CN112142833A - 一种呋塞米人工抗原、抗体及其在检测呋塞米中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种呋塞米人工抗原、抗体及其在检测呋塞米中的应用，所述呋塞米人工抗原是在2,4‑二氯‑5‑磺酰胺基苯甲酸的羧基上偶联载体蛋白得到；所述抗体为将所述呋塞米人工抗原免疫动物后得到。本发明以2,4‑二氯‑5‑磺酰胺基苯甲酸作为特定半抗原结构替代分析对象呋塞米制备人工抗原；免疫动物获得高特异性呋塞米抗体，其对呋塞米的最低检测限为0.58ng/mL，半抑制浓度为12.6ng/mL；并建立了保健食品中呋塞米的免疫快速检测方法，实现了快速检测保健食品中呋塞米零的突破，对减肥类保健食品非法添加药物的安全监管具有重大意义。

Description

一种呋塞米人工抗原、抗体及其在检测呋塞米中的应用
技术领域
本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种呋塞米人工抗原、抗体及其在检测呋塞米中的应用。
背景技术
呋塞米(INN)又称4-氯-2-[(2-呋喃基甲基)-氨基]-5-氨磺酰苯甲酸，属于BCS IV类药物。它是一种袢利尿药，其作用机制主要为通过改变肾脏中相关酶的活性或细胞膜的通透性，加速或抑制细胞的代谢，从而加速排出体内水分。在医疗领域其通常用于治疗水肿，充血性心力衰竭，肾衰竭和高血压，但是过量或长期服用时会出现呕吐，头晕，虚弱，肾功能损伤，低钾血症等症状，严重时有可能危及生命。近年来，一些不法商家在利益的驱使下，铤而走险往产品中非法添加呋塞米这一利尿剂，使食用者的体重通过排出更多尿液的方式下降。这种做法不但违法我国《食品安全法》，而且会对消费者的身体带来危害。
2010年，国家食品药品监督管理局发布了《关于印发保健食品安全风险监测有关检测目录和检测方法的通知》(食药监办许〔2010〕114号)，第一次将质谱法作为减肥类保健食品中呋塞米的法定检测方法。2017年，在国家市场监督管理总局发布的《保健食品中75种非法添加化学药物的检测》食品补充检验方法中也包含了呋塞米的液相色谱-串联质谱检测方法。例如中国专利CN102901780A、CN108061777A和CN108387671A等均公开了色谱-质谱联用检测中药、保健食品或化妆品中非法添加减肥类化学成分呋塞米的方法，这些方法虽然准确度高，但仪器设备昂贵、样品前处理复杂繁琐、检测成本高且需要专业人员操作，不适合现场即时检测，不能满足食品安全监管中的现场快速、简单检测的的要求。因此，开发出一种快速、简单的减肥保健食品中呋塞米的快速检测方法，具有重要意义。免疫学检测具备快速、简便等特点，而上述方法建立的关键在于设计出合适的呋塞米人工抗原并获得灵敏度高、特异性强的抗体，但是现有技术中目前还未见有关于呋塞米人工抗原、抗体的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种呋塞米人工抗原的制备方法。
本发明的第二个目的是提供一种呋塞米抗体。
本发明的第三个目的在于提供所述呋塞米人工抗原、抗体在检测呋塞米中的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种呋塞米人工抗原的制备方法，是在2,4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸的羧基上偶联载体蛋白。
免疫检测的关键点之一在于设计出合适的呋塞米半抗原，前期研究过程中发现直接用呋塞米作为半抗原偶联蛋白，免疫效果不好，可能是呋塞米结构较复杂，羧基偶联蛋白后不能完整地把药物结构暴露出来。本发明通过创造性研究后选择以2,4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸作为特定半抗原结构替代分析对象呋塞米作为半抗原，与载体蛋白偶联获得人工抗原，其免疫动物后可获得高特异性呋塞米抗体，从而为建立保健食品中呋塞米的免疫快速检测方法提供基础。
优选地，所述偶联为通过活泼酯法。
优选地，所述载体蛋白为大豆蛋白(conA)。
作为一种优选地可实施方式，所述呋塞米人工抗原的制备方法的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取2mg 2,4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸(INN1)，1mg NHS和2mg EDC溶解于150μL DMF中，室温下避光搅拌4小时，得到INN1活化液；
(2)10mg大豆蛋白(conA)加入到1mL的PBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中；
(3)将INN1活化液缓慢逐滴加入conA溶液中，4℃反应12小时；
(4)用PBS缓冲液透析两天，每天4次，透析结束后将蛋白溶液定容到2ml，得到5mg/ml蛋白偶联物，即呋塞米免疫原(人工抗原)INN1-conA。
