CN101477124B - 一种检测三聚氰胺的方法及其专用试纸 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测三聚氰胺的方法及其专用试纸。该试纸包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的三聚氰胺特异性抗体；所述三聚氰胺特异性抗体为三聚氰胺多克隆抗体或三聚氰胺单克隆抗体；所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有半抗原和载体蛋白的偶联物，质控区包被有抗抗体。用本发明试纸检测三聚氰胺的方法，简便、快速、直观、准确，适用范围广，成本低，易推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测三聚氰胺的方法及其专用试纸。
背景技术
三聚氰胺是一种三嗪类含氮杂环有机化合物。其含氮量高达66％，白色单晶斜晶体，无味。因其易于购买和生产，成本低，固有不法厂商针对凯氏定氮法的不足，将其添加于食品和饲料中以提高蛋白含量，获取利益。虽然三聚氰胺属于低毒性化合物，但其在动物体内会代谢为三聚氰酸，三聚氰胺与三聚氰酸发生反应并累积，可引起膀胱结石和泌尿道病变。膀胱结石长期刺激，可出现膀胱肿瘤。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、适合大规模推广的检测方法
目前，三聚氰胺残留量的常规检测方法有两种一种是色谱分析，如高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱/质谱法(LC/MS)、液相色谱串联质谱(LC/MSMS)，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程，不适合现场监控和大量样本筛查。另一种为免疫学方法，如酶联免疫吸附法(ELISA)。它的缺点是检测时间长，费用较高，不利于在基层单位进行推广使用，并且都需要专业技术人员检测。目前，三聚氰胺残留量的常规检测方法主要有液相色谱/质谱法(LC/MS)、高效液相色谱(HPLC)、液相色谱串联质谱(LC/MSMS)等，但是这些方法存在着仪器设备复杂、检测过程繁琐和对检验人员的技能要求高的缺点，不适合现场监控和大量样品的筛查。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测三聚氰胺的试纸。
本发明所提供的检测三聚氰胺的试纸，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的三聚氰胺特异性抗体；三聚氰胺特异性抗体可为三聚氰胺多克隆抗体或三聚氰胺单克隆抗体；反应膜上包被有检测区和质控区；当三聚氰胺特异性抗体为三聚氰胺多克隆抗体时，检测区包被三聚氰胺-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗兔抗抗体；当三聚氰胺特异性抗体为三聚氰胺单克隆抗体时，检测区包被三聚氰胺-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗鼠抗抗体；所述半抗原如下：
其中，所述结合物释放垫中有1/3-1/2区域被所述样品吸收垫覆盖。
所述反应膜包被有检测区和质控区，其中所述的检测区位于近于所述结合物释放垫的末端的一侧，所述质控区位于远离所述结合物释放垫的末端的一侧；所述检测区距所述结合物释放垫的末端5-8mm，优选为6mm；所述质控区距所述检测区4-7mm，优选为5mm。
所述检测区和所述质控区均为与所述试纸的长相垂直的条带状。
所述结合物释放垫包被胶体金标记的三聚氰胺单克隆抗体，其包被密度为0.1-0.2ug/cm2，优选0.1ug/cm2。
所述三聚氰胺单克隆抗体为由保藏号为CGMCC No.2716的对三聚氰胺药物单克隆杂交瘤细胞株C-3-4分泌产生的抗体；所述抗抗体可为羊抗鼠IgG；所述载体蛋白可为卵血清蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、血蓝蛋白或甲状腺蛋白等。
所述试纸中包括底板，所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫固定在所述底板上。
所述试纸具体可为条状；为了便于使用，所述条状的试纸可以覆盖有保护膜或装在盒内。
所述保护膜可以覆盖所述试纸的两端(如覆盖样品吸收垫、结合物释放垫和吸水垫)
所述盒由底座和盖构成，底坐和盖通过卡齿和卡孔相连接；所述底座上有与所述盖连接的卡齿和与所述试纸相匹配的凹槽；所述盖上有加样孔、观察窗和与底座卡齿相配的卡孔，所述加样孔的位置与所述样品吸收垫的位置相对应，所述观察窗与所述反应膜上的检测区和质控区相对应；所述试纸位于所述凹槽内；所述观察窗上印有T和C，T表示检测线，在靠近所述加样孔侧，C表示质控线，在远离所述加样孔侧。
