合物涌动到质控线位置，与相应的抗抗体结合从而质控线显色；样本如果是阳性，则样本中的待测物先与AuNC@PDA-抗体复合物结合，结合了待测物的AuNC@PDA-抗体复合物涌动到检测线上，因待测物分子量较大，表面有与多个抗体结合的位点，因此与检测线上的待测物抗体结合，AuNC@PDA双抗夹心复合物形成，则检测线显色，质控线显色原理同阴性样本。
如图4和5所示，以传统AuNF@PDA和本发明方法制备的AuNC@PDA作为探针制备的检测HCG免疫层析试纸条，在相同的待检物浓度下，本发明的AuNC@PDA制备的试纸条显色更强，换言之，本发明的AuNC@PDA制备的试纸条灵敏度更高。
具体实施方式
实施例1：AuNC@PDA制备
一、溶液配制：Tris-HCl缓冲溶液(0.01M,pH 8.5)；
二、氧化还原反应：将3.6mL盐酸多巴胺(4mg/mL)溶于72mL Tris-HCl缓冲溶液(0.01M,pH 8.5)中，于剧烈搅拌下，加入5.4mL氯金酸溶液(0.1％，w/v)与之避光反应20h。
三、洗涤：反应结束后离心(转速为10000r/min，时间为20min)取沉淀物，清洗沉淀物后将沉淀物复溶于磷酸盐缓冲溶液(0.05M，pH 8)中，即制得AuNC@PDA，并4℃保存。
实施例2：一种使用AuNC@PDA为信标载体制备的检测人绒毛膜促性腺激素(HCG)的夹心法免疫层析试纸条的制备
一、免疫层析试纸条的制备工艺
1.硝酸纤维素膜的制备；
抗HCG多抗和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01M pH 7.5的PBS(磷酸盐缓冲液)稀释抗HCG多抗的浓度为0.5mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为0.5mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为质控线，两线的喷量均为0.74μL/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12小时，放置于干燥柜中保存备用。
2.AuNC@PDA-抗体复合物玻璃纤维垫的制备：
取0.5mg AuNC@PDA超声(实施例1制备得到)1分钟，用pH 6.0的0.05M磷酸盐缓冲液调节AuNC@PDA浓度为0.05mg/mL，，振荡混匀后，1mL AuNC@PDA中加入6μg HCG单克隆抗体，充分混合后，4℃搅拌反应2h，加入终浓度为0.5％的牛血清白蛋白，室温封闭2h，8000r/min离心30min，沉淀用0.01M pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)复溶为起始体积的1/10，按照3μL/cm体积喷涂到玻璃纤维垫上，真空干燥2h。
3.组装试纸条：
⑴滤纸和样本垫规格为1×30cm；
⑵喷涂有AuNC@PDA-抗体复合物的玻璃纤维垫，规格为0.8×30cm；
⑶喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5×30cm；
⑷吸水纸，规格为1.2×30cm；
⑸PVC底板，规格为5.5×30cm。
将以上材料按照试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4×55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为12个月。
二、定量检测样本中的HCG
用上述的免疫层析试纸条检测样本中HCG的方法，包括如下的步骤：
1.在试纸条加样孔中加入人血清样本100μL，反应15min；
2.将试纸条插入试纸条读取仪的检测窗口，检测线和质控线显色的强弱会以数值的高低在显示器上显示，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中HCG的含量，实现样本中HCG的定量检测。
3.建立标准曲线：在阴性基质中加标，标准曲线中HCG浓度为：0、1、2、4、6、8、10、15、20、50mIU/mL，计算R2为0.9902，线性回归方程式为：y＝1634.2ln(x)-577.54。
实施例3：一种使用AuNC@PDA为信标载体制备的检测玉米赤霉烯酮(ZEN)的竞争法免疫层析试纸条的制备
一、免疫层析试纸条的制备工艺
1.硝酸纤维素膜的制备；
⑴制备ZEN人工抗原(ZEN-BSA)：
偶联方法为混合酸酐法，偶联蛋白为牛血清白蛋白(BSA)，偶联比为1:100，偶联后透析纯化，得到ZEN-BSA。
⑵NC膜处理：
ZEN-BSA偶联物和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01M pH 7.4的PBS稀释ZEN-BSA偶联物的浓度为6mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为0.5mg/mL，所得的溶液在膜上喷涂作为质控线，两线的喷量均为0.74μL/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12h，放置于干燥柜中保存备用。