本发明还请求保护上述任一所述的制备方法得到的呋塞米人工抗原。
本发明还请求保护所述呋塞米人工抗原作为免疫原在制备呋塞米多克隆抗体中的应用。
一种呋塞米多克隆抗体的制备方法，是将上述任一所述呋塞米人工抗原与免疫佐剂混匀后免疫动物，采血、分离上清，纯化得到呋塞米多克隆抗体。
优选地，是将上述任一所述呋塞米人工抗原溶液与等量佐剂混合乳化后免疫新西兰大白兔，初次免疫与弗氏完全佐剂混合乳化后免疫，加强免疫使用免疫原与弗氏不完全佐剂乳化后免疫，当效价不再上升时，采血、分离上清，辛酸-硫酸铵法纯化得到呋塞米多克隆抗体。
作为一种优选地可实施方式，所述呋塞米多克隆抗体的制备方法，将新西兰大白兔分别采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。一周后心脏采血，水浴，4℃、10000rpm离心15min，取上清即为抗血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化的到多克隆抗体。
本发明还请求保护上述任一所述制备方法制备得到的呋塞米多克隆抗体。
本发明还请求保护所述的呋塞米多克隆抗体在保健食品中呋塞米的免疫快速检测中或在制备呋塞米免疫检测产品中的应用。
优选地，所述产品为胶体金快速检测卡或免疫试剂盒。
本发明还提供一种呋塞米胶体金快速检测卡，包括底板和依次排列在底板上上的样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫，所述结合垫内吸附有胶体金标记的上述任一所述呋塞米多克隆抗体，所述纤维素膜上印有隐形检测线和隐形质控线，所述隐形检测线采用包被原溶液印制，所述隐形质控线采用羊抗兔抗体印制；所述包被抗原是以呋塞米作为半抗原偶联载体蛋白得到。
利用上述胶体金试纸条对样品进行检测，通过肉眼定性判断，确定可视检测限。
本发明还提供一种检测呋塞米的酶联免疫试剂盒，包含包被有包被原的酶标板、呋塞米标准品溶液、呋塞米克隆抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液；所述包被抗原是以呋塞米作为半抗原偶联载体蛋白得到；所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的呋塞米多克隆抗体；所述呋塞米克隆抗体为上述任一所述呋塞米多克隆抗体。
优选地，所述包被抗原为以呋塞米作为半抗原通过活泼酯法偶联阳离子牛血清白蛋白(cBSA)得到。
基于2,4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸作为特定半抗原制备得到上述呋塞米人工抗原和多克隆抗体，本发明还提供2,4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸作为半抗原在制备呋塞米人工抗原中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明以2,4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸作为特定半抗原结构替代分析对象呋塞米制备人工抗原；免疫动物获得高特异性呋塞米抗体，其对呋塞米的最低检测限为0.58ng/mL，半抑制浓度为12.6ng/mL；并建立了保健食品中呋塞米的免疫快速检测方法，实现了快速检测保健食品中呋塞米零的突破，对减肥类保健食品非法添加药物的安全监管具有重大意义。
附图说明
图1为呋塞米免疫原合成路线；其中conA为大豆蛋白。
图2为呋塞米免疫原的紫外扫描鉴定图。
图3为呋塞米包被原合成路线。
图4为呋塞米包被原的紫外扫描鉴定图。
图5为呋塞米抗体间接竞争ELISA标准曲线。
图6为呋塞米胶体金免疫层析试纸条的侧面示意图，其中1：PVC底板；2：样品垫；3：结合垫；4：NC膜；5：检测线(T点)；6：质控线(C点)；7：吸水垫。
图7为呋塞米胶体金免疫层析试纸条检测结果判定图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1呋塞米免疫原的合成与鉴定
1、呋塞米免疫原的合成方法
以2,4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸作为半抗原，通过活泼酯法偶联大豆蛋白(conA)，合成INN1-conA，合成路线如图1所示。
(1)准确称取2mg 2,4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸，1mg NHS和2mg EDC溶解于150μLDMF中，室温下避光搅拌4小时，得到INN1活化液；
(2)10mg大豆蛋白(conA)加入到1mL的PBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中；
(3)将INN1活化液缓慢逐滴加入conA溶液中，4℃反应12小时；