底板可由不吸水的韧性材料制成，如硬质塑料、不吸水硬纸，具体可为PVC板材；样品吸收垫可由玻璃纤维棉、聚酯材料(聚酯丝或聚酯棉)、尼龙膜、聚偏二氟乙烯膜或聚酯膜制成；结合物释放垫可由玻璃纤维制成；吸水垫可为吸滤纸或虑油纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或为纯纤维素膜；所述保护膜可为PE材质的保护膜。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述试纸的方法。
本发明所提供的制备上述试纸的方法，是将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫依次连接；所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的三聚氰胺特异性抗体；所述三聚氰胺特异性抗体为三聚氰胺多克隆抗体或三聚氰胺单克隆抗体；所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有半抗原和载体蛋白的偶联物，质控区包被有抗抗体；
所述样品吸收垫在进行所述连接前，先在如下溶液中浸泡1-3h，再进行干燥：含0.3-0.5％(体积百分含量)鼠血清蛋白、pH值为9.6-10.0、0.1-0.2mol/L的碳酸盐缓冲液；
所述包被有胶体金标记的三聚氰胺特异性抗体的结合物释放垫是按照如下方法制备的：将包被前的结合物释放垫先在如下溶液中浸泡20-40秒，干燥，再进行所述胶体金标记的三聚氰胺特异性抗体包被：含有0.8-1.2％(体积百分含量)牛血清白蛋白、pH值为7.2-7.8、0.1-0.2mol/L硼砂-硼酸缓冲液。
上述方法中，使所述结合物释放垫中有1/3-1/2区域被所述样品吸收垫覆盖。
所述反应膜包被有检测区和质控区，其中所述的检测区位于近于所述结合物释放垫的末端的一侧，所述质控区位于远离所述结合物释放垫的末端的一侧；所述检测区距所述结合物释放垫的末端5-8mm，优选为6mm；所述质控区距所述检测区4-7mm，优选为5mm。
上述方法中所用的三聚氰胺单克隆抗体为由保藏号为CGMCC No.2716的对三聚氰胺药物单克隆杂交瘤细胞株C-3-4分泌产生的抗体。
本发明的另一个目的是提供一种检测三聚氰胺的方法。
本发明所提供的检测三聚氰胺的方法，是将待检测样品进行前处理，然后用上述任一所述试纸进行检测；所述前处理的方法如下：
当所述样品为牛奶时，样品前处理的方法为：将牛奶与0.05-0.1M磷酸盐缓冲液以1∶15-25的体积比混匀，取样用于检测；
当所述样品为奶粉时，样品前处理的方法为：将每1g奶粉溶于18-25ml、pH为6.0-6.8、0.01-0.02M磷酸盐缓冲液中，超声10-20min，离心，取样用于检测；
当所述样品为饲料时，样品前处理的方法为：将每1g饲料与9-15ml乙腈与盐酸的混合溶液混匀，超声提取10-15min，取1ml上清液，干燥，加入0.5-1.5ml正己烷混匀，再加入1.0-2.0ml 0.01-0.02M磷酸盐缓冲液混匀，离心，取下层水相用于检测；所述乙腈与盐酸的混合溶液中乙腈与0.05-0.1M盐酸的体积比为4-6∶1。
本发明试纸的检测原理：当在试纸的样品吸收垫端滴加待测样品溶液后，待检溶液通过结合物释放垫中的金标抗体一起向反应膜扩散，并最终渗入滤纸中；若待检测样品溶液中三聚氰胺的含量高，则扩散过程中待检测样品溶液中的三聚氰胺可与金标抗体相结合，进而完全封闭金抗体上三聚氰胺的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上偶联三聚氰胺载体蛋白的检测印迹结合，不能显示检测印迹，检测区不显色，而羊抗鼠IgG抗体则可与金标抗体结合，质控区显色，形成一条红色对照印迹“|”，呈一条印迹为阳性；若待检测样品溶液中三聚氰胺的含量低或无，则金标抗体上的抗原结合位点不能被封闭，进而金标抗体会与纤维素膜上偶联三聚氰胺的载体蛋白检测印迹结合，检测区显示红色印迹“|”，同样羊抗鼠IgG抗体也与金标抗体结合，质控区也显示红色对照印迹“|”，形成两条红线“||”阴性标记；如果纤维素膜上没有红色标记显示，则试纸无效。
本发明的胶体金试纸具有敏感度高、特异性高、精密度高、准确度高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的三聚氰胺单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将结合物释放垫部分区域用样品吸收垫覆盖，能够延长检测结果观察时间，同时也使待检测样品溶液被充分吸收进而能与金标抗体完全接触、充分反应，从而减少误差；试纸上单克隆抗体包被量的设计、检测区与结合物释放垫之间的距离及质控区与检测区的距离的设计都进一步提高了试纸检测的精确度。用本发明试纸检测三聚氰胺的方法，简便、快速、直观、准确，适用范围广，成本低，易推广应用。
