CN101776685A

CN101776685A - 检测三甲氧苄胺嘧啶药物的酶联免疫试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN101776685A
Application number: CN200910237823A
Authority: CN
Inventors: 何方洋; 万宇平; 冯才伟; 赵正苗; 汪善良; 冯才茂; 陈伟玲; 刘平; 崔海峰; 冯静; 刘玉梅; 郝士元; 杨昌松; 段盈盈
Original assignee: Beijing Kwinbon Biotechnology Co Ltd; Beijing Wanger Kangtai Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Guizhou Kwinbon Science And Technology For Food Safety Co ltd
Priority date: 2009-11-11
Filing date: 2009-11-11
Publication date: 2010-07-14
Anticipated expiration: 2029-11-11
Also published as: CN101776685B

Abstract

本发明提供了一种检测三甲氧苄胺嘧啶药物的酶联免疫试剂盒，它含有：包被有包被抗原的酶标板，酶标记物，三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体工作液(当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时含有)，三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液，复溶液。本发明还公开了一种应用上述酶联免疫试剂盒检测三甲氧苄胺嘧啶的方法，它包括：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的酶联免疫试剂盒可用于检测蜂蜜样品中三甲氧苄胺嘧啶的残留量，其操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本的筛查。

Description

检测三甲氧苄胺嘧啶药物的酶联免疫试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术，具体涉及一种用于检测三甲氧苄胺嘧啶药物的酶联免疫试剂盒，其特别适于蜂蜜中三甲氧苄胺嘧啶药物残留的检测。

技术背景

三甲氧苄胺嘧啶(trimethoprim，TMP)是一种抗菌剂，结构式见图1，抗菌范围与磺胺药相似，与磺胺药物联合使用时，可增强疗效几倍到几十倍。因此是种常用的磺胺增效剂，其对多种革兰阳性和阴性细菌有效。但在动物性食品中为限用药物。

三甲氧苄胺嘧啶残留量的常规检测方法主要有高效液相色谱(HPLC)、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)等，由于复杂的仪器设备和繁琐的过程以及对检验人员的高技能要求，不适合现场监控和大量样本的筛查。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种用于三甲氧苄胺嘧啶检测的酶联免疫试剂盒，其操作简单适合现场大批量样品的筛选。

本发明试剂盒，它含有：

(1)包被有包被原的酶标板(包被原为抗原、抗体或抗抗体)；

(2)酶标记物(为酶标记半抗原、酶标记抗体或酶标记抗抗体)；

(3)三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体工作液(当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时含有)；

(4)三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液；

(5)底物显色液；

(6)终止液；

(7)浓缩洗涤液；

(8)复溶液。

本发明所提供的检测三甲氧苄胺嘧啶的酶联免疫试剂盒，包括三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体工作液及预包被包被原的酶标板和酶标记物工作液；所述酶标记物为酶标记的抗抗体，酶标记三甲氧苄胺嘧啶半抗原或酶标记三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体；所述抗抗体为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体。

所述三甲氧苄胺嘧啶半抗原是三甲氧苄胺嘧啶通过琥珀酸酐法得到的。

所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶，其中优选辣根过氧化物酶；酶标记的羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与抗抗体进行偶联得到的；酶标记三甲氧苄胺嘧啶半抗原是采用混合酸酐或碳化二亚胺法将标记酶与三甲氧苄胺嘧啶半抗原偶联得到的；酶标记特异性抗体是采用戊二醛法或过碘酸钠法将标记酶与特异性抗体偶联得到的，辣根过氧化物酶可采用现有技术中的多种方法将其与抗抗体进行偶联，如戊二醛法，过碘酸钠法等，本发明经过长期的劳动创造将过碘酸钠法进行了改良，使其省时、降低辣根过氧化物酶(HRP)与抗抗体的浓度比率，节省了原材料。

所述三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体可为三甲氧苄胺嘧啶单克隆抗体或三甲氧苄胺嘧啶多克隆抗体；它们均是用三甲氧苄胺嘧啶半抗原与载体蛋白采用混合酸酐法或碳化二亚胺法得到的偶联物作为免疫原得到的；所述三甲氧苄胺嘧啶多克隆抗体可为鼠源、马源、羊源、兔源或豚鼠源抗体，所述三甲氧苄胺嘧啶单克隆抗体优选为三甲氧苄胺嘧啶鼠单克隆抗体，所述三甲氧苄胺嘧啶多克隆抗体优选为三甲氧苄胺嘧啶兔多克隆抗体。