(4)用PBS缓冲液透析两天，每天4次，透析结束后将蛋白溶液定容到2ml，得到5mg/ml蛋白偶联物，即呋塞米免疫原INN1-conA，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
其中，PBS缓冲液的配方：Na2HPO4·12H2O 2.90g，NaCl 8.50g，KCl 0.20g，KH2PO40.20g，加蒸馏水定容至1000mL。
2、呋塞米免疫原的鉴定
取上述合成的呋塞米免疫原，进行紫外扫描，结果如图2所示。
具体地，conA、免疫原、半抗原分别进行紫外(200～300nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现呋塞米免疫原INN1-conA的吸收曲线与载体蛋白conA明显不同，INN1在250nm处有一个特征峰，而偶联反应后，在250nm处，INN1-conA的吸收峰明显比conA高，且对比INN的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白与INN1的复合物，偶联成功。
实施例2呋塞米包被原的合成与鉴定
1、载体蛋白阳离子化
(1)称取0.675g牛血清白蛋白BSA(0.015mmol)和56mg乙基-[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺(EDC)(0.3mmol)溶于20mL PBS缓冲液(0.01moL/L，pH 7.4)，置于磁力搅拌器上室温搅拌30min，使其充分溶解；
(2)将上述制备的缓冲液缓慢加入到溶解有18mg乙二胺的(0.3mmol)20mL PBS缓冲液(0.01moL/L，pH 7.4)中，置于磁力搅拌器上室温搅拌120min；
(3)将所制备的混合溶液转移至透析袋中，以PBS缓冲液(0.01moL/L，pH 7.4)为透析液，置于4℃环境下搅拌透析3天，每6h更换一次透析液，以除去过量的乙二胺将透析后的溶液在4000r/min、4℃下离心30min，收集上清液冻干，白色絮状固体，即为阳离子牛血清白蛋白，记为cBSA，-20℃保存。
2、呋塞米包被原的合成方法
以呋塞米作为半抗原，通过活泼酯法偶联cBSA，合成INN-cBSA，合成路线如图3所示。
(1)准确称取2mg呋塞米，1mg NHS和2mg EDC溶解于150μL DMF中，室温下避光搅拌4小时，得到INN活化液；
(2)10mg cBSA加入到1mL的PBS缓冲液(0.01moL/L，pH＝7.4)中；
(3)将INN活化液缓慢逐滴加入cBSA溶液中，4℃反应12小时；
(4)用PBS缓冲液透析两天，每天4次，透析结束后将蛋白溶液定容到2ml，得到5mg/ml蛋白偶联物，即呋塞米包被原INN-cBSA，分装于离心管中，于-20℃保存，以供使用。
3、呋塞米包被原的鉴定
取上述合成的呋塞米包被原，进行紫外扫描，结果如图4所示。
具体地，cBSA、包被原、半抗原分别进行紫外(200～400nm)扫描鉴定，并通过比较偶联前后的各物质的最高吸光值，发现呋塞米包被原INN-cBSA的吸收曲线与载体蛋白cBSA明显不同，INN在350nm处有一个特征峰，载体蛋白cBSA仅在280nm处有特征峰，而偶联反应后，INN-cBSA在350nm处有一明显吸收峰，且对比INN的曲线可看出发生显著位移。由于在偶联后的透析过程已经将未反应的药物等小分子成分全部透析去除，因此偶联产物出现的药物特征峰是由蛋白结合的药物分子贡献的，故说明反应产物是载体蛋白与INN的复合物，偶联成功。
实施例3呋塞米多克隆抗体的制备
将制备好的免疫原INN1-CONA与等量的免疫佐剂(第一次免疫用不完全弗氏佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫动物。将2.5-3kg的新西兰大白兔分别采用背部皮下、各部位皮下、腿部肌肉和耳缘静脉多种注射方式免疫，4周后第二次免疫，以后每间隔3周加强免疫一次。第三次加强免疫后1周耳缘静脉取血，并利用间接竞争ELISA测定血清效价。当效价不再上升时，采用耳缘静脉加强免疫。一周后心脏采血，水浴0.5～1h，4℃、10000rpm离心15min，取上清即为抗血清。抗血清采用硫酸铵沉淀法纯化的到多克隆抗体，于-20℃冻存备用。
间接竞争ELISA测定抗体阳性滴度以2.1倍于阴性血的测定值为准，结果表明半抗原INN1-conA对应的抗血清效价为1:64000。
实施例4抗体的特异性及灵敏度测定