附图说明
图1为试纸剖面结构示意图。
图2为带有保护膜的试纸的俯视图。
图3为带有试纸盒的试纸的剖面结构示意图。
图4为带有试纸盒的试纸的检测结果的判断。
图5为三聚氰胺与溴乙酸叔丁酯反应中产生的中间产品I。
图6为中间产品I通过水解反应得半抗原。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、检测三聚氰胺的试纸的构成
一、不带有保护膜或试纸盒的试纸(图1)：
所述试纸由样品吸收垫1、结合物释放垫2、反应膜3、吸水垫4和底板7组成；
所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫依次按顺序黏贴在所述底板上，结合物释放垫从其始端起有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；
所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的由保藏号为CGMCC No.2716的对三聚氰胺药物单克隆杂交瘤细胞株C-3-4分泌的抗体，包被量为0.1ug/cm2。
所述反应膜上有检测区5和质控区6，检测区和质控区均为与所述试纸的长相垂直的条带状；检测区位于近于结合物释放垫末端的一侧，距结合物释放垫末端5mm；质控区位于远离结合物释放垫末端的一侧，距所述检测区4mm；检测区包被有三聚氰胺-载体蛋白偶联物(三聚氰胺半抗原和人血清白蛋白的偶联物)，质控区包被有羊抗鼠IgG；所述半抗原如下：
底板由PVC板材制成；样品吸收垫可由玻璃纤维棉制成；结合物释放垫由玻璃纤维制成；吸水垫为吸滤纸；反应膜为硝酸纤维素膜。
所述试纸为3-5mm宽的矩形条状。
二、带有保护膜的试纸(称作试纸条)(图2)：
所述试纸由样品吸收垫1、结合物释放垫2、反应膜3、吸水垫4和底板7组成；
所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫依次按顺序黏贴在所述底板上，结合物释放垫从其始端起有1/2区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；
所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的由保藏号为CGMCC No.2716的对三聚氰胺药物单克隆杂交瘤细胞株C-3-4分泌的抗体，包被量为0.2ug/cm2。
所述反应膜上有检测区5和质控区6，检测区和质控区均为与所述试纸条的长相垂直的条带状；检测区位于近于结合物释放垫末端的一侧，距结合物释放垫末端8mm；质控区位于远离结合物释放垫末端的一侧，距所述检测区7mm；检测区包被有三聚氰胺-载体蛋白偶联物(三聚氰胺半抗原和人血清白蛋白的偶联物)，质控区包被有羊抗鼠IgG；所述半抗原同一中所述相同。
将所述试纸两端黏贴保护膜，再用机器切成3-5mm宽的小条，优选3mm。
保护膜8-1覆盖在吸水垫上手柄端，保护膜8-2覆盖在样品吸收垫和结合物释放垫上的检测端，在样品吸收垫和结合物释放垫的交界处有隔离线并印有max字样。
底板由PVC板材制成；样品吸收垫由尼龙膜制成；结合物释放垫由玻璃纤维制成；吸水垫为虑油纸；反应膜为纯纤维素膜；所述保护膜为PE材质的保护膜。
三、带有试纸盒的试纸(称作试纸卡)(图3)
所述试纸由样品吸收垫1、结合物释放垫2、反应膜3、吸水垫4和底板7组成；
所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫依次按顺序黏贴在所述底板上，结合物释放垫从其始端起有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；
所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的由保藏号为CGMCC No.2716的对三聚氰胺药物单克隆杂交瘤细胞株C-3-4分泌的抗体，包被量为0.1ug/cm2。
所述反应膜上有检测区5和质控区6，检测区和质控区均为与所述试纸条的长相垂直的条带状；检测区位于近于结合物释放垫末端的一侧，距结合物释放垫末端6mm；质控区位于远离结合物释放垫末端的一侧，距所述检测区5mm；检测区包被有三聚氰胺-载体蛋白偶联物(三聚氰胺半抗原和人血清白蛋白的偶联物)，质控区包被有羊抗鼠IgG；所述半抗原同一中所述相同。
所述试纸装在试纸盒内；所述试纸盒由底座9和盖10构成，底坐和盖通过卡齿12和卡孔13嵌合连接；
所述底座上有与所述盖连接的卡齿12和与所述试纸相匹配的凹槽；
