CN101183105A - 一种检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒。本发明所提供的三聚氰胺的酶联免疫试剂盒包括三聚氰胺特异性抗体、三聚氰胺与载体蛋白的偶联物、和酶标二抗。本发明的检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒灵敏、快速、准确，主要用于大批样品的筛查；盒中的主要试剂均以工作液的形式提供，使用方便，具有高特异性、高灵敏性、高精确性、高准确性等特点，可快速检测饲料及畜产品中残留的三聚氰胺。

Description

一种检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及酶联免疫和兽药残留检测领域。具体而言，本发明涉及一种用于检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒。

技术背景

三聚氰胺(Melamine)，简称三胺，学名三氨三嗪，别名蜜胺、氰尿酰胺、三聚酰胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料，白色结晶粉末，无味。这种化学品常被用于生产塑料、胶水和阻燃剂，在部分亚洲国家，它也被用以制造化肥。它是一种禁止用于宠物食品及动物饲料的化学物质，动物食用后可以使动物发生肾衰竭并导致死亡。

然而，2007年3月中旬以来，美国发生多起宠物猫、狗中毒死亡事件。经调查，是由于一些宠物饲料供应商为了增加饲料中蛋白质的含量，在小麦蛋白粉和大米蛋白粉中添加了三聚氰胺，从而导致猫、狗中毒死亡。

因此亟需建立方便快捷且敏感度高的检测方法，禁止此类事件的发生。

现有的三聚氰胺检测方法多为色谱法，但是这些方法的灵敏度受样品的净化、浓缩等步骤的影响较大；再者这些方法需要复杂的仪器，且过程繁琐，不适应现场大量样本的筛查。基于抗原抗体免疫反应的免疫学检测技术为小分子残留物的分析检测提供了一个新的途径。该技术研究的关键是半抗原分子的设计、合成和人工全抗原及抗体的制备。

因为三聚氰胺是小分子化合物，本身没有免疫原性，必须将其与大分子载体蛋白偶联得到具有免疫原性的人工抗原。三聚氰胺的ELISA方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒。

本发明提供了一种快速检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括：三聚氰胺特异性抗体、三聚氰胺-载体蛋白偶联物和酶标二抗。其中三聚氰胺特异性抗体为兔抗三聚氰胺的多克隆抗体，可用三聚氰胺与载体蛋白偶联物作为免疫原通过免疫动物(例如兔)制得。所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或钥孔铜兰蛋白(KLH)。所述的三聚氰胺-载体蛋白偶联物采用化学方法偶联得到。所述酶标二抗的标记酶为辣根过氧化物酶，所述酶标二抗可以用商品化的辣根过氧化物酶酶标二抗，也可以通过过碘酸钠法或戊二醛法将辣根过氧化物酶与二抗偶联制得。在本发明的一个优选实施方案中，所述酶标二抗为羊抗兔IgG抗体。

用于制备所述酶标板的固相材料，包括但不限于，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯。载体的形式是微量反应板凹孔。

为方便现场检测和大量样本筛查，所述试剂盒还可以进一步包括三聚氰胺抗原或抗三聚氰胺特异性抗体的酶标板、三聚氰胺标准溶液、显色剂、洗涤液、终止液和浓缩样品稀释液。

所述的洗涤液为0.05％-0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液。所述的显色剂由显色剂A液和显色剂B液组成(例如，体积比为1∶1)，显色剂A液为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺。所述的浓缩样品稀释液为含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液。

另一方面，本发明还提供了一种检饲料测样品中三聚氰胺含量的方法，包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用权利要求1-9任一所述的试剂盒进行检测，向包被有三聚氰胺抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入抗三聚氰胺多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终上，用酶标仪测定吸光度值；

(3)分析检测结果。

本发明试剂盒的检测原理为：

将三聚氰胺抗原吸附于固相载体上，加入样本或三聚氰胺标准品溶液并加入三聚氰胺抗体工作液，待测样品中三聚氰胺和固相载体上包被的三聚氰胺抗原竞争三聚氰胺抗体，再加入酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中三聚氰胺的量呈负相关，与标准曲线比较即可得出三聚氰胺浓度范围。