2.AuNC@PDA-抗体复合物玻璃纤维垫的制备：
取0.5mg AuNC@PDA超声(实施例1制备得到)1分钟，用pH 7.4的0.05M磷酸盐缓冲液调节微球浓度为0.05mg/mL，振荡混匀后，1mL AuNC@PDA中加入10μg ZEN单克隆抗体，充分混合后，4℃搅拌反应2h，加入终浓度为0.5％的酪蛋白，室温封闭2h，8000r/min离心30min，沉淀用0.01M pH 7.4的PBS复溶为起始体积的1/10，按照8μL/cm体积喷涂到玻璃纤维垫上，真空干燥2h。
3.组装试纸条：
⑴滤纸和样本垫规格为1×30cm；
⑵喷涂有AuNC@PDA-抗体复合物的玻璃纤维垫，规格为0.8×30cm；
⑶喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5×30cm；
⑷吸水纸，规格为1.2×30cm；
⑸PVC底板，规格为5.5×30cm。
将以上材料按照试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4×55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为12个月。
二、定量检测样本中的ZEN
用上述的免疫层析试纸条检测样本中ZEN的方法，包括如下的步骤：
1.称取饲料或粮食样本2g，加入10mL提取液后震荡1分钟，取上清液检测；
2.在试纸条加样孔中加入110μL样本，反应5min；
3.将试纸条插入试纸条读取仪的检测窗口，检测线和质控线显色的强弱会以数值的高低在显示器上显示，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中ZEN的含量，实现阳性样本的定量检测。
4.建立标准曲线：在阴性基质中加标，标准曲线中ZEN浓度为：0、0.5、1、2、4、8ppb，计算R2为0.9912，线性回归方程式为：y＝-896.9ln(x)+1678.3。
实施例4：一种使用AuNC@PDA为信标载体制备的检测乙肝表面抗原(HBsAg)的双抗夹心法免疫层析试纸条的制备
一、免疫层析试纸条的制备工艺
1.硝酸纤维素膜上检测线和质控线的制备：
HBsAg多克隆抗体和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01M pH 7.4的PBS稀释HBsAg多克隆抗体的浓度为2mg/mL，所得的溶液喷涂在膜上作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为0.5mg/mL，所得的溶液喷涂在膜上作为质控线，两线的喷膜量均为0.74μL/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12h，放置于干燥柜中保存备用。
2.AuNC@PDA-抗体复合物玻璃纤维垫的制备：
取0.5mg AuNC@PDA(实施例1制备得到)超声1分钟，用pH 6.0的0.01M PBS缓冲液调节微球浓度为0.1mg/mL，振荡混匀后，1mL AuNC@PDA中加入50μg HBsAg单克隆抗体，充分混合后，4℃搅拌反应2h，加入终浓度为0.5％的牛血清白蛋白，室温封闭2h，8000r/min离心30min，沉淀用0.01M pH 7.4的PBS复溶为起始体积，按照7μL/cm体积喷涂到玻璃纤维垫上，真空干燥2h。
3.组装试纸条：
⑴滤纸和样本垫规格为1×30cm；
⑵喷涂有AuNC@PDA-抗体复合物的玻璃纤维垫，规格为0.8×30cm；
⑶喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5×30cm；
⑷吸水纸，规格为1.2×30cm；
⑸PVC底板，规格为5.5×30cm。
将以上材料按照试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4×55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为12个月。
二、定量检测样本中的HBsAg
用上述的免疫层析试纸条检测样本中HBsAg的方法，包括如下的步骤：
1.在试纸条加样孔中加入人血清样本100μL，反应20min；
2.将试纸条插入试纸条读取仪的检测窗口，检测线和质控线显色的强弱会以数值的高低在显示器上显示，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中HBsAg的含量，实现样本中HBsAg的定量检测。
3.调节标准曲线：在阴性基质中加标，加标标准曲线中HBsAg浓度为：0、10、20、40、80、160ppb，计算R2为0.9946，线性回归方程式为：y＝-429.9ln(x)+4341.3。