所述盖上有加样孔11、观察窗14和与底座相连的卡孔13(与卡齿相配)；所述加样孔的位置与所述样品吸收垫的位置相对应，所述观察窗与所述反应膜上的检测区和质控区相对应。所述观察窗上印有T和C，T表示检测线，在靠近所述加样孔侧，C表示质控线，在远离所述加样孔侧。
切好后的试纸位于盒底座的凹槽内，盒的盖和底座通过卡齿和卡孔连接成封闭系统。
底板由PVC板材制成；样品吸收垫由尼龙膜制成；结合物释放垫由玻璃纤维制成；吸水垫为虑油纸；反应膜为纯纤维素膜；所述保护膜为PE材质的保护膜。试纸卡中的盖由塑料制成，底座由塑料制成。
将上述试纸条或试纸卡均用铝箔袋真空包装，在18～25℃的环境中储存，有效期一年。
实施例2、实施例1中所述试纸的制备方法
一、试纸的制备
该试纸的制备方法主要包括如下步骤：
1)制备包被三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
2)制备含有包被三聚氰胺-载体蛋白偶联物的检测区和包被羊抗鼠IgG的质控区的反应膜；
3)将样品吸收垫、上述结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板组装成试纸。
4)将组装好的试纸两端黏贴保护膜；用机器切成3mm宽的小条；或者将组装好的试纸用机器切成3mm宽的小条，装在特制的塑料盒中。
下面分步详细叙述：
(一)各部件的制备
1、三聚氰胺-载体蛋白偶联物的合成与鉴定
三聚氰胺是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。
1)半抗原的合成
a、取0.5g(3.97mmol)三聚氰胺于干燥的50ml圆底烧瓶中，加35ml DMF搅拌溶解，取0.44g(7.93mmol)KOH、0.12g无水NaI加至上述溶液中，滴加0.646ml溴乙酸叔丁酯，充分混合后，加热升温65℃反应10h。反应结束后，冷却至室温，加水稀释，用乙酸乙酯萃取，干燥，旋蒸，得黄色油状物，乙酸乙酯∶石油醚＝2∶1过柱得产品I(如图5所示)；
b、取0.32g中间产品I用5ml甲醇溶解，再加入5ml三氟乙酸，室温搅拌20h。反应完成后旋蒸除去溶剂，得油状物，用甲醇与乙酸乙酯1∶1混合溶剂溶解，向溶液中滴加石油醚，直至有白色浑浊出现，加热使之变澄清，放置冷却，析出白色沉淀，真空抽滤，得半抗原产品(如图6所示)。
2)包被原的制备-三聚氰胺半抗原与人血清白蛋白偶联物的合成
将步骤(1)制备的半抗原10mg、40mg碳化二亚胺(DEC)和15mg N一羟基琥珀酰亚胺(NHS)充分溶解于1mL DMF中，在加热条件下搅拌24h，得到反应液I液；称取BSA 20mg，使之充分溶解在3.0mL PBS(pH 8.2)中，得到反应液II液(半抗原与牛血清白蛋白的摩尔配比为26∶1)；将I液缓慢加入到II液中，并于室温下搅拌5h，用0.01mol/L PBS缓冲液透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质，以12000rpm的速度离心30min，收集上清，得到半抗原与牛血清白蛋白的偶联物，分装，于-20℃保存备用。
3)免疫原的制备-三聚氰胺半抗原与甲状腺蛋白的合成
将步骤(1)制备的三聚氰胺半抗原10mg、40mg碳化二亚胺(DEC)和15mg N一羟基琥珀酰亚胺(NHS)充分溶解于1mL DMF中，在加热条件下搅拌24h，得到反应液I液；称取甲状腺蛋白25mg，使之充分溶解在3.0mL PBS(pH 8.2)中，得到反应液II液(半抗原与甲状腺蛋白的摩尔配比为18∶1)；将I液缓慢加入到II液中，并于室温下搅拌5h，用0.01mol/L PBS缓冲液透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质，以12000rpm的速度离心30min，收集上清，得到三聚氰胺半抗原与甲状腺蛋白的偶联物，分装，于-20℃保存备用。
4)三聚氰胺-载体偶联物的鉴定
将载体蛋白、三聚氰胺半抗原、三聚氰胺-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800nm范围内扫描，得到载体蛋白、三聚氰胺半抗原、三聚氰胺-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明三聚氰胺与载体蛋白偶联成功。
2、三聚氰胺单克隆抗体的制备
(1)制备单抗
a.动物免疫
将步骤(1)得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
b.细胞融合和克隆化
取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌三聚氰胺单克隆抗体的对三聚氰胺药物单克隆杂交瘤细胞株，将此细胞株命名为C-3-4，该细胞株已于2008年10月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2716。