有益效果：

本发明检测三聚氰胺的试剂盒主要采用间接竞争酶联免疫测定法定性或定量样品中三聚氰胺含量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批样品。

本发明该试剂盒采用高特异性的三聚氰胺多克隆抗体，主要试剂以工作液形式提供，可以减少试剂盒的操作步骤，为使用者节省时间并降低因操作步骤冗繁造成的误差，本发明具有灵敏度高、特异性强、高精确度、高准确度、对仪器设备要求低、试剂保存时间长、自动化程度高、无放射性同位素污染的等优点，可在饲料及动物源性产品检测中发挥重要作用。

附图说明

图1为三聚氰胺酶联免疫检测试剂盒结构示意图。其中1为试剂盒盒体，2为包被了三聚氰胺抗原或抗三聚氰胺特异性抗体的酶标板，3为系列标准溶液，4为显色剂A，5为显色剂B，6为抗体溶液，7为酶标二抗溶液，8为酶标二抗稀释液，9为浓缩洗涤液，10为浓缩样品稀释液，11为试剂瓶架。

图2为三聚氰胺抑制曲线。

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何限制。

                 实施例1免疫原的合成及免疫血清的制备

1.1试剂与仪器

三聚氰胺(北京百灵威试剂有限公司)，琥珀酸酐(购自北京耀北生物技术有限公司)，吡啶(Pyridine，AR.WM＝79.10，含量＞99.5％，天津市科密欧化学试剂开发中心)，N，N-二甲基甲酰胺(Dimethylformamide，DMF，美国新泽西州ACROSORGANICS公司生产，购自百灵威化学试剂公司)，正三丁胺(Tributylamine，美国新泽西州ACROSORGANICS公司生产，购自百灵威化学试剂公司)，氯甲酸异丁酯购(自百灵威化学试剂公司)，牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等(购自北京耀北生物技术有限公司)，其它试剂均为分析纯。

双光束紫外可见分光光度仪(TU-1909，北京普析通用仪器有限公司)，层析装置(3057型便携式记录仪，重庆川仪四厂；SBS系列数控计滴器，恒流泵，自动部分收集器，层析柱，上海沪西分析仪器厂)，磁力搅拌器(上海东荣丰科学仪器有限公司)，台式离心机(Minispin最大转速13400rpm最大离心力12100rcf，2ml×12)，

1.2三聚氰胺人工抗原的合成

称取三聚氰胺63.06mg(0.5mmol)溶于5ml吡啶溶液中，加入琥珀酸酐50mg室温搅拌反应过夜。

吹干吡啶，用10ml溶剂(DMF和1，4-二恶烷1∶1混合)溶解Rac-戊二酸酐半醛，加入131μl(约0.5mmol)三丁胺，冰中搅拌10min，加入氯甲酸异丁酯72μl(约0.5mmol)，转入室温搅拌反应1小时。活化的三聚氰胺溶液逐滴加入到0.1M pH 8.5冰冷载体蛋白(BSA或OVA)硼酸钠溶液中，1小时内加完，室温搅拌反应过夜。

然后，将偶联物过SephadexG-25M凝胶层析纯化，用0.01M pH 7.4PBS三倍柱床体积平衡，调节流速至3ml/min，样品浓缩至5ml加入到平衡好的层析柱中层析提纯偶联物，洗脱液用pH 7.40.01M PBS。