实施例5：一种使用AuNC@PDA为信标载体制备的检测大肠杆菌O157:H7的双抗夹心法免疫层析试纸条的制备
一、免疫层析试纸条的制备工艺
1.硝酸纤维素膜上检测线和质控线的制备：
大肠杆菌O157:H7多克隆抗体和抗鼠抗体包被到硝酸纤维素膜上：用0.01M pH7.5的PBS稀释O157:H7多克隆抗体的浓度为2mg/mL，所得的溶液喷涂在膜上作为检测线；稀释抗鼠抗体的浓度为0.5mg/mL，所得的溶液喷涂在膜上作为质控线，两线的喷量均为0.74μL/cm，检测线与膜顶边间隔10mm，两线中间间隔5mm，37℃烘干12h，放置于干燥柜中保存备用。
2.AuNC@PDA-抗体复合物玻璃纤维垫的制备：
取0.5mg AuNC@PDA(实施例1制备得到)超声1分钟，用pH 8.0的0.05M磷酸盐缓冲液调节微球浓度为0.05mg/mL，振荡混匀后，1mL AuNC@PDA中加入20μg大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，充分混合后，4℃搅拌反应2h，加入终浓度为0.5％的酪蛋白，室温封闭2h，8000r/min离心30min，沉淀用0.01M pH 7.4的PBS复溶为起始体积的1/10，按照9μL/cm体积喷涂到玻璃纤维垫上，真空干燥2h。
3.组装试纸条：
⑴滤纸和样本垫规格为1×30cm；
⑵喷涂有AuNC@PDA-抗体复合物的玻璃纤维垫，规格为0.8×30cm；
⑶喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜，规格为2.5×30cm；
⑷吸水纸，规格为1.2×30cm；
⑸PVC底板，规格为5.5×30cm。
将以上材料按照试纸条结构示意图中各组分位置进行依次粘贴，组装好后用切刀裁切成4×55mm的试纸条，装入塑料卡壳中，压紧后装入铝箔袋，加入干燥剂后，封口保存，室温环境保质期为12个月。
二、定量检测样本中的大肠杆菌O157:H7
用上述的免疫层析试纸条检测样本中大肠杆菌O157:H7的方法，包括如下的步骤：
1.样本前处理：样本按照国标方法进行增菌培养，培养后检测；
2.在试纸条加样孔中加入110μL样本，反应5min；
3.将试纸条插入试纸条读取仪的检测窗口，检测线和质控线显色的强弱会以数值的高低在显示器上显示，根据仪器中已经录入的标准曲线，即可计算出样本中大肠杆菌O157:H7的含量，实现样本的定量检测。
4.调节标准曲线：在阴性基质中加标，标准曲线中大肠杆菌O157:H7浓度为：0、102、103、104、105、106CFU/mL，计算出R2为0.9965，线性回归方程式为：y＝654.3ln(x)+5120.4。
对比例1：使用传统AuNF@PDA为信标载体的免疫层析试纸条的制备
AuNF@PDA制备：1)金种子的制备：1mL HAuCl4(1％，w/v)加入至99mL超纯水中，搅拌加热至煮沸，接着一次性加入2～4mL柠檬酸钠溶液(1％，w/v)，保持加热搅拌反应30min。反应结束后冷却至室温，4℃保存待用；2)AuNF的制备：100mL超纯水加热至60℃并保温，高速搅拌下加入4.8mL金种子、0.3～1.2mL HAuCl4(2％，w/v)、1.2～4.8mL柠檬酸钠溶液(1％，w/v)。15s后加入12～48mL对苯二酚溶液(30mM)，室温反应30min。反应结束后4000～12000r/min离心15min，沉淀用4.8mL超纯水复溶，4℃保存待用；3)AuNF@PDA制备：250μLAuNF(1.5mg/mL)加入至Tris-HCl缓冲溶液(0.01～0.1M,pH 7～10)，超声混匀后，加入25～100μL DA·HCl溶液(1mg/mL)，避光搅拌反应10～40h。反应结束后，4000～12000r/min离心10min，沉淀用250μL超纯水复溶，4℃保存待用。
传统AuNF@PDA试纸条的制备：分别取0.5mg上述制得的AuNF@PDA 4份，每份AuNF@PDA分别按照实施例2、3、4、5中含AuNC@PDA-抗体复合物的玻璃纤维垫的试纸的制备步骤(除将含AuNC@PDA-抗体复合物的玻璃纤维垫中的AuNC@PDA替换为等量的AuNF@PDA，其余步骤相同)，制成4份传统AuNF@PDA试纸条。
将上述新制得的4份AuNF@PDA试纸条分别编号5、6、7、8，再取实施例2、3、4、5制备得到的试纸条，编号1、2、3、4，通过检测8种试纸条的最低检测灵敏度来比较，试纸条最低检测灵敏度的检测方法为：随机选取20个阴性样本，加样反应完成后用试纸条读取仪读取，该结果通过代入各检测卡标准曲线计算出样本中待测物浓度，20个阴性样本计算出的浓度平均值加上3倍标准偏差，即为该检测卡最低检测灵敏度。检测结果见表1。
表1
编号 试纸条灵敏度 编号 试纸条灵敏度
1 1.59mIU/mL 5 15.13mIU/mL
2 0.21ppb 6 2.3ppb
3 2.4ppb 7 21.9ppb
4 10<sup>2</sup>CFU/mL 8 10<sup>4</sup>CFU/mL