c.细胞冻存和复苏
将杂交瘤细胞C-3-4用冻存液制成1×109个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
d.单克隆抗体的制备与纯化
增量培养法：将杂交瘤细胞CGMCC No.2716置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。
3、羊抗鼠抗抗体的制备：羊抗鼠IgG购自创生生物产地Genestsbio货号6102030。
4、三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物的制备
(1)胶体金的制备
用双蒸去离子水将1％氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成0.01％(质量百分含量)，置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100ml 0.01％氯金酸加入2ml 1％柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂，产品目录号BG11-AR-01KG)，继续煮沸，至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期为一个月。
(2)三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，按50-100μg抗体/ml胶体金的标准向胶体金溶液中加入上述三聚氰胺单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积百分含量)，静置30min。12000rpm、4℃离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度为50ug单抗/ml溶液，置4℃备用，保存60天。
复溶缓冲液：含牛血清白蛋白(BSA)、吐温-80和PVP-300吡咯烷酮的0.02M、pH9.0的硼酸溶液，其中牛血清白蛋白(BSA)在复溶缓冲液中的终浓度为0.02-0.1％(体积百分含量)，吐温-80在复溶缓冲液中的终浓度为0.05-0.2％(质量百分含量)，PVP-300吡咯烷酮在复溶缓冲液中的终浓度为0.3％(质量百分含量)。
5、将三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物包被到结合物释放垫
将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为有1.0％(体积百分含量))和pH值为7.6、0.2mol/L硼砂-硼酸缓冲液中浸湿30秒，37℃烘2h备用；用Biodot点膜仪将制备好的三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物均匀包被在结合物释放垫上，每5cm2结合物释放垫包被10μL三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物(即每平方厘米结合物释放垫包被0.1ug抗体)，真空干燥，真空封装，置4℃备用。
还可以每5cm2结合物释放垫包被20μL三聚氰胺单克隆抗体-胶体金标记物，即得到每平方厘米包被0.2ug抗体的结合物释放垫。
6、样品吸收垫的准备：将样品吸收垫置于含鼠血清蛋白(鼠血清蛋白在缓冲液中的终浓度为0.4％(体积百分含量))、pH为9.9、0.1mol/L碳酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘2h备用；
7、反应膜的制备
包被过程：用磷酸缓冲液将三聚氰胺-牛血清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区，包被量为0.7μg/cm2；用0.01M、pH 7.4PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200μg/ml，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区，包被量为0.7μg/cm2。
封闭：将包被好的反应膜至于37℃，2小时后密封保存。
封闭液：含人血清白蛋白(人血清白蛋白在封闭液中的终浓度为0.5％(质量百分含量))、蔗糖(蔗糖在封闭液中的终浓度为0.5％(质量百分含量))、pH值为7.0、0.05mol/L Tris-缓冲液。
(二)各部件的组装
1、含有保护膜的试纸的组装：