免疫及特异性抗体的制备

将上述三聚氰胺-BSA偶联物用生理盐水稀释成1mg/ml溶液备用。

选取6只体重2～2.5Kg健康雄性新西兰大白兔。将偶联物与等量弗氏完全佐剂通过注射器对抽法混合成油包水的乳浊液，按1mg/Kg体重的量进行首次免疫，采取背部皮下多点注射。每隔两周加强免疫一次，用弗氏不完全佐剂代替弗氏完全佐剂，剂量及方法同首次免疫。从第三次免疫开始，每次免疫后10天，耳缘静脉取血1ml，进行抗体效价检测，当抗体效价不再升高时，不加佐剂进行最后一次(第7次)免疫，大腿肌肉注射，7天后颈动脉放血，室温凝固2h后4℃过夜，8000r/min离心10分钟，除去血块，血清部分用50％饱和硫酸铵溶液沉淀，离心去上清液，沉淀用磷酸盐缓冲液重悬，再用33％饱和硫酸铵溶液沉淀两次，沉淀物用尽可能少的磷酸缓冲液溶解，经透析后用SephadexG-25M层析，即得多克隆抗体。

                       实施例2免疫检测方法的建立

2.1ELISA方法确定最佳包被浓度

将1000μg/ml、100μg/ml、10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.25μg/ml系列浓度的卵清蛋白(OVA)-三聚氰胺偶联物按每孔100μl包被酶标板，4℃包被24h，洗涤5次，拍干，按每孔200μl封闭液4℃下封闭12h，洗涤3次，拍干。加入1∶500稀释的抗血清100μl，室温作用2h，洗涤三次，立即加入100μl酶标羊抗兔抗体，室温作用30min，洗涤三次，加100μl底物液，室温避光作用15min，50μl终止液终止反应，酶标仪检测A值(450nm)。同时设置空白对照孔(不加抗血清，只加其稀释液)和平行重复孔，取OD值为1.0左右时的包被浓度为最佳浓度。试验数据列于表1。

表1不同包被浓度的OD值

包被浓度μg/ml	1000	100	10	5	2.5	1	0.25	空白
									OD值	1.995	1.766	1.726	1.505	1.221	1.056	0.736	0.052

由表1的数据中可以确定，最佳包被浓度为1μg/ml。

2.2间接ELISA检测抗体效价

以1μg/ml浓度包被酶标板，从800倍开始倍比稀释抗血清，按2.1的ELISA步骤操作。以两倍于阴性血清OD值的抗血清OD值对应的抗血清稀释度为抗血清效价。抗血清效价检测结果见表2。

表2抗血清效价检测结果

稀释倍数	800	1600	3200	6400	12800	25600	阴性血清	空白
									OD值	1.184	0.908	0.694	0.475	0.339	0.149	0.157	0.048

从表2的数据可以确定本发明制备的抗血清的效价在10000以上。

2.3间接竞争ELISA检测抗体特异性

ELISA操作方法同2.1。不同的是每孔加入50μl不同浓度的游离三聚氰胺与卵清蛋白(OVA)-三聚氰胺偶联物竞争抗体，随后加入抗血清，得出不同的OD值。根据2.1的结果，所用抗血清最佳浓度为1∶500。三聚氰胺系列浓度和试验孔的排列顺序见表3，同时设置平行重复孔和空白对照孔。以0抑制孔的OD值为最大值B₀，其它抑制浓度孔OD值为B，B/B₀＝50％时对应的三聚氰胺浓度为此抗体的IC₅₀值。抗体的特异性检测结果的数据列于表3。

表3抗血清特异性检测结果

三聚氰胺的抑制浓度(ng/ml)	0	0.3	1.25	5	25	100
							OD值	1.21	1.253	1.126	0.836	0.423	0.154