依据如上效果，使用抗血清绘制酶联免疫分析(ELISA)标准曲线；使用磷酸吐温缓冲液(PBST，0.1mol/L，pH＝7.4)作为所有样品的稀释液，使用INN-cBSA作为包被原：将50μL系列浓度的呋塞米药物标准品和50μL适当稀释倍数的呋塞米多特异性抗体加入96孔酶标板中，竞争反应后通过酶标分析仪测定吸光值(OD)。以OD值为纵坐标，相应的标准品浓度对数值为横坐标，应用origin软件四参数对函数进行曲线拟合：y＝(A-D)/[1+(X/C)B]+D，其中，A和D分别代表药物浓度最小和最大的吸光值(OD)，C为中点浓度，当标准品浓度等于C时的OD值为(A+D)/2，正处于曲线的拐点处，半数抑制量浓度为IC50，B表示曲线的陡峭程度，称斜率因子：以IC10为检测限，以IC20～IC80为检测范围。以呋塞米为标准品建立ELISA的标准曲线，最低检测限为0.58ng/mL，半抑制浓度为12.6ng/mL。结合图5可知，以呋塞米为标准品建立的标准曲线具备典型的S型曲线，检测灵敏度好。
实施例5检测呋塞米残留的酶联免疫试剂盒的开发
1、酶结合物
辣根过氧化物酶标记的呋塞米多克隆抗体。
2、酶标板的制备
用包被缓冲液将包被原稀释成1μg/mL，每孔加入100μL，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μL封闭液，25℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。
3、检测呋塞米的酶联免疫试剂盒的组建
组建检测呋塞米的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：
(1)包被原(呋塞米半抗原与蛋白的偶联物)处理过的酶标板；
(2)呋塞米标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L，0.1μg/L，1μg/L，10μg/L，100μg/L，1000μg/L。
(3)辣根过氧化物酶标记的呋塞米多克隆抗体。
(4)底物显色液由A液和B液组成，A液为过氧化脲，B液为四甲基联苯胺；
(5)终止液为2mol/L硫酸；
(6)洗涤液为pH值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01‰～0.03‰叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比；
4、实际样品检测
将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。根据需要量将酶结合物浓缩液用酶结合物稀释液按1:10体积比进行稀释(即1份酶结合物浓缩液加入10份酶结合物稀释液，现配现用)。加入标准品/样本50μL到对应的微孔中，然后加入酶结合物工作液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min。将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4-5次，每次间隔10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。加入底物液A液50μL/孔，再加入底物液B液50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min。加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。
5、检测结果分析
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值(双孔)除以第一个标准品(0标准)的吸光度值的平均值，再乘以100％，得到标准品或样本的百分吸光度值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以呋塞米标准品浓度(μg/L)的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中呋塞米的实际浓度。
实施例6呋塞米胶体金快速检测方法
1、金标抗体和金标结合物垫的制备
采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，制备平均直径在40nm的胶体金悬浮液。在回流条件下，把100mL 0.01％的氯金酸溶液加热至沸腾，不停的搅拌，迅速加入1.1mL 1％的柠檬酸三钠。当反应溶液颜色变成葡萄红色时继续加热搅拌5min。冷却至室温后，加入0.05％的叠氮化钠4℃保存。
胶体金在与抗体标记前以0.2mol的K2CO3溶液调到pH为8.2左右，采用经典NaCl滴定法确定30μg抗体标记1mL胶体金溶液。然后按最佳标记量进行标记，标记1小时后，搅拌下加入10％BSA(使最终BSA浓度为1％)，孵育1小时后4℃10000rpm离心25min，并去上清。加入胶体金溶液同体积的5％BSA溶液重悬，4℃10000rpm离心25min，重复两次。最后，用1/5胶体金溶液体积的TB溶液(含3％BSA、3％蔗糖、0.01mol/L硼酸钠和0.05％叠氮化钠)重悬，4℃保存。用XYZ-3000三维喷膜仪把4％的BSA溶液以8μL/cm的量喷在玻璃棉上，使用干燥箱42℃干燥50min，再把金标记抗体以6μL/cm的量喷在玻璃棉上，干燥箱42℃干燥50min，真空干燥保存。