将所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序黏贴在所述底板上；结合物释放垫从其始端起有1/2区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；在组装好试纸两端黏贴保护膜，再用机器切成3mm宽的小条。
将试纸用铝箔袋真空包装，在18～25℃的环境中储存，有效期一年。
2、含有试纸盒的试纸的组装：
将所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次按顺序黏贴在所述底板上；结合物释放垫从其始端起有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；将试纸用机器切成3mm宽的小条，装在试纸盒里。将试纸用铝箔袋真空包装，在18～25℃的环境中储存，有效期一年。
二、试剂盒的敏感性和特异性检验
(一)敏感性试验
将三聚氰胺标准品(北京艾杰尔科技有限公司，CAS：108-78-1)稀释成如下不同浓度：0、0.05、0.1、0.15、0.3mg/L；所用的稀释液的组成为：含有在稀释液中的终浓度为8％(质量百分含量)的DMSO、pH为6.6、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。
分别用试纸条和试纸卡进行检测。每次向样品吸收垫滴加1ml样品，结果为：滴试0、0.05mg/L浓度时，试纸条上显示出肉眼可见的两条红色条线，呈阴性；当滴试0.1mg/L浓度时，试纸卡也出现肉眼可见的两条红色条线，但检测区颜色很淡很模糊，呈阳性；当滴试0.15、0.3mg/L浓度的标准液时试纸卡检测区不显色，呈阳性。表明，本试纸卡检测三聚氰胺的灵敏度为0.1mg/L。
(二)特异性试验
特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。本试纸条对三聚氰胺检测灵敏度为0.1mg/L，将三聚氰胺类似物(三聚氰酸、三嗪、三嗪二胺)按0，0.05，0.1，0.6，2，5，10mg/L进行稀释，用实施例1中所述的两种试纸分别进行检测，结果如表1所示，三聚氰酸、三嗪、三嗪二胺药物在5mg/L浓度时试纸卡检测线均显色，可以得出三聚氰胺对以上药物的交叉反应率均小于1％。
表1、特异性试验结果
实施例3、试纸的应用
一、用实施例1中所述试纸检测三聚氰胺
本发明的试纸可以检测牛奶样品、奶粉样品和饲料样品。一般的检测方法如下：
1、样品的处理：
牛奶样品：取1ml牛奶样本用19ml的0.05M磷酸盐缓冲液稀释并混匀，取样进行检测；
奶粉样品：取1g奶粉溶于20ml的0.1M磷酸盐缓冲液(pH＝6.7)中，超声10min，离心，取样进行检测；
饲料：取3g匀质后的饲料与30ml乙腈-0.1M盐酸(V∶V＝84∶16)混匀，超声提取15min，取1ml上清液，50℃水浴吹干，加入2ml正己烷混匀，再加入4ml 0.02M磷酸盐缓冲液混匀，离心，取样用于检测。
2、检测方法及判断
向本试纸中的样品吸收垫中滴加需检测的样品溶液后，在10分钟内观看检测结果。
三聚氰胺药物在样品中浓度高于试纸的样本最低检测限时，胶体金抗体与三聚氰胺结合，从而在检测区内因为竞争反应不会与三聚氰胺偶联物结合而不出现红色条带，呈阳性。阴性样品在检测过程中由于缺少抗体抗原竞争反应，将会在检测区与质控区内出现红色条带。如图4所示。
阳性：当质控区显示出红色条带，而检测区不显色时，判为阳性。(图4A)
阴性：当质控区显示出红色条带，检测区同时也显示出红色条带，判为阳性。(图4B)
无效：当质控区不显示出红色条带，则无论测试区显示出红色条带与否，该试纸卡判为无效。(图4C)
下面具体举例：
取已知含有三聚氰胺浓度大于2mg/kg(mg/L)的牛奶、奶粉样本和三聚氰胺浓度大于4mg/kg的饲料阳性样品各20份和三聚氰胺浓度小于2mg/kg(mg/L)的牛奶、奶粉样本和浓度小于4mg/kg的饲料阴性样品20份，用3个批次生产的试纸分别进行检测，(每批试纸条和试纸卡各10个)计算其阴阳性率。结果如表2和表3所示。
表2、检测阳性样本结果
表3、检测阴性样本结果
结果表明：用3个批次生产的试纸条和试纸卡检测阳性牛奶、奶粉、饲料样本时，阳性符合率都为100％；检测20份阴性牛奶样本时结果出现了2份阳性，检测20份阴性奶粉样本时结果出现了3份阳性，检测20份阴性饲料样本时结果出现了3份阳性，其牛奶阴性符合率均为98％以上；奶粉、饲料阴性符合率均为96％以上。说明本发明的检测三聚氰胺试纸可以对三聚氰胺进行快速检测。
Claims (13)
1.一种检测三聚氰胺的试纸，包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫，其依次连接；所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的三聚氰胺特异性抗体；所述三聚氰胺特异性抗体为三聚氰胺单克隆抗体；所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有半抗原和载体蛋白的偶联物，质控区包被有抗抗体；所述半抗原如下：