从表1中可以看出，本方法制备的试纸条，其灵敏度均比传统AuNF@PDA制备的试纸条灵敏度高，说明该试纸条具有检测灵敏度高的优点。
综上所述，本发明提供的方法成功制备了AuNC@PDA作为信标载体制备得到的免疫层析试纸条，该试纸条可以普遍应用于对抗原或抗体的灵敏检测。
以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层析试纸条，包括底板，以及在底板上依次地搭接粘贴的滤纸、样本垫、玻璃纤维垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，其特征在于：所述的玻璃纤维垫上喷涂有AuNC@PDA标记抗体复合物，该玻璃纤维垫的制备方法包括如下步骤：
(1)AuNC@PDA的制备：将盐酸多巴胺溶于Tris-HCl缓冲溶液中，于剧烈搅拌下，加入氯金酸溶液与之反应，氯金酸被盐酸多巴胺还原成单质金，盐酸多巴胺被氯金酸氧化聚合形成聚多巴胺；反应结束后离心取沉淀物，清洗沉淀物后将沉淀物复溶于缓冲液中，即制得AuNC@PDA；
(2)AuNC@PDA标记抗体的制备：向制得的AuNC@PDA中加入待标记抗体，混匀后，4℃反应过夜，之后，加入封闭剂，室温反应2h，离心取沉淀，得到的沉淀复溶，制成AuNC@PDA标记抗体复合物；
(3)AuNC@PDA标记抗体的玻璃纤维垫：将制得的AuNC@PDA标记抗体复合物喷涂到玻璃纤维垫上即可。
2.根据权利要求1所述的一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层析试纸条，其特征在于，所述步骤(2)中的AuNC@PDA在加入待标记抗体前可进行预处理，预处理的步骤包括：将步骤(1)得到的AuNC@PDA超声1～5min，再用0.01～0.05M pH 6.0～8.0的磷酸盐缓冲液调节AuNC@PDA浓度至0.01～0.2mg/mL。
3.根据权利要求1所述的一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层析试纸条，其特征在于，所述步骤(2)中加入待标记抗体后的抗体终浓度为1～50μg/mL，加入封闭剂后封闭剂的终浓度为0.1～2％，且所述封闭剂选自酪蛋白、牛血清白蛋白、脱脂牛奶中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层析试纸条，其特征在于，所述步骤(2)中加入封闭剂反应后的溶液离心的转速为5000～10000r/min，时间为20～40min。
5.根据权利要求1所述的一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层析试纸条，其特征在于，所述步骤(2)中离心后的沉淀用0.01～0.05M pH 6.0～8.0的磷酸盐缓冲液复溶为起始体积的1倍至1/10倍，即可制成AuNC@PDA标记抗体复合物，并可于4℃保存备用。
6.根据权利要求1所述的一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层析试纸条，其特征在于，所述AuNC@PDA标记的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体。
7.根据权利要求1所述的一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层析试纸条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上包被有待测物人工偶联抗原或待测物抗体作为检测线，包被有抗鼠抗体或抗兔抗体作为质控线，该硝酸纤维素膜上的制备方法，包括如下步骤：
(1)使用0.01～0.5M pH 6.0～8.0的PBS溶液分别调节包被物、待测物、人工偶联抗原或待测物抗体、抗鼠抗体或抗兔抗体至浓度为0.01～2.0mg/mL；其中，该待测物抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体、纳米抗体；
(2)将调整浓度后的待测物人工偶联抗原或待测物抗体喷涂于硝酸纤维素膜前部，作为检测线，将抗鼠抗体或抗兔抗体喷涂于硝酸纤维素膜后部，作为质控线；其中，检测线和质控线之间间隔一定距离，二者的喷膜量均为0.37～0.74μL/cm；
(3)将喷涂有检测线和质控线的硝酸纤维素膜于37℃过夜烘干处理后，在室温干燥的环境下保存备用。
8.根据权利要求7所述的一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层析试纸条，其特征在于，所述步骤(1)中所述的待测物人工偶联抗原是指小分子待测物与大分子蛋白质通过化学偶联方法制备的具有反应原性的全抗原；其中，该小分子待测物涵盖医学检验领域和食品安全检测领域所需要检测的所有小分子物质；偶联方法包括重氮法、碳二亚胺法、戊二醛法、混合酸酐法、琥珀酸酐法；该偶联的大分子蛋白包括牛血清白蛋白、卵清蛋白、钥孔血蓝蛋白；偶联比为1:5～1:100，偶联后透析纯化，得到所需的人工偶联抗原。