2、偶联抗原羊抗兔包被纤维素膜
用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为1mg/mL的包被抗原以1.2μL/cm的量喷在纤维素膜的偏下侧，作为检测线。用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为120μg/L的羊抗兔IgG以1.2μL/cm的量喷在纤维素膜的偏上侧，作为对照线，两线间隔8mm。
3、快速试纸条的组装
如图6所示，把纤维素膜4粘贴在衬板1中间部位上，吸水垫7粘贴在纤维素膜4上侧和纤维素膜4重叠1mm。金标结合物垫3粘贴在纤维素膜4下方重叠1mm。样品垫2粘贴在金标结合物垫3下方重叠2mm。组装好的试纸板用斩切机切成3.05mm宽的试纸条。
4、检测样品液的制备
根据保健品的形态不同作不同方式的前处理
口服液等液态保健品，取100μL加到900μL PBST当中，得到样品液。
片剂：去外层糖衣，研磨成粉，将粉末用5倍体积处理液(含50％甲醇的碳酸盐缓冲液，pH 9.6)溶解，涡旋3min，3000r/min离心6min取上清100μL加到900μL PBST当中，得到样品液。
胶囊：去囊衣，将粉末用5倍体积处理液(含50％甲醇的碳酸盐缓冲液，pH9.6)溶解，涡旋3min，3000r/min离心6min取上清100μL加到900μL PBST当中，得到样品液。
5、快速检测试纸条检测及判断
当待测样品溶液加入试纸条或试纸卡测试端后，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫3中的金标抗体一起向纤维素膜4扩散，并最终渗入吸水垫7端。在扩散过程中，如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合，进而占据了金标抗体上的抗原结合点，阻止金标抗体与纤维素膜4上隐形检测线5(半抗原与载体蛋白的结合物)的结合，使隐形检测线5不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有待测样品时，金标抗体在上移过程中，遇隐形检测线5显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。同样，金标抗体也与纤维素膜4上的隐形对照线6(羊抗兔IgG)结合，使隐形对照线6显红色。隐形对照线6颜色的有或无分别表示此试纸条的有效或无效，判定结果如图7所示。
6、检出限的测定
往空白口服液，硬胶囊，软胶囊，片剂样品中添加一系列浓度的标准药物，经样品前处理，用上述胶体金试纸条对样品进行检测，通过肉眼定性判断，确定可视检测限。具体结果见下表。
Figure BDA0002699563110000101

Claims (10)

1.一种呋塞米人工抗原的制备方法，其特征在于，是在2,4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸的羧基上偶联载体蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述偶联为通过活泼酯法。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述载体蛋白为大豆蛋白。
4.权利要求1～3任一所述的制备方法得到的呋塞米人工抗原。
5.一种呋塞米多克隆抗体的制备方法，其特征在于，将权利要求4所述呋塞米人工抗原与免疫佐剂混匀后免疫动物，采血、分离上清，纯化得到呋塞米多克隆抗体。
6.权利要求5所述制备方法制备得到的呋塞米多克隆抗体。
7.权利要求6所述呋塞米多克隆抗体体在保健食品中呋塞米的免疫快速检测中或在制备呋塞米免疫检测产品中的应用。
8.一种呋塞米胶体金快速检测卡，其特征在于，包括底板和依次排列在底板上上的样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫，所述结合垫内吸附有胶体金标记的权利要求6所述呋塞米多克隆抗体，所述纤维素膜上印有隐形检测线和隐形质控线，所述隐形检测线采用包被抗原溶液印制，所述隐形质控线采用羊抗兔抗体印制；所述包被抗原是以呋塞米作为半抗原偶联载体蛋白得到。
9.一种检测呋塞米的酶联免疫试剂盒，其特征在于，包含包被有包被原的酶标板、呋塞米标准品溶液、呋塞米克隆抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液；所述包被抗原是以呋塞米作为半抗原偶联载体蛋白得到；所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的呋塞米多克隆抗体；所述呋塞米克隆抗体为权利要求6所述呋塞米克隆抗体。
10.2,4-二氯-5-磺酰胺基苯甲酸作为半抗原在制备呋塞米人工抗原中的应用。
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