所述三甲氧苄胺嘧啶单克隆抗体优选为三甲氧苄胺嘧啶的单克隆杂交瘤细胞株D-1-3CGMCC No.3358分泌的单克隆抗体。

所述三甲氧苄胺嘧啶单克隆杂交瘤细胞株D-1-3CGMCC No.3358(分类命名：对三甲氧苄胺嘧啶药物的单克隆抗体杂交瘤细胞株)已于2009年10月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)。

以上抗体均可以用三甲氧苄胺嘧啶半抗原与载体蛋白的偶联物作为免疫原制备。所述载体蛋白可为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白(BCG)、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白和纤维蛋白原等常用载体蛋白；所述三甲氧苄胺嘧啶半抗原与载体蛋白的偶联物可通过将三甲氧苄胺嘧啶半抗原和载体蛋白用混合酸酐法或碳化二亚胺法进行偶联得到。

为了更方便现场监控和大量样本筛查，所述试剂盒还包括三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液、显色剂、终止液、浓缩洗涤液、复溶液。

所述浓缩洗涤液优选为0.8-1.2％吐温-20和0.05-0.01‰叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

当标记酶为辣根过氧化物酶时，显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，所述显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶为碱性磷酸酯酶时，显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为1～2mol/L氢氧化钠溶液。

所述浓缩复溶液液优选为含有5-10％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

其中酶标板在制备过程中所用的包被缓冲液为pH值为7.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲液，所用封闭液为pH值为7.2，含有0.03-0.05‰硫柳汞防腐剂，8-12％卵清蛋白的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

本发明中酶标板的制备过程为：用包被缓冲液将包被原稀释成0.15～0.25μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h或4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入150～200μl封闭液，37℃温育1～2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存。

本发明中抗原的合成过程为：

1.半抗原的合成

将三甲氧苄胺嘧啶采用琥珀酸酐法得到，技术路线如图2。

2.三甲氧苄胺嘧啶抗体的制备

将三甲氧苄胺嘧啶半抗原与载体蛋白采用碳化二亚胺法进行偶联得到免疫原。

免疫原的具体制备方法：三甲氧苄胺嘧啶是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。因此将三甲氧苄胺嘧啶通过琥珀酸酐法合成三甲氧苄胺嘧啶半抗原，这样突出了三甲氧苄胺嘧啶分子结构中的特征基团，使制备的三甲氧苄胺嘧啶抗体对三甲氧苄胺嘧啶的特异性很高。

三甲氧苄胺嘧啶鼠单克隆抗体的制备

动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以三甲氧苄胺嘧啶半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原，得到较好的多抗血清后，取出脾脏进行细胞融合。

细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选细胞株，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

三甲氧苄胺嘧啶兔多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以三甲氧苄胺嘧啶半抗原与载体蛋白偶联物为免疫原对新西兰大白兔进行免疫，多次免疫后测定血清抗体效价得到多克隆抗体。

本发明抗抗体的制备过程：羊抗鼠抗抗体是以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病菌体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；羊抗兔抗抗体是以羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病菌体羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。

本发明所述试剂盒中三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液：标准品溶液6瓶，0μg/L、2μg/L，6μg/L，18μg/L，54μg/L，162μg/L。

本发明的检测原理为：

当在微孔条上预包被三甲氧苄胺嘧啶偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体溶液，样本中残留的三甲氧苄胺嘧啶药物与酶标板上包被的三甲氧苄胺嘧啶偶联抗原竞争三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体，加入酶标记抗抗体进行放大作用，用显色液显色，样本吸光值与三甲氧苄胺嘧啶药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中三甲氧苄胺嘧啶的残留量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中三甲氧苄胺嘧啶残留量的浓度范围。

当在微孔条上预包被三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记三甲氧苄胺嘧啶半抗原溶液，样本中残留的三甲氧苄胺嘧啶药物与酶标记抗原竞争包被在酶标板上的三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与三甲氧苄胺嘧啶药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中三甲氧苄胺嘧啶的残留含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中三甲氧苄胺嘧啶残留量的浓度范围。