由表3中数据可知，三聚氰胺抗血清IC₅₀值在15ng/ml左右，表明本发明制备的抗血清是具有较好的特异性的抗三聚氰胺多克隆抗体。

              实施例3检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒的组建

3.1组建检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

(1)包被三聚氰胺抗原的酶标板；

(2)蛋白浓度为1mg/L的抗三聚氰胺多克隆抗体；

(3)用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体；

(4)三聚氰胺标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L；

(5)底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液为四甲基联苯胺；

(6)洗涤液为含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液；

(7)浓缩样品稀释液为0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液；

(8)终止液为2mol/L的盐酸溶液。

3.2组建检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

(1)包被羊抗兔抗抗体的酶标板；

(2)蛋白浓度为5mg/L的抗三聚氰胺多克隆抗体；

(3)用辣根过氧化物酶标记的三聚氰胺；

(4)三聚氰胺标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、50μg/L、100μg/L；

(5)底物显色液A液为过氧化氢，底物显色液B液为邻苯二胺；

[6)洗涤液为0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液；

(7)浓缩样品稀释液为0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液；

(8)终止液为2mol/L的盐酸溶液。

                   实施例4样品中三聚氰胺残留的检测

4.1样品前处理

准确称取5g饲料于40ml离心管中。加入20ml样品稀释液(0.01％吐温-20的磷酸盐缓冲液)，加热至60℃，充分振荡10分钟，4000rpm离心10min，取上清5ml。

4.2用试剂盒进行检测

向三聚氰胺-OVA偶联物包被的酶标板微孔中加系列标准品或样品溶液50μl，再加入抗体工作液(1mg/L的抗三聚氰胺多克隆抗体)50μl，室温反应1小时。倒出孔中液体，每孔加入250μl经10倍稀释了的洗涤液，30秒后倒出孔中液体，如此重复操作共洗板3次，用吸水纸拍干。每孔加入酶标记抗抗体100μl，避光室温孵育30min。底物显色液A液(过氧化脲)50μl，再加B液(四甲基联苯胺)50μl，轻轻振荡混匀，室温避光显色15min，每孔加入终止液(2mol/L盐酸)50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD值)。

4.3结果分析

计算百分吸光度值并绘制标准曲线，相对应每一个样品中三聚氰胺的浓度可以从标准曲线上读出，也可以用回归方程法计算出在样本中三聚氰胺的含量。利用专业电脑软件更便于大量的样本的快速分析。根据酶标板上的样本颜色的深浅与系列浓度标准溶液颜色的比较，可以判断出样本中三聚氰胺的浓度范围。

                          实验例1试剂盒精密度试验

本实验例为标准可重复性试验。具体操作为：

从每批实施例2或3中的方法制备的酶标板中，各抽取10个孔，测定4.5μg/L的标准溶液的吸光度值(OD)，重复3次，计算变异系数CV％。

结果表明变异系数范围在4.8-7.6％之间，符合了变异系数小于20％的规定，说明本试剂盒标准品精密度达到了要求。

                          实验例2试剂盒的回收率试验

取两个浓度的三聚氰胺标样，对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算回收率。结果表明饲料中的添加回收率为60％-85％。

实验例3试剂盒保存期试验

试剂盒保存条件为2-8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零添加)、50％抑制浓度、三聚氰胺添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置两周，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2-8℃保存12个月以上。

Claims (10)

1.一种检测三聚氰胺的酶联免疫试剂盒，其中包括：三聚氰胺特异性抗体、三聚氰胺-载体蛋白偶联物和酶标二抗。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括包被了三聚氰胺抗原或抗三聚氰胺特异性抗体的酶标板、三聚氰胺标准溶液、底物显色剂、洗涤液、终止液和浓缩样品稀释液。

3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述三聚氰胺特异性抗体为多克隆抗体。

4.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白或钥孔铜兰蛋白(KLH)。

5.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶标二抗的酶为辣根过氧化物酶。

6.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶标二抗为羊抗兔IgG抗体。

7.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的洗涤液为含有0.05％-0.5％吐温-20磷酸盐缓冲液。

8.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的显色剂由显色剂A和显色剂B组成，显色剂A为过氧化氢或过氧化脲，显色剂B为邻苯二胺或四甲基联苯胺。

9.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的浓缩样品稀释液为含0.1％吐温-20的磷酸盐缓冲液。

10.一种检测样品中三聚氰胺含量的方法，包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用权利要求1-9任一所述的试剂盒进行检测，向包被有三聚氰胺抗原的酶标板孔中加入标准品或样品溶液，再加入抗三聚氰胺多克隆抗体，孵育后洗涤拍干，加入酶标记二抗，孵育后洗涤拍干，显色、终上，用酶标仪测定吸光度值；

(3)分析检测结果。

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