9.根据权利要求1～8任意所述的一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备成的免疫层析试纸条，其特征在于，该试纸条的组装包括以下步骤：
(1)在底板上搭接粘贴下述材料：滤纸、样本垫、喷涂有AuNC@PDA标记抗体复合物的玻璃纤维垫、喷涂有待测物偶联人工抗原或抗体作为检测线和抗鼠抗体/抗兔抗体作为质控线的硝酸纤维素膜和吸水纸，即组装成以AuNC@PDA为信标载体制备的免疫层析试纸条大板；
(2)组装好的试纸条大板，通过切刀切成需要的宽度，即为以AuNC@PDA为信标载体制备的免疫层析试纸条，该试纸条可以直接使用，也可以装入塑料卡壳中使用。
10.一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层析试纸条的应用，其特征，该试纸条的检测过程包括如下步骤：经过处理后的检测样本加样到以AuNC@PDA为信标载体制备的免疫层析试纸条上，加样体积为100～200μL，反应时间为5～30分钟，通过读取试纸条灰度数据后由内置标准曲线计算检测样本浓度来实现定量检测，或者通过肉眼观察检测线和质控线有无显色条带来实现对检测样本的定性判断。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113252902A (zh) * 2021-04-23 2021-08-13 西北农林科技大学 一种探针、检测试纸条及其应用
CN115015542A (zh) * 2022-04-17 2022-09-06 吉林迅准生物技术有限公司 一种呼吸道细菌联合检测装置及其制备方法
CN115248308A (zh) * 2022-07-01 2022-10-28 浙江大学 聚左旋多巴纳米颗粒在制备免疫层析检测试纸条中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104634973A (zh) * 2015-02-11 2015-05-20 曲阜师范大学 一种纳米金复合材料免疫传感器的制备方法及应用
CN105259158A (zh) * 2015-11-13 2016-01-20 暨南大学 一种表面增强拉曼散射免疫层析试纸条及制备方法与应用
CN110068688A (zh) * 2019-05-22 2019-07-30 福建农林大学 一种牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡
CN110665004A (zh) * 2019-09-29 2020-01-10 上海交通大学 一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104634973A (zh) * 2015-02-11 2015-05-20 曲阜师范大学 一种纳米金复合材料免疫传感器的制备方法及应用
CN105259158A (zh) * 2015-11-13 2016-01-20 暨南大学 一种表面增强拉曼散射免疫层析试纸条及制备方法与应用
CN110068688A (zh) * 2019-05-22 2019-07-30 福建农林大学 一种牛乳中乳铁蛋白竞争法纳米花免疫测流层析检测卡
CN110665004A (zh) * 2019-09-29 2020-01-10 上海交通大学 一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花及其制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杜雨晴等: "三维结构金纳米花的快速可控合成及其分析应用研究", 《分析测试学报》, vol. 31, no. 9, pages 46 - 51 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113252902A (zh) * 2021-04-23 2021-08-13 西北农林科技大学 一种探针、检测试纸条及其应用
CN113252902B (zh) * 2021-04-23 2023-04-28 西北农林科技大学 一种探针、检测试纸条及其应用
CN115015542A (zh) * 2022-04-17 2022-09-06 吉林迅准生物技术有限公司 一种呼吸道细菌联合检测装置及其制备方法
CN115248308A (zh) * 2022-07-01 2022-10-28 浙江大学 聚左旋多巴纳米颗粒在制备免疫层析检测试纸条中的应用
CN115248308B (zh) * 2022-07-01 2024-05-31 浙江大学 聚左旋多巴纳米颗粒在制备免疫层析检测试纸条中的应用

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