当在微孔条上预包被三甲氧苄胺嘧啶偶联抗原时，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体溶液，样本中残留的三甲氧苄胺嘧啶药物与酶标板上包被的三甲氧苄胺嘧啶偶联抗原竞争三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与三甲氧苄胺嘧啶药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中三甲氧苄胺嘧啶的残留含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中三甲氧苄胺嘧啶残留量的浓度范围。

当在微孔条上预包被抗抗体时，加入三甲氧苄胺嘧啶抗体孵育后，加入样本溶液或标准品溶液后，再加入酶标记三甲氧苄胺嘧啶偶联抗原溶液，样本中残留的三甲氧苄胺嘧啶药物与酶标记三甲氧苄胺嘧啶偶联抗原竞争三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体，用显色液显色，样本吸光值与三甲氧苄胺嘧啶药物的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样本中三甲氧苄胺嘧啶的残留含量。同时根据酶标板上颜色的深浅，与系列浓度的三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液颜色的比较可粗略判断样品中三甲氧苄胺嘧啶残留量的浓度范围。

本发明还提供了一种应用上述酶联免疫试剂盒监测三甲氧苄胺嘧啶药物的方法，它包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。

样品的前处理主要是为了从样品中获得三甲氧苄胺嘧啶溶液，从而用于后续的检测。下面是常见的几种样品的前处理方法：

称取蜂蜜样本3.0±0.05g至50ml聚苯乙烯离心管中，加入pH6.0磷酸盐缓冲液3ml，涡动5min至充分溶解，加入碱性氧化铝2.0g，涡动10s，加入三氯甲烷6ml，振荡5min，3000g以上离心5min；取上清液3ml至另一聚苯乙烯离心管，加入pH10.6碳酸盐缓冲溶液0.75ml，涡动5s，加入乙酸乙酯4ml，正己烷4ml，振荡5min，3000g以上离心5min；取上层有机相4ml至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，涡动30s溶解干燥残留物，加入复溶工作液0.45ml，涡动2min，3000g以上离心5min；除去上层正己烷相，取下层水相50μl用于分析。

本发明中用试剂盒检测时：当包被原为三甲氧苄胺嘧啶偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入抗体，温育后洗涤拍干，再加入酶标抗抗体，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为三甲氧苄胺嘧啶偶联抗原时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记抗体，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样本溶液再加入酶标记三甲氧苄胺嘧啶半抗原，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值；当包被原为抗抗体时，向酶标板微孔中加入三甲氧苄胺嘧啶抗体，温育后洗涤拍干，再加入标准品溶液或样品溶液后加入酶标三甲氧苄胺嘧啶半抗原，温育后洗涤拍干，显色、终止，用酶标仪测定吸光度值。

本发明中检测结果分析过程为：用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准溶液(0标准)的吸光度值(B₀)再乘以100％，即百分吸光度值。计算公式为：

百分吸光度值(％)＝(B/B₀)×100％

以三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液的浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度则可从标准曲线上读出样本中三甲氧苄胺嘧啶的残留量。

本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。

本发明中检测结果的分析还可以利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需75分钟可以完成。

本发明检测三甲氧苄胺嘧啶的酶联免疫试剂盒主要采用间接竞争ELISA方法定性或定量检测样品中三甲氧苄胺嘧啶的残留量；对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单，能同时快速检测大批量样品；采用高特异性的三甲氧苄胺嘧啶单克隆抗体，主要试剂以工作液的形式提供，检验方法方便易行，具有特异性高、灵敏度高、精确度高、准确度高等特点。本发明的酶联免疫试剂盒，结构简单、使用方便、价格便宜、携带便利、检测方法高效、准确、简便、适于大批量样品筛选的定性、定量。本发明的试剂盒将在三甲氧苄胺嘧啶的检测中发挥重要作用。

附图说明

图1：三甲氧苄胺嘧啶化学结构通式；

图2：三甲氧苄胺嘧啶半抗原合成技术路线；

图3：三甲氧苄胺嘧啶偶联物为包被原、酶标抗抗体为酶标记物的试剂盒的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。