所述三聚氰胺单克隆抗体为由保藏号为CGMCC No.2716的对三聚氰胺药物单克隆杂交瘤细胞株C-3-4分泌产生的抗体；所述抗抗体为羊抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述的试纸，其特征在于：所述样品吸收垫与所述结合物释放垫的连接方式为所述结合物释放垫中有1/3-1/2区域被所述样品吸收垫覆盖。
3.根据权利要求1或2所述的试纸，其特征在于：所述检测区位于近于所述结合物释放垫的末端的一侧，所述质控区位于远离所述结合物释放垫的末端的一侧；所述检测区距所述结合物释放垫的末端5-8mm；所述质控区距所述检测区4-7mm。
4.根据权利要求3所述的试纸，其特征在于：所述检测区距所述结合物释放垫的末端6mm；所述质控区距所述检测区5mm。
5.根据权利要求1或2所述的试纸，其特征在于：所述结合物释放垫上包被的三聚氰胺特异性抗体的包被密度为0.1-0.2ug/cm2。
6.根据权利要求5所述的试纸，其特征在于：所述结合物释放垫上包被的三聚氰胺特异性抗体的包被密度为0.1ug/cm2。
7.根据权利要求3所述的试纸，其特征在于：所述结合物释放垫上包被的三聚氰胺特异性抗体的包被密度为0.1-0.2ug/cm2。
8.根据权利要求5所述的试纸，其特征在于：所述试纸中包括底板，所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫固定在所述底板上。
9.根据权利要求7所述的试纸，其特征在于：所述试纸中包括底板，所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫固定在所述底板上。
10.一种制备权利要求1-9中任一所述试纸的方法，是将样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫依次连接；所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的三聚氰胺特异性抗体；所述三聚氰胺特异性抗体为三聚氰胺单克隆抗体；所述反应膜上包括检测区和质控区，检测区包被有权利要求1中所述半抗原和载体蛋白的偶联物，质控区包被有抗抗体；
所述样品吸收垫在进行所述连接前，先在如下溶液中浸泡1-3h，再进行干燥：含0.3-0.5％(体积百分含量)鼠血清蛋白、pH值为9.6-10.0、0.1-0.2mol/L的碳酸盐缓冲液；
所述包被有胶体金标记的三聚氰胺特异性抗体的结合物释放垫是按照如下方法制备的：将包被前的结合物释放垫先在如下溶液中浸泡20-40秒，干燥，再进行所述胶体金标记的三聚氰胺特异性抗体包被：含有0.8-1.2％(体积百分含量)牛血清白蛋白、pH值为7.2-7.8、0.1-0.2mol/L硼砂-硼酸缓冲液；
所述三聚氰胺单克隆抗体为由保藏号为CGMCC No.2716的对三聚氰胺药物单克隆杂交瘤细胞株C-3-4分泌产生的抗体。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述样品吸收垫与所述结合物释放垫的连接方式为所述结合物释放垫中有1/3-1/2区域被所述样品吸收垫覆盖；
所述检测区位于近于所述结合物释放垫的末端的一侧，所述质控区位于远离所述结合物释放垫的末端的一侧；所述检测区距所述结合物释放垫的末端5-8mm；所述质控区距所述检测区4-7mm。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述检测区距所述结合物释放垫的末端6mm；所述质控区距所述检测区5mm。
13.一种检测三聚氰胺的方法，是将待检测样品进行前处理，然后用权利要求1-9中任一所述试纸进行检测；所述前处理的方法如下：
当所述样品为牛奶时，样品前处理的方法为：将牛奶与0.05-0.1M磷酸盐缓冲液以1∶15-25的体积比混匀，取样用于检测；
当所述样品为奶粉时，样品前处理的方法为：将每1g奶粉溶于18-25ml、pH为6.0-6.8、0.01-0.02M磷酸盐缓冲液中，超声10-20min，离心，取样用于检测；
当所述样品为饲料时，样品前处理的方法为：将每1g饲料与9-15ml乙腈与盐酸的混合溶液混匀，超声提取10-15min，取1ml上清液，干燥，加入0.5-1.5ml正己烷混匀，再加入1.0-2.0ml 0.01-0.02M磷酸盐缓冲液混匀，离心，取下层水相用于检测；所述乙腈与盐酸的混合溶液中乙腈与0.05-0.1M盐酸的体积比为4-6∶1。
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