实施例1试剂盒组分的制备

1.抗原的合成

a.半抗原的合成

将三甲氧苄胺嘧啶采用琥珀酸酐法得到具有羧基官能团的半抗原。

半抗原的具体步骤：

1)取0.5g的三甲氧苄胺嘧啶和0.24g的琥珀酸酐用15ml吡啶溶解，

2)磁力加热搅拌器加热搅拌，70℃反应24h。

3)用旋转蒸发仪旋蒸液体，加丙酮15ml溶解后，旋蒸干，重复3次。

4)过硅胶柱，展开剂为甲醇∶己酸己酯＝1∶1，收集极性比原料增大的点，旋蒸干即为半抗原。

b.免疫原合成

1)将10mg三甲氧苄胺嘧啶半抗原，10mg NHS，以及12.5mg EDC充分溶解于1mL DMF中，于室温下搅拌24h，即可得到反应液A。

2)称取BSA 50mg，使之充分溶解在3mL PBS(PH7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到该BSA溶液中，并于室温下搅拌24h，

3)用0.01mol/L PBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质。以12000rpm离心30min，，分装，收集上清，得到免疫原，置于-20℃保存备用。

c.包被原三甲氧苄胺嘧啶偶联抗原的制备

将三甲氧苄胺嘧啶半抗原与卵清蛋白偶联得到包被原。

包被原的制备过程：

1)将10mg三甲氧苄胺嘧啶半抗原用0.5mL DMF溶解，冷却至10℃，加入氯甲酸异丁酯5ul，10℃搅拌反应30min，即可得到反应液A。

2)称取OVA 36mg，使之充分溶解在2mL 50mmol/L碳酸钠溶液中，将反应液A逐滴缓慢滴加到该溶液中。

3)10℃反应4h，然后4℃过夜。

4)用0.01mol/lPBS透析3d，每天换2次透析液，以除去未反应的小分子物质。以12000rpm离心30min，收集上清，分装，得包被原，于-20℃保存备用。

单克隆抗体的制备

a.动物免疫

将免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为100μg/只，使其产生多克隆抗体血清。

b.细胞融合和克隆化

小鼠血清测定结果较高后，取其脾细胞，按7∶1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

经筛选得到三甲氧苄胺嘧啶的单克隆杂交瘤细胞株D-1-3CGMCC No.3358。三甲氧苄胺嘧啶的单克隆杂交瘤细胞株可以无限量的产生三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体，且该抗体特异性是针对三甲氧苄胺嘧啶的，针对蜂蜜样品中三甲氧苄胺检测限可达到1μg/L。

c.细胞冻存和复苏

将三甲氧苄胺嘧啶的单克隆杂交瘤细胞株用冻存液制成1×10⁹个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

d.单克隆抗体的生产与纯化

将Balb/c小鼠腹腔注入灭菌石蜡油0.5ml/只，7天后腹腔注射三甲氧苄胺嘧啶的单克隆杂交瘤细胞株5×10⁷个/只，7天后采集腹水。用辛酸-饱和硫酸铵法进行腹水纯化，-20℃保存。

2.多克隆抗体的制备

采用新西兰大白兔作为免疫动物，以三甲氧苄胺嘧啶与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为1.5mg/kg，首免时将免疫原与等量的弗氏完全佐混合制成乳化剂，颈背部皮下多点注射，间隔3～4周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，加强免疫一次，共免疫5次，最后一次不加佐剂。最后一次免疫10天后采血，测定血清抗体效价，心脏采血，用硫酸铵分级沉淀得到纯化的多克隆抗体。

3.羊抗鼠抗抗体的制备过程：以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体；羊抗兔抗抗体的制备：以羊作为免疫动物，以兔源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗兔抗抗体。

4.酶标板的制备

用包被缓冲液将三甲氧苄胺嘧啶偶联抗原、抗体或抗抗体稀释成0.20μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2h，倾去包被液，用稀释20倍的浓缩洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后再每孔中加入200μl封闭液，37℃温育2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

5.酶标记羊抗鼠抗抗体的置备

将抗抗体与辣根过氧化物酶(HRP)采用改良后的过碘酸钠法进行偶联。传统的过碘酸钠法要求反映体系中酶与抗抗体的摩尔浓度比为4∶1；由于辣根过氧化物酶在强氧化的作用下产生许多与抗抗体结合的位点，这样活化的辣根过氧化物酶分子充当了连接各分子的桥梁，降低了酶标记物的酶活性，使制备的偶联物中混有许多聚合体，为了解决这个问题，我们将传统的方法进行了改良，即：

1)省去了氨基的封闭过程，因为能产生自身氨基连接的氨基实际很少。

2)降低了辣根过氧化物酶：抗抗体的摩尔浓度比率至2∶1，改良后的方法

比传统的方法简便，对酶的活性的损失减少。

实施例2检测三甲氧苄胺嘧啶的酶联免疫试剂盒的组建

组建检测三甲氧苄胺嘧啶的酶联免疫试剂盒，使其包含下述组分：

(1)包被三甲氧苄胺嘧啶偶联抗原的酶标板；

(2)用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体；

(3)三甲氧苄胺嘧啶单克隆抗体工作液；

(4)三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/L、2μg/L、6μg/L、18μg/L、54μg/L、162μg/L；

(5)底物显色液由A液和B液组成，底物显色液A液为过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺；

(6)终止液为2mol/L盐酸；

(7)浓缩洗涤液为0.8-1.2％吐温-20和0.05-0.01‰叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

(8)浓缩复溶液为含有5-10％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

实施例3样品中三甲氧苄胺嘧啶的检测

1.样品前处理

称取蜂蜜样本3.0±0.05g至50ml聚苯乙烯离心管中，加入pH6.0磷酸盐缓冲液3ml，涡动5min至充分溶解，加入碱性氧化铝2.0g，涡动10s，加入三氯甲烷6ml，振荡5min，3000g以上离心5min；取上清液3ml至另一聚苯乙烯离心管，加入pH 10.6碳酸盐缓冲溶液0.75ml，涡动5s，加入乙酸乙酯4ml，正己烷4ml，振荡5min，3000g以上离心5min；取上层有机相4ml至10ml干净的玻璃试管中，于50～60℃水浴氮气流下吹干；加入1ml正己烷，涡动30s溶解干燥残留物，加入复溶工作液0.45ml，涡动2min，3000g以上离心5min；除去上层正己烷相，取下层水相50μl用于分析。

2.用试剂盒检测

向包被有三甲氧苄胺嘧啶偶联抗原的酶标板微孔中加入三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液或样品溶液50μl，再加入三甲氧苄胺嘧啶单克隆抗体工作液50μl，用盖板模封板，25℃恒温箱中反应30min，倒出孔内液体，每孔加入250μl洗涤液，30s后倒出孔内液体，如此重复操作共洗板5次，用吸水纸拍干。加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗抗体工作液100μl，25℃恒温箱中反应30min，倒出孔内液体，重复洗板步骤，每孔加入底物显色液A液过氧化脲，底物显色液B液四甲基联苯胺(TMB)，轻轻振荡混匀，25℃恒温箱避光显色15min，每孔加入2mol/L终止液盐酸50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。

3.检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品溶液(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以三甲氧苄胺嘧啶标准品浓度(μg/L)的半对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图，见图3。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出三甲氧苄胺嘧啶的残留量。

实验例1标准品精密度试验：

分别从三个不同的时间段制备的酶标板中各抽出一批酶标板，每批各抽取10个试剂盒，每板各抽出20个微孔，测定18μg/L标准溶液的吸光度值，计算变异系数。

表1标准可重复性试验(CV％)

通过上述试验结果可以得出，每批试剂盒各10次标准品变异系数在4.5％-13.2％之间，符合精密度小于或等于25％的规定。

实验例2样本精密度和准确度试验

1.样品精密度试验：

以5μg/L浓度的三甲氧苄胺嘧啶对蜂蜜进行添加测定，分别取三个不同批次的试剂盒各五个，每个浓度重复5次，分别计算变异系数，结果见表2。

表2蜂蜜样本可重复性试验

结果表明蜂蜜样本的变异系数均在4.2％-9.4％之间，符合了《农业部文件》农医发【2005】17号附件2试剂盒备案参考评判标准中第四点精密度标准。

b.样本准确度试验

取两个浓度的三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液分别为10μg/kg、20μg/kg，分别对样品进行添加回收试验，每个浓度做4个平行，分别计算准确度。

表5试剂盒的准确度

结果表明蜂蜜样本添加回收率在84.0％-95.6％之间。

实验例3交叉反应率试验：

选择与三甲氧苄胺嘧啶有类似结构和类似功能的药物测定交叉反应率，通过各种药物的标准曲线分别得到其50％抑制浓度。用下式计算试剂盒对其它药物的交叉反应率。交叉反应率越大，那么此试剂盒对三甲氧苄胺嘧啶的检测的特异性就越好。

交叉反应率(％)＝(引起50％抑制三甲氧苄胺嘧啶的浓度/引起50％抑制的类似物浓度)×100％

表6试剂盒的特异性

实验例4

试剂盒保存条件为2～8℃，经过6个月的测定，试剂盒的最大吸光度值(零标准)、50％抑制浓度、三甲氧苄胺嘧啶添加实际测定值均在正常范围之内。考虑在运输和使用过程中，会有非正常保存条件出现，将试剂盒在37℃保存条件下放置6天，进行加速老化实验，结果表明该试剂盒各项指标完全符合要求。考虑到试剂盒冷冻情况发生，将试剂盒放入-20℃冰箱冷冻5天，测定结果也表明试剂盒各项指标完全正常。从以上结果可得出试剂盒可以在2～8℃至少可以保存6个月以上。

Claims

1.一种检测三甲氧苄胺嘧啶药物的酶联免疫试剂盒，其特征在于它含有：

(1)包被有包被原的酶标板；

(2)酶标记物；

(3)三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液；

(4)底物显色液；

(5)终止液；

(6)浓缩洗涤液；

(7)复溶液，

所述包被原为三甲氧苄胺嘧啶抗原、抗体或抗抗体，所述酶标记物为酶标记三甲氧苄胺嘧啶抗原、酶标记三甲氧苄胺嘧啶抗体或酶标记抗抗体，

当酶标板上包被抗原且酶标记物为酶标记抗抗体或酶标板上包被抗抗体且酶标记物为酶标记抗原时还含有三甲氧苄胺嘧啶特异性抗体工作液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述三甲氧苄胺嘧啶抗原是由三甲氧苄胺嘧啶半抗原与载体蛋白偶联得到，所述三甲氧苄胺嘧啶抗体是由所述偶联抗原制备获得，其中所述三甲氧苄胺嘧啶半抗原为三甲氧苄胺嘧啶-琥珀酸酐。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述三甲氧苄胺嘧啶抗体为单克隆抗体。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述三甲氧苄胺嘧啶抗体由杂交瘤细胞株D-1-3CGMCC No.3358分泌产生。

5.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述载体蛋白为鼠血清蛋白、甲状腺蛋白、牛血清蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白或纤维蛋白原。

6.如权利要求书1或2所述的试剂盒，其特征在于所用包被缓冲液为pH值为7.0，0.1mol/L磷酸盐缓冲液，所用封闭液为pH值为7.2，含有0.03-0.05‰硫柳汞防腐剂，8-12％卵清蛋白的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。

7.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记物的标记酶为辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶，当标记酶为辣根过氧化物酶时，底物显色液A液为过氧化氢或过氧化脲，底物显色液B液为邻苯二胺或四甲基联苯胺，终止液为1～2mol/L的硫酸或盐酸缓冲液；当标记酶标记酶为细菌提取碱性磷酸酯酶时，底物显色液为对硝基磷酸盐缓冲液、终止液为1～2mol/L氢氧化钠。

8.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：浓缩洗涤液为0.8-1.2％吐温-20和0.05-0.01‰叠氮化钠防腐剂的磷酸盐缓冲液；浓缩复溶液为含有5-10％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液，三甲氧苄胺嘧啶标准品溶液的浓度分别为0μg/L，2μg/L，6μg/L，18μg/L，54μg/L，162μg/L，所述百分比为重量体积百分比。

9.权利要求1～8任一项所述的试剂盒在检测三甲氧苄胺嘧啶药物残留中的应用。

10.一种检测样品三甲氧苄胺嘧啶药物残留的方法，包括步骤：

(1)样品前处理；

(2)用权利要求1-8任一项所述的试剂盒进行检测；

(3)分析检